NanoDrop quantificação Microvolume de Ácidos Nucléicos

O sistema de retenção de amostras NanoDrop é uma tecnologia inovadora que utiliza a tensão superficial inerente dos líquidos para segurar e medir amostras de volume micrométrico entre dois pedestais ópticos, sem o uso de QTS ou capilares. Tão pouco quanto um microlitro de amostra é pipetado diretamente sobre a superfície óptica inferior. Ao fechar o braço do espectrômetro, forma-se uma coluna líquida entre os pedestais ópticos superior e inferior.

Devido à tensão superficial que forma um caminho óptico vertical, o comprimento do caminho vertical pode mudar automaticamente em tempo real durante a medição. A redução do comprimento do caminho permite a medição de concentrações mais altas, eliminando efetivamente a necessidade de realizar diluições na maioria das amostras de ácidos nucleicos. Além disso, o sistema de retenção de amostra acelera o processo experimental com uma limpeza rápida, que consiste simplesmente em limpar as superfícies ópticas com um lenço laboratorial.

Hoje demonstraremos dois procedimentos para determinar a concentração de ácidos nucleicos utilizando instrumentação de microvolume da Thermo Scientific. O primeiro protocolo é uma medição direta de ácido nucleico usando o espectrofotômetro NanoDrop 2000C. O segundo protocolo é uma medição indireta de ácido nucleico por fluorescência utilizando o fluoroespectrômetro NanoDrop 3300.

Para começar, limpe as superfícies ópticas superior e inferior do sistema de retenção de amostra do espectrofotômetro de microvolume pipetando de dois a três microlitros de água desionizada limpa sobre a superfície óptica inferior. Feche o braço de alavanca, garantindo que o pedestal superior entre em contato com a água desionizada. Levante o braço de alavanca e limpe ambas as superfícies ópticas com um lenço de laboratório limpo, seco e livre de fiapos.

Em seguida, abra o software NanoDrop e selecione o aplicativo para ácidos nucleicos. Use uma pipeta calibrada de pequeno volume para realizar uma leitura em branco, dispensando um microlitro de tampão sobre a superfície óptica inferior. Abaixe o braço da alavanca e selecione "branco" no aplicativo para ácidos nucleicos.

Após a conclusão da medição do branco, limpe ambas as superfícies ópticas com um lenço de laboratório. Como antes, escolha a constante apropriada para a amostra que será medida. Em seguida, dispense um microlitro da amostra de ácido nucleico sobre o pedestal óptico inferior e feche o braço de alavanca.

Como a medição é independente de volume, a amostra precisa apenas preencher a lacuna entre as duas superfícies ópticas. Para realizar uma medição, selecione "medir" no software da aplicação; o software calculará automaticamente a concentração de ácidos nucleicos e as razões de pureza. Após a medição da amostra, revise a saída espectral. Uma amostra típica de ácido nucleico apresentará um perfil muito característico.

Indicadores espectrais de uma amostra de baixa qualidade incluem picos de comprimento de onda no vale e no pico de 260 nanômetros. Fontes comuns de contaminantes associadas a técnicas específicas de isolamento de ácidos nucleicos incluem fenol, triol e extração por coluna. No caso da extração com fenol-triol, a contaminação por reagentes residuais pode ser indicada por espectros anormais entre 220 e 240 nanômetros, bem como por deslocamentos na região de 260 a 280 nanômetros.

Por outro lado, a guanina residual da extração em coluna pode contribuir para um pico próximo a 230 nanômetros e uma mudança no vale de 230 nanômetros para aproximadamente 240 nanômetros. Para avaliar com precisão a pureza da amostra, a razão 2 62 80 e a razão 2 62 30 devem ser analisadas em conjunto com a qualidade espectral geral. Ácidos nucleicos puros normalmente apresentam uma razão 2 62 80 de aproximadamente 1,8 para DNA e aproximadamente 2,0 para RNA.

Essa proporção depende do pH e da força iônica do tampão utilizado para realizar as medições do branco e da amostra. O fluoro espectrômetro Banana drop 3, 300 emprega o mesmo sistema patenteado de retenção de amostra em microvolume do espectrofotômetro NanoDrop 2000 C. Com as medições de fluorescência realizadas com apenas um microlitro de amostra, o usuário escolhe um dos três LEDs como fonte de excitação, que emite luz horizontalmente sobre a amostra.

A fluorescência subsequente da amostra é então coletada em um ângulo de 90 graus verticalmente em um espectrômetro interno. Para demonstrar a quantificação de ácidos nucleicos em microvolume com alta sensibilidade utilizando o NanoDrop 3300, um kit de fluorescência Pico Green é usado, iniciando o equilíbrio térmico dos padrões do kit e de todas as amostras de ácidos nucleicos à temperatura ambiente. As amostras fluorescentes são sensíveis à luz e devem ser mantidas em tubos âmbar ou envoltos em alumínio.

Prepare uma quantidade suficiente de tampão XTE para todos os padrões e amostras a serem medidas, bem como para a solução de trabalho de pico verde necessária. Prepare o tampão XTE diluindo o tampão 20 XTE fornecido com água livre de núcleos, conforme o protocolo do fabricante. Os volumes de reação podem variar de 200 microlitros a apenas 10 microlitros.

Neste exemplo, vamos preparar volumes de reação de 10 microlitros. Em seguida, prepare padrões de DNA de dupla fita diluídos em série e tubos ou frascos livres de nucleases. Isso cobrirá a faixa de concentração esperada das amostras de DNA desconhecidas.

Transfira cinco microlitros de cada um dos padrões de DNA de dupla fita diluídos para tubos individuais rotulados, livres de nucleases e protegidos da luz com revestimento âmbar ou papel alumínio. Em seguida, alíquota cinco microlitros de cada amostra de DNA de dupla fita de interesse em tubos protegidos da luz de forma apropriada. Após o preparo da solução de trabalho Pico Green de acordo com o protocolo do fabricante, adicione um volume igual dessa solução a cada tubo contendo o padrão de DNA de dupla fita ou a amostra de DNA de dupla fita, neste caso, cinco microlitros.

Combine volumes iguais de um tampão XTE e da solução de trabalho Pico Green. Para preparar o controle negativo, que serve como solução de referência. Misture bem o conteúdo de cada tubo por pipetagem suave e deixe incubar à temperatura ambiente por cinco minutos.

Todos os padrões e amostras devem ser equilibrados à mesma temperatura antes da medição, pois o sinal fluorescente é afetado pela temperatura. Para preparar o instrumento e realizar as medições, primeiro limpe as superfícies inferior e superior do sistema de retenção da amostra, pipete de dois a três microlitros de água desionizada sobre a superfície óptica inferior próxima. Em seguida, abra o braço da alavanca e seque os pedestais superior e inferior com um lenço laboratorial limpo e livre de fiapos.

Certifique-se de que as superfícies estejam livres de fiapos antes de prosseguir. Pois os fiapos podem exibir fluorescência na presença de uma fonte de excitação e podem interferir na medição. Abra o software do instrumento.

Selecione a aplicação para ácidos nucleicos e escolha a opção de DNA de dupla fita com pico verde. Pipete dois microlitros de XTE 1X para o pedestal inferior. Feche o braço da alavanca e selecione "branco" no campo de software do instrumento. Após a conclusão do branco, remova com papel absorvente a solução do branco de ambas as superfícies do sistema de retenção de amostra.

Em seguida, misture a solução de referência por pipetagem suave utilizando ponteiras de baixa retenção. Pipete dois microlitros da solução de referência sobre o pedestal inferior e feche o braço da alavanca. Selecione referência na guia padrões e escolha as unidades desejadas.

Clique em medir para iniciar o ciclo de medição. Quando o ciclo de medição estiver concluído, abra o braço da alavanca e seque completamente as superfícies do sistema de retenção da amostra. Meça até cinco réplicas do referencial usando um Eloqua novo para cada réplica.

Repita o processo para os padrões adicionais para construir uma curva padrão. Até sete padrões podem ser utilizados. O software foi projetado para armazenar até cinco réplicas para cada padrão.

As réplicas dos padrões são médias para gerar uma curva padrão a partir da qual as concentrações das amostras são determinadas automaticamente. Após a conclusão da curva padrão, selecione a guia amostras, insira as informações correspondentes aos IDs das amostras e meça cada amostra desconhecida. Uma curva válida indica que o número mínimo de padrões foi atendido.

A concentração de DNA é determinada automaticamente com base na curva padrão. A instrumentação NanoDrop de volume micro pode determinar a concentração de ácidos nucleicos por meio de medições diretas em A260 ou por métodos fluorométricos indiretos. Os espectrofotômetros NanoDrop também podem ser usados para quantificar proteínas utilizando a absorvância direta em A280 ou ensaios cromatômicos para proteínas.