Name: FISH para diagnóstico pré-implantação Genética (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-02-23T18:30:00.000+00:00
Duration: 7 min 34 s
Description: Aprenda a técnica de hibridização in situ por fluorescência (FISH) para diagnóstico genético pré-implantação em embriões humanos. Este método permite analisar biópsias de células únicas e detectar anomalias cromossômicas.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

1. Lise e Espalhando um Núcleo de uma biópsia de blastômeros <ol><li> Tampão de lise celular para as células se espalhando (0,2% Tween20 em 0,01 M HCl, pH 2.0) deve ser preparada 24 horas de antecedência e armazenado a -20 ° C. Prepare 100 mL e 20 mL de filtro para um recipiente estéril 30 mL universal, utilizando uma seringa estéril 20 ml e filtrar seringa. Dispense um alíquotas mL em 10-15 1,7 mL tubos de microcentrífuga estéril, fechar e rotular os tubos antes do congelamento. É recomendável ter dois lotes diferentes é o uso, o novo lote eo lote anterior, que foi testado e pode ser usado se o novo lote é insatisfatória. </li><li> Descongelar o tampão de lise em temperatura ambiente 30 minutos antes do procedimento de biópsia. Para fins práticos, a temperatura de trabalho será entre temperatura ambiente e temperatura da mão. </li><li> Marcar um círculo pequeno (aproximadamente 5 mm de diâmetro) na parte de baixo um slide amina revestido (por exemplo, Genetix), utilizando uma caneta de diamante e pré-label o slide com o número do processo, número do slide único, e data da biópsia. Use um slide separado para cada blastômero em ordem numérica, e etiqueta com o número de embriões. As lâminas devem ser rotulados com um lápis duro, tais como 4H, e "apagados", com uma luva de látex para remover qualquer poeira de grafite. </li><li> Coloque um pequeno volume de tampão de lise dentro do círculo. </li><li> Transferir os blastômeros biopsiados no tampão de lise. Se necessário, adicionar tampão de lise dentro do círculo até que a célula começa a lise, a célula deve lisar completamente e citoplasma dispersar antes da seca buffer. </li><li> Observe o núcleo para assegurar que ela permaneça dentro do círculo e não é perdida; se a célula não tem um núcleo ou tem múltiplos núcleos, a biópsia outra célula. </li><li> Deixe o slide para ar seco em temperatura ambiente. </li></ol> 2. Hibridização In Situ de um único núcleo de blastômeros <ol><li> Prepare uma série de etanol (70, 90 e 100%) feita em água destilada estéril. </li><li> Ligue e definir o bloco quente (por exemplo Hybaid Omnislide ou Vysis Hybrite) a 75 ° C. </li><li> Sondas de descongelar, vortex, e centrifugar. Os reagentes devem ser testemunhado e verificou-se correta antes de fazer a mistura da sonda. Volumes da pipeta, conforme especificado pelo fabricante para fazer a mistura em uma sonda de 0,65 mL tubo de microcentrífuga estéril e vortex e centrifugar antes de usar. O volume total da mistura de sonda deve ser suficiente para permitir que 2 mL por núcleo a ser testado e arredondado para aproximação de 10 mL para permitir uma margem de segurança. </li><li> Pré-lavagem das lâminas em frascos coplin usando tampão fosfato (PBS) (pH 7,0: 0,14 M NaCl, 3 mM KCl, 10 mM Na 2 HPO 4, 2 mM KH 2 PO 4) por 5 min à temperatura ambiente. </li><li> Enxaguar as lâminas duas vezes em água destilada estéril. </li><li> Desidratar as lâminas com a série de etanol (70, 90 e 100%) para cada 2 min à temperatura ambiente e ar seco. Garantir slides são totalmente imerso e se todo o pó de grafite flutua à superfície, banhe-se com um tecido limpo. </li><li> Registrar a posição do núcleo dentro do círculo, visualizando com um microscópio de contraste de fase. </li><li> Desidratam com etanol 100% por 2 min à temperatura ambiente e ar seco. </li><li> Aplicar 2 mL da mistura de sonda, e cubra com um 9 x 9 mm lamela (um quarto de um jovem de 18 x 18 mm no.1 lamela). </li><li> Selar as bordas da lamínula com borracha de cimento (por exemplo, Gum Cow; Proofing Cow). </li><li> Codenature as lâminas sobre um bloco quente a 75 ° C por 5 min, e depois hibridizam os slides durante a noite (16-20 h) em câmara úmida a 37 ° C. Mistura sonda que consistem inteiramente de sondas centrômero (ou seja, para casos ligados ao sexo) vai dar um resultado satisfatório após 60 min de hibridização. </li><li> Prepare um banho de água com jarros suficiente coplin e calor a 71 ° C. </li><li> Preparar um padrão de citrato 0.4x salina (SSC) solução de lavagem rigorosa (pH 7,0 a 71 ° C, 0,06 M NaCl, 6 mM C 6 H 5 Na 3 O 7 .2 H 2 O) e calor em banho-maria. </li><li> Pipetar 50 mL de lavagem rigorosa por coplin jar requeridos e verificar se a temperatura é de 71 ° C imediatamente antes de usar usando um termômetro limpo. </li><li> Remova cuidadosamente o cimento de borracha de cada slide e enxaguar a lamela usando% SSC/0.05 4x Tween20 (pH 7,0) em temperatura ambiente. </li><li> Lavar as lâminas na lavagem SSC 0.4x rigorosas a 71 ° C por 5 min. Lavar não mais de 6 slides por frasco coplin. </li><li> Lavar as lâminas em Tween20 SSC/0.05% 4x em temperatura ambiente por 2 min. </li><li> Se a mistura contém sonda sonda indiretamente rotulado (s), drenar o excesso de líquido de slides e aplicar 20 mL de anticorpo fluorescente conjugado com um quadrado 20 mm x 20 de Parafilm. </li><li> Incubar em câmara úmida a 37 ° C por 15 min. </li><li> Remover o Parafilm e lavar uma vez em Tween20 SSC/0.05% 4x em temperatura ambiente por 2 min. </li><li> Lavar duas vezes por 2 min em PBS umt temperatura ambiente e drenar os slides. </li><li> Aplicar 6 mL de DAPI / Vectashield (160 ng de 4 ',6-diamidino-2-phenylindole dicloridrato em 1 mL de Vectashield meio de montagem, Vector Laboratories) para a 22 x 22 mm não. 0 lamela e inverter a deslizar sobre a lamínula. </li><li> Blot e selar as bordas da lamínula com esmalte de unha clara. </li></ol> 3. Análise, usando um microscópio de fluorescência devidamente equipados com filtros adequados para a sondas utilizadas. <ol><li> Sinais de pontuação através da visualização direta utilizando um microscópio de fluorescência e única filtros passa-banda para cada fluorocromo no ensaio. Cada núcleo deverá ser marcado por dois analistas. A orientação geral deve levar a pontuação de um único sinal, onde dois sinais espaçados são menos do que um domínio (sinal de largura), para além, no entanto, o julgamento baseado na experiência precisa ser exercido para interpretar os sinais de intensidade variável, tamanho, e separação. </li><li> Use software de imagem (por exemplo, Isis, MetaSystems, Altlussheim, Alemanha; Cytovision, Genetix) para capturar uma imagem do núcleo para confirmação do diagnóstico visual, e para arquivamento de imagens como parte de um plano de garantia de qualidade laboratorial. </li></ol> 4. Resultados representativos: Metáfase e interfase núcleos de cultura de linfócitos do sangue periférico deve ser examinada para confirmar que as sondas selecionados são específicos para os cromossomos translocação, informativo para os pontos de interrupção (as sondas subtelomere deve hibridizar apenas para os segmentos translocados ea sonda centromérica (s) à centric segmento (s)) e os sinais em núcleos interfásicos deve ser brilhante e discreta. Marcar o número de sinais para cada sonda em 100 núcleos interfásicos de cada parceiro é recomendado para avaliar a eficiência do ensaio. Neste caso, dois sinais foram marcados em 95% -99% de núcleos para cada sonda. A Figura 1 mostra uma metáfase e núcleo interfásico de uma preparação para uma translocação recíproca entre os braços curtos dos cromossomos 5 e 9. Sinais em núcleos interfásicos de blastômeros de embriões deve ser brilhante e discreta e marcou usando filtros de banda separada para passar as cores usadas. A Figura 2 mostra um núcleo blastômero com um padrão de sinal normal (2 cópias para todos os loci testados) consistente com um complemento cromossômico normal ou equilibrado para o cromossomo 5 e 9, e um núcleo com um padrão anormal de sinal consistente com um produto desequilibrado da translocação que tem monossomia (uma cópia) para o segmento translocado do cromossomo 5 e trissomia (três cópias) para o segmento translocado do cromossomo 9. <img src="/files/ftp_upload/2570/2570fig1.jpg" alt="Figura 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 1"> Figura 1 A disseminação metáfase e um núcleo interfásico preparados a partir de cultura de linfócitos do sangue periférico de um portador de uma translocação recíproca entre os braços curtos dos cromossomos 5 e 9, com pontos de interrupção em 5p14.3 e 9p24.1:. 46, XY, t (5 ; 9) (p14.3;. p24.1) ish t (5; 9) (5ptel48, 9ptel30 +; 9ptel30, 5ptel48 +, 9cen +). Sondas de FISH foram selecionados para ambos os segmentos translocados (5p14.3 → 5pter, vermelho Cytocell subtelomere5ptel48 TexasRed; 9p24.1 → 9pter, verde Cytocell subtelomere 9ptel30 FITC) eo segmento centric do cromossomo 9 (9p24.1 → 9qter, azul Abbott CEP 9 alfa satélite SpectrumAqua). <img src="/files/ftp_upload/2570/2570fig2.jpg" alt="Figura 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 2"> Figura 2. Signals em interfase núcleos de blastômeros do dia-3 embriões capturados usando um filtro diferente para cada fluorocromo e se fundiram para formar uma imagem composta. (A) Dois sinais para cada sonda indicando duas cópias de cada locus, o que é consistente com um complemento normal ou equilibrado para os cromossomos translocação. (B) Um sinal vermelho, três sinais verdes e dois sinais de azul, indicando uma cópia do segmento translocado do cromossomo 5, três cópias do segmento translocado do cromossomo 9 e duas cópias do segmento central do cromossomo 9, que é consistente com adjacentes -1 segregação da translocação resultando em um produto desequilibrado com monossomia para 5p14.3 → 5pter e trissomia para 9p24.1 → 9pter.

<ol><li>Scriven, P. N., Handyside, A. H., Ogilvie, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chromosome+translocations%3A+segregation+modes+and+strategies+for+preimplantation+genetic+diagnosis%5BTitle%5D)+AND+%22Prenat.+Diagn%22%5BJournal%5D)">Chromosome translocations: segregation modes and strategies for preimplantation genetic diagnosis.</a> Prenat. Diagn. 18, 1437-1449 (1998).</li>
<li>Harper, J. C. Preimplantation genetic diagnosis for chromosome rearrangements. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aMackie+Ogilvie%2C+C+%22Preimplantation+Genetic+Diagnosis%22">Preimplantation Genetic Diagnosis</a>. , 2nd Ed, Cambridge University Press. 194-201 (2009).</li>
<li>Harper, J. C., Coonen, E., Ramaekers, F. C. S., Delhanty, J. D. A., Handyside, A. H., Winston, R. M. L., Hopman, A. H. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+the+sex+of+human+preimplantation+embryos+in+two+hours+using+an+improved+spreading+method+and+fluorescent+in+situ+hybridisation+using+directly+labelled+probes%5BTitle%5D)+AND+%22Hum.+Reprod%22%5BJournal%5D)">Identification of the sex of human preimplantation embryos in two hours using an improved spreading method and fluorescent in situ hybridisation using directly labelled probes.</a> Hum. Reprod. 9, 721-724 (1994).</li>
<li>Harper, J. C. Preimplantation genetic diagnosis for sex-linked diseases and sex-selection for non-medical reasons. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aMackie+Ogilvie%2C+C+%22Preimplantation+Genetic+Diagnosis%22">Preimplantation Genetic Diagnosis</a>. , 2nd Ed, Cambridge University Press. 230-235 (2009).</li>
<li>Munné, S., Lee, A., Rosenwaks, Z., Grifo, J., Cohen, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Diagnosis+of+major+chromosome+aneuploidies+in+human+preimplantation+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22Hum.+Reprod%22%5BJournal%5D)">Diagnosis of major chromosome aneuploidies in human preimplantation embryos.</a> Hum. Reprod. 8, 2185-2192 (1993).</li>
<li>Harper, J. C. Preimplantation genetic diagnosis for infertility (preimplantation genetic screening). <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aMackie+Ogilvie%2C+C+%22Preimplantation+Genetic+Diagnosis%22">Preimplantation Genetic Diagnosis</a>. , 2nd Ed, Cambridge University Press. 203-229 (2009).</li>
<li>Scriven, P. N., Bossuyt, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Diagnostic+accuracy%3A+theoretical+models+for+preimplantation+genetic+testing+of+a+single+nucleus+using+the+fluorescence+in+situ+hybridization+technique.+Hum+Reprod%5BTitle%5D)+AND+%22Cytogenetics%22%5BJournal%5D)">Diagnostic accuracy: theoretical models for preimplantation genetic testing of a single nucleus using the fluorescence in situ hybridization technique. Hum Reprod.</a> Cytogenetics. 5, 394-400 (2010).</li>
<li>Coonen, E., Dumoulin, J. C., Ramaekers, F. C., Hopman, A. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimal+preparation+of+preimplantation+embryo+interphase+nuclei+for+analysis+by+fluorescence+in-situ+hybridization%5BTitle%5D)+AND+%22Hum.+Reprod%22%5BJournal%5D)">Optimal preparation of preimplantation embryo interphase nuclei for analysis by fluorescence in-situ hybridization.</a> Hum. Reprod. 9, 533-537 (1994).</li>
<li>Dozortsev, D. I., McGinnis, K. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+improved+fixation+technique+for+fluorescence+in+situ+hybridization+for+preimplantation+genetic+diagnosis%5BTitle%5D)+AND+%22Fertil.+Steril%22%5BJournal%5D)">An improved fixation technique for fluorescence in situ hybridization for preimplantation genetic diagnosis.</a> Fertil. Steril. 76, 186-188 (2001).</li>
<li>Hsu, L. Y., Benn, P. A., Tannenbaum, H. L., Perlis, T., Carlson, A. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chromosomal+polymorphisms+of+1%2C+9%2C+16%2C+and+Y+in+4+major+ethnic+groups%3A+a+large+prenatal+study%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Med.+Genet%22%5BJournal%5D)">Chromosomal polymorphisms of 1, 9, 16, and Y in 4 major ethnic groups: a large prenatal study.</a> Am. J. Med. Genet. 26, 95-101 (1987).</li>
<li>Shim, S. H., Pan, A., Huang, X. L., Tonk, V. S., Varma, S. K., Milunsky, J. M., Wyandt, H. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((FISH+variants+with+D15Z1%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Assoc.+Genet.+Technol%22%5BJournal%5D)">FISH variants with D15Z1.</a> J. Assoc. Genet. Technol. 29, 146-151 (2003).</li>
<li>Knight, S. J., Flint, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Perfect+endings%3A+a+review+of+subtelomeric+probes+and+their+use+in+clinical+diagnosis%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Med.+Genet%22%5BJournal%5D)">Perfect endings: a review of subtelomeric probes and their use in clinical diagnosis.</a> J. Med. Genet. 37, 401-409 (2000).</li>
<li>Thornhill, A. R., de Die-Smulders, C. E., Geraedts, J. P., Harper, J. C., Harton, G. L., Lavery, S. A., Moutou, C., Robinson, M. D., Schmutzler, A. G., Scriven, P. N., Sermon, K. D., Wilton, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ESHRE+PGD+Consortium+%28PGS%29+ESHRE+PGD+Consortium+%27Best+practice+guidelines+for+clinical+preimplantation+genetic+diagnosis+%28PGD%29+and+preimplantation+genetic+screening+%28PGS%29%27%5BTitle%5D)+AND+%22Hum.+Reprod%22%5BJournal%5D)">ESHRE PGD Consortium (PGS) ESHRE PGD Consortium 'Best practice guidelines for clinical preimplantation genetic diagnosis (PGD) and preimplantation genetic screening (PGS)'.</a> Hum. Reprod. 20, 35-48 (2005).</li>
<li>Munné, S., Wells, D., Cohen, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Technology+requirements+for+preimplantation+genetic+diagnosis+to+improve+assisted+reproduction+outcomes%5BTitle%5D)+AND+%22Fertil.+Steril%22%5BJournal%5D)">Technology requirements for preimplantation genetic diagnosis to improve assisted reproduction outcomes.</a> Fertil. Steril. 94, 408-430 (2010).</li>
<li>Wilton, L., Williamson, R., McBain, J., Edgar, D., Voullaire, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Birth+of+a+healthy+infant+after+preimplantation+confirmation+of+euploidy+by+comparative+genomic+hybridization%5BTitle%5D)+AND+%22N.+Engl.+J.+Med%22%5BJournal%5D)">Birth of a healthy infant after preimplantation confirmation of euploidy by comparative genomic hybridization.</a> N. Engl. J. Med. 345, 1537-1541 (2001).</li>
<li>Wells, D., Alfarawati, S., Fragouli, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+comprehensive+chromosomal+screening+for+embryo+assessment%3A+microarrays+and+CGH%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Hum.+Reprod%22%5BJournal%5D)">Use of comprehensive chromosomal screening for embryo assessment: microarrays and CGH.</a> Mol. Hum. Reprod. 14, 703-710 (2008).</li>
<li>Handyside, A. H., Harton, G. L., Mariani, B., Thornhill, A. R., Affara, N., Shaw, M. A., Griffin, D. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Karyomapping%2C+a+universal+method+for+genome+wide+analysis+of+genetic+disease+based+on+mapping+crossovers+between+parental+haplotypes%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Med.+Genet%22%5BJournal%5D)">Karyomapping, a universal method for genome wide analysis of genetic disease based on mapping crossovers between parental haplotypes.</a> J. Med. Genet. 47, 651-658 (2010).</li>
</ol>

Não há conflitos de interesse declarados.

A aplicação de hibridização fluorescente in situ (FISH) para uma célula de embrião único (blastômero) apresenta desafios especiais, tanto em aspectos práticos e na interpretação do padrão de sinal. A célula de biópsia precisa ser espalhado em uma área pré-definida no slide, a fim de facilitar a sua localização FISH seguinte; extremo cuidado deve ser tomado para garantir que a célula é lisada, que o citoplasma tem sido dispersa, e que o núcleo é visível e intacta, e, como o diagnóstico depende dos resultados a partir desta única célula, marcando rigorosos e interpretação diretrizes devem ser aplicadas. No entanto, em mãos experientes, o peixe é uma técnica robusta para a pré-implantação de diagnóstico genético (PGD) na prática clínica. O princípio da PGD por FISH é que as sondas dirigidas a públicos específicos DNA marcadas com fluorocromos diferentes ou haptenos pode ser usado para detectar o número de cópias de loci específicos, e, assim, para detectar desequilíbrio associado a segregação de cromossomos meióticos de rearranjos cromossômicos (1), incluindo Robertsoniana translocações, translocações recíprocas, inversões, e rearranjos complexos (2). FISH também pode ser usado para selecionar embriões do sexo feminino em famílias com doença ligada ao X, para o qual não existe um teste de mutação específica (3, 4). Mais controversa, FISH também tem sido usada para triagem de aneuploidias cromossômicas esporádicas, a fim de tentar melhorar a eficiência de reprodução assistida (5, 6), no entanto, o valor preditivo deste teste usando FSIH é susceptível de ser inaceitavelmente baixos na maioria das pessoas mãos e não é recomendado para uso clínico de rotina (7). Este artigo concentra-se nos aspectos técnicos e as limitações de FISH aplicada ao diagnóstico clínico de uma única célula. Métodos de divulgação e fixação blastômeros única incluem metanol / ácido acético (5, 8), Tween / HCl (9), e uma combinação de Tween / HCl e metanol / ácido acético (10). Variações incluem o tratamento hipotónico das células antes da divulgação e / ou tratamento de pepsina e paraformaldeído após a fixação. O método deve ser devidamente validados para o laboratório (14). O método de Tween / HCl é descrito em detalhes neste artigo. O método de Tween / HCl é tecnicamente simples e altamente reprodutível em laboratórios diferentes. Este método pode ser usado para preparar núcleos único para o diagnóstico FISH de determinação do sexo e rearranjos cromossômicos com uma precisão de diagnóstico aceitável (7). Mistura sonda pode combinar diretamente e indiretamente rotulados sondas marcadas, e sondas de diferentes fabricantes. Sondas para conhecer regiões cromossômicas polimórficas (11, 12), ou aqueles que se sabe cross-hibridizar de forma significativa com outros cromossomos (13) devem ser evitados, embora possa ser usado se mostrado para ser mais específico e adequado para PGD por testes antes de ambos os parceiros reprodutivos . Fluorocromos disponível / haptenos e estratégias para sondas de discriminar incluem o seguinte: Texas Red (TR), fluoresceína isotiocianato (FITC), SpectrumGreen (Vysis), SpectrumOrange (Vysis), SpectrumAqua, sondas biotiniladas detectado com TR-avidina, FITC-avidina, ou Cy-5 estreptavidina (visualizada usando um filtro FarRed), uma mistura de sondas de vermelho e verde para produzir um sinal amarelo, uma segunda rodada de hibridação e uma terceira cor criado por captura seqüencial de SpectrumOrange usando um TexasRed e um filtro SpectrumGold). Um conjunto de sonda contendo três sondas, específicas para as regiões do centrômero cromossomos X e Y e um autossomo, é recomendado para a determinação do sexo (14), a sonda autossômica é usado para estabelecer ploidia e, assim, para diferenciar entre trissomia do X (2n, 47 , XXX) e triploidia (3n, 69, XXX), e entre tetrassomia X (48, XXXX) e tetraploidia (4n, 92, XXXX). A sonda típico set aplicada neste cenário é a mistura AneuVysion Abbott contendo alfa-satélite X, Y, e 18; este conjunto de sonda mostrou ter uma taxa de polimorfismo muito baixa e, portanto, o tratamento pré-work-up dos parceiros reprodutivos não é necessário (14). O mix de sonda para qualquer rearranjo específicas devem: O ideal é conter sondas, pelo menos, suficiente para detectar todos os produtos esperados do rearranjo com desequilíbrio cromossômico. Se isso não for possível, sonda mistura onde os produtos detectados desequilibrada foram avaliados como não-viáveis ​​em uma gravidez reconhecível e são susceptíveis de ter prevalência muito baixa pode ser aceitável (14). Ser testada em cultura de linfócitos metáfases de ambos os parceiros reprodutivos. Pelo menos dez spreads metáfase devem ser examinados para a especificidade da sonda, polimorfismos e hibridação cruzada, e, para o portador de rearranjo cromossômico, para garantir que as sondas hibridizam como esperado para os diferentes segmentos do rearranjo. Além disso, pelo menos 100 núcleos interfásicos de essas preparações devem ser marcados para avaliar a especificidade do sinal, brilho e singularidade (14). Commercial sets PGS sonda estão disponíveis (por exemplo, Abbott MultiVysion PB ou PGT), tendo como alvo os cromossomos mais freqüentemente encontrado para ser aneuplóides em produtos da concepção, e que compreende uma única sonda por cromossomo alvo. Tipicamente, o núcleo pode ter um segundo de hibridização com sondas para os cromossomos adicionais que fornecem um ensaio para os cromossomos 13, 15, 16, 18, 21, 22, e XY (14). O valor preditivo deste teste usando a divulgação e técnica de FISH aqui descrito é provável que seja um nível inaceitavelmente baixo nas mãos da maioria das pessoas e não é recomendado para uso clínico de rotina (7, 15). Técnicas como a hibridização genômica comparativa (CGH) aplicados a células individuais são capazes de teste para o número de cópias de cada cromossomo (Wilton et al. 2001), eo uso de polimorfismos de nucleotídeo único (SNP) e matrizes de análise quantitativa (Wells et al . 2008) ou genotipagem &quot;karyomapping&quot; (Handyside et al. 2009) são técnicas alternativas promissoras para detectar aneuploidias cromossômicas. No entanto, o limite de resolução e precisão para o desequilíbrio segmento permanece incerta e é provável que FISH continuará a ser a técnica de escolha para rearranjos cromossômicos envolvendo pequenos segmentos.

<table><tbody><tr><td>Ácido Clorídrico, 2,5 L</td><td>VWR international</td><td>101254H</td><td></td></tr><tr><td>Cloreto de Sódio, 5 kg</td><td>VWR international</td><td>443827W</td><td></td></tr><tr><td>Cloreto de Potássio, 250 g</td><td>VWR international</td><td>26764.232</td><td></td></tr><tr><td>Fosfato Monossódico Anidro, 500 g</td><td>VWR international</td><td>102494C</td><td></td></tr><tr><td>Fosfato Monoácido de Potássio, 500 g</td><td>VWR international</td><td>10203 4B</td><td></td></tr><tr><td>Pastilhas de Hidróxido de Sódio, 500 g</td><td>VWR international</td><td>28245.265</td><td></td></tr><tr><td>Tween20, 500 mL</td><td>VWR international</td><td>663684B</td><td></td></tr><tr><td>Etanol, 2,5 L</td><td>VWR international</td><td>8.18760.2500</td><td>Direitos Pagos</td></tr><tr><td>Citrato de Trissódio, 5 kg</td><td>VWR international</td><td>27833.363</td><td></td></tr><tr><td>Cow Gum, 250 mL</td><td>Cow Proofings Ltd.</td><td>Não mais disponível</td><td>Estoques antigos ainda podem ser encontrados em lojas de arte</td></tr><tr><td>DAPI/Antifade ES, 0,125&amp;mu;g/mL, 500 µL</td><td>Cytocell Ltd.</td><td>DES500L</td><td>150&amp;#x03BC;l vial rec&amp;rsquo;d com cada sonda Cytocell TEL</td></tr><tr><td>Verniz para Unhas, 12 mL</td><td>Botas</td><td>10088316001</td><td></td></tr><tr><td>Lâminas revestidas com amina, 25</td><td>Genetix</td><td>K2615</td><td></td></tr><tr><td>DAPI, 0,1 mL</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D-9542</td><td></td></tr><tr><td>Vectashield, 10 mL</td><td>Vector Laboratories</td><td>H1000</td><td></td></tr><tr><td>Texas-Red-avidina, 0,001 mL</td><td>Vector Laboratories</td><td>A-2016</td><td></td></tr><tr><td>FITC-avidina, 0,001 mL</td><td>Vector Laboratories</td><td>A-2011</td><td></td></tr><tr><td>Streptavidina Cy-5, 0,001 mL</td><td>GE Healthcare</td><td>PA45001</td><td></td></tr><tr><td>Tubos de microcentrífuga, 1,75 mL, caixa com 500</td><td>Thistle Scientific</td><td>AX-MCT-175-C</td><td></td></tr><tr><td>Tubos de microcentrífuga, 0,6 mL, caixa com 1000</td><td>Thistle Scientific</td><td>AX-MCT-060-C-CS</td><td></td></tr><tr><td>Recipientes universais de 30 ml, caixa com 400</td><td>Sterilin</td><td>128B</td><td>Disponível pela NHS Supply Chain, nº do catálogo KCP053</td></tr><tr><td>Bloco Quente</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Bico de Bunsen Suporte para Bico de Bunsen Pavio para Bico de Bunsen</td><td>VWR international</td><td>451-0107 451-3112 451-3111</td><td></td></tr><tr><td>Pipetas de Vidro Entupidas</td><td>Fisher Scientific</td><td>PMK-300-052R</td><td></td></tr><tr><td>Microscópio estereoscópico</td><td>Wild Heerbrugg</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Tecidos, 100 caixas</td><td>CADEIA DE SUPRIMENTOS NHS</td><td>MJT058</td><td></td></tr><tr><td>Placas de Cultura Metálicas</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Bandejas plásticas de melamina</td><td>VWR international</td><td>682-009</td><td></td></tr><tr><td>Forno</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Bocal de Pipeta de Boca</td><td>Scientific Laboratory Supplies LTD</td><td>HAE3700</td><td></td></tr><tr><td>Tubo flexível</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Filtro de seringa, 0,2&amp;mu;tamanho de poro de m, diâmetro de 25 mm</td><td>Fisher Scientific</td><td>FDM-340-010U</td><td></td></tr><tr><td>Caneta de Diamante</td><td>VWR international</td><td>818-0021</td><td></td></tr><tr><td>Bloco Quente para Lâminas</td><td>Thermo Fisher Scientific, Inc.</td><td>HBOSBB</td><td></td></tr><tr><td>Câmara de hibridização</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Rolo de tecido</td><td>CADEIA DE SUPRIMENTOS NHS</td><td>MJT004</td><td></td></tr><tr><td>Schieferdecker Jar</td><td>VWR international</td><td>631-9313</td><td></td></tr><tr><td>Frasco de Coplin</td><td>VWR international</td><td>631-9331</td><td></td></tr><tr><td>Pinça, Fina</td><td>VWR international</td><td>232-2123</td><td></td></tr><tr><td>Pinça, romba</td><td>VWR international</td><td>232-2113</td><td></td></tr><tr><td>Béquer de 1000 mL</td><td>VWR international</td><td>213-1642</td><td></td></tr><tr><td>Microscópio de Contraste de Fase</td><td>Nikon Instruments</td><td>E200</td><td></td></tr><tr><td>Cartões para blotting sem fibras, caixa com 100</td><td>Fisher Scientific</td><td>SDE1</td><td></td></tr><tr><td>Lâminas de microscópio azul-esbranquiçadas, caixa com 100</td><td>Scientific Laboratory Supplies LTD</td><td>MIC3022</td><td></td></tr><tr><td>Lâminas de cobertura, 18x18 mm, nº 1, caixa com 200</td><td>Scientific Laboratory Supplies LTD</td><td>MIC3110</td><td></td></tr><tr><td> Cobrecâmara, 22x22 mm, No. 0, caixa com 200</td><td>Scientific Laboratory Supplies LTD</td><td>MIC3104</td><td></td></tr><tr><td>Lâminas de cobertura, 22x50 mm, nº 0, caixa com 100</td><td>Scientific Laboratory Supplies LTD</td><td>MIC3206</td><td></td></tr><tr><td>Seringa de 1 mL, caixa com 100</td><td>NHS Supply Chain</td><td>FWC045</td><td></td></tr><tr><td>Ponteira para pipeta de 1 mL, 10 suportes de 1000</td><td>Thistle Scientific</td><td>AX-T-1000-C-L-R</td><td></td></tr><tr><td>Incubadora</td><td>LEEC</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Banhomaria</td><td>Conceder Equipamento</td><td>W22</td><td></td></tr><tr><td>Termômetro de álcool</td><td></td><td></td><td>Várias fontes disponíveis</td></tr><tr><td>Medidor de pH</td><td>Jenway</td><td>3305</td><td></td></tr><tr><td>Eletrodo de pH</td><td>VWR international</td><td>662-1759</td><td>Conector BNC para medidor de pH Jenway 3305</td></tr><tr><td>Agitador aquecido</td><td>Bibby</td><td>HC502</td><td></td></tr><tr><td>Pipetas Pasteur de 1 mL, caixa com 500</td><td>Scientific Laboratory Supplies LTD</td><td>PIP4202</td><td></td></tr><tr><td>Parafilm, 50 mm x 75 m</td><td>VWR international</td><td>291-1214</td><td></td></tr></tbody></table>

fish para diagnóstico pré-implantação genética

FISH for Pre-implantation Genetic Diagnosis 

Pré-implantação de diagnóstico genético (PGD) é uma alternativa criada para diagnóstico pré-natal, e envolve a seleção de pré-implantação de embriões a partir de uma coorte gerada pela tecnologia de reprodução assistida (ART). Esta seleção pode ser necessária por causa da doença monogênica familiar (fibrose cística, por exemplo), ou porque um dos parceiros traz um rearranjo de cromossomos (por exemplo uma translocação recíproca de duas vias). PGD ​​está disponível para casais que tiveram filhos anteriores afetadas, e / ou no caso de rearranjos cromossômicos, abortos de repetição ou infertilidade. Oócitos aspirados estimulação ovariana seguintes são fertilizados por em imersão in vitro do sêmen (FIV) ou por injeção intra-citoplasmática de um espermatozóide individual (ICSI). Pré-implantação de clivagem estágio embriões são biopsiados, geralmente pela remoção de uma única célula no dia 3 pós-fertilização, ea célula biópsia é testado para determinar o estado genético do embrião. Hibridização fluorescente in situ (FISH) no núcleo fixo de células biopsiadas com alvo específico sondas de DNA é a técnica de escolha para detectar o desequilíbrio do cromossomo associado com rearranjos cromossômicos, e para selecionar embriões do sexo feminino em famílias com doença ligada ao X para os quais existe nenhuma mutação específica do teste. FISH também tem sido usado para embriões de tela para aneuploidia cromossômica espontânea (também conhecido como PGS ou PGD-AS), a fim de tentar melhorar a eficiência de reprodução assistida, no entanto, o valor preditivo deste teste usando a divulgação e técnica de FISH descritas aqui é provável que seja um nível inaceitavelmente baixo nas mãos da maioria das pessoas e não é recomendado para uso clínico de rotina. Descrevemos a seleção de sondas adequadas para uma única célula FISH, técnicas de espalhamento de núcleos de blastômeros, e hibridização in situ e marcando sinal, aplicado a PGD, em um ambiente clínico.

Este artigo descreve a seleção de sondas adequadas para uma única célula FISH, técnicas de espalhamento de núcleos de blastômeros, e hibridização in situ e marcando sinal, aplicada ao diagnóstico genético pré-implantação (PGD) em um ambiente clínico.

FISH para diagnóstico pré-implantação Genética

O diagnóstico genético pré-implantacional (PGD) é uma alternativa estabelecida ao diagnóstico pré-natal e envolve a seleção de embriões pré-implantacionais de um...

O objetivo deste procedimento é utilizar a técnica de hibridização in situ por fluorescência para determinar o status dos cromossomos sexuais ou de translocação de embriões humanos in vitro em risco de anormalidade genética. Isso é realizado lisando uma única célula biopsiada de um embrião do terceiro dia sobre uma lâmina de vidro e secando o núcleo ao ar. O segundo passo consiste em desnaturar o DNA e hibridizar o DNA do núcleo alvo com sondas de DNA marcadas com fluorocromos de diferentes cores.A seguir, o excesso de sonda é removido utilizando uma lavagem rigorosa e o núcleo é corado com um corante fluorescente específico para DNA. O passo final é observar o núcleo usando um microscópio de fluorescência e capturar imagens digitais. Em última análise, podem ser obtidos resultados que mostram o número de cópias das regiões cromossômicas alvo por meio da microscopia de fluorescência.Em geral, indivíduos novos nesta técnica terão dificuldades, pois ela está no limite extremo da técnica de hibridização fluorescente in situ. Com 24 horas de antecedência, prepare o tampão de lise celular para espalhamento de células. Filtre a solução e distribua alíquotas de um mililitro em 10 a 15 tubos estéreis de microcentrífuga de 1,7 mililitro, feche e rotule os tubos antes do congelamento a menos 20 graus Celsius, logo antes do procedimento de biópsia.Descongele o tamp&atilde;o de lise &agrave; temperatura ambiente. Risque um c&iacute;rculo pequeno com aproximadamente cinco mil&iacute;metros de di&acirc;metro na parte inferior de uma l&acirc;mina revestida com amina utilizando uma caneta de diamante e, em seguida, com um l&aacute;pis duro 4H, pr&eacute;-etiquete a l&acirc;mina como BLO usando uma luva de l&aacute;tex. Para remover qualquer p&oacute; de grafite, utilize uma l&acirc;mina separada para cada espelho de blaster em ordem num&eacute;rica.Agora, coloque um pequeno volume de tampão de lise dentro do círculo. Transfira o biopsy blaster para o tampão de lise. Adicione tampão de lise conforme necessário para lisar a célula.Observe o núcleo para garantir que ele permaneça dentro do círculo e não seja perdido. Se a célula não tiver núcleo ou tiver múltiplos núcleos, realize uma biópsia em outra célula. Deixe a lâmina secar ao ar à temperatura ambiente.Primeiro, pré-lave as amostras em frascos coplano usando solução salina tamponada com fosfato por cinco minutos à temperatura ambiente. Em seguida, enxágue duas vezes com água destilada estéril, desidrate com uma série de etanol por dois minutos cada à temperatura ambiente e seque ao ar. Certifique-se de que as lâminas estejam completamente imersas e, caso alguma poeira de grafite flutue na superfície, absorva-a com um tecido limpo.Registre a posição do núcleo dentro do círculo visualizando com um microscópio de contraste de fase. Em seguida, desidrate as amostras com etanol a 100% por dois minutos à temperatura ambiente e seque ao ar. Agora, aplique dois microlitros da mistura de sonda e cubra com uma lamínula de nove por nove milímetros.Selar as bordas da lamínula com cola de borracha. Realizar a desnaturação codificada. Incubar em um bloco térmico a 75 graus Celsius por cinco minutos e, em seguida, hibridar durante a noite em uma câmara umidificada a 37 graus Celsius para cada frasco de acoplamento.Equilibre 50 mililitros de solução de lavagem rigorosa 0,4 vezes SSC em banho-maria a 71 graus Celsius. Coloque o frasco da lavagem rigorosa e o frasco de acoplamento vazio no banho-maria à temperatura ambiente e aqueça a 71 graus Celsius. Ajuste o pH da lavagem rigorosa e decante para frascos de cochin. Prossiga removendo cuidadosamente o cimento de borracha de cada lâmina e enxágue a lamínula usando SSC quatro vezes com 0,05% de tween 20, pH 7, à temperatura ambiente.Lave as amostras na lavagem rigorosa com SSC 0,4 vezes a 71 graus Celsius por cinco minutos, seguido por SSC 4 vezes com 0,05% de Tween 20 à temperatura ambiente por dois minutos. Para sondas indiretamente marcadas, remova o líquido em excesso das lâminas e aplique 20 microlitros de anticorpo conjugado com fluoróforo sob um quadrado de paraformaldeído de 20 por 20 milímetros. Incube em câmara umidificada a 37 graus Celsius por 15 minutos.Remova o filme de para e realize as seguintes lavagens à temperatura ambiente por dois minutos: uma vez em quatro vezes SSC 0,05% de tween 20 e duas vezes por dois minutos em PBS. Após drenar as lâminas, aplique seis microlitros de meio de montagem vector shield contendo DPI em um quadrado de 22 por 22 milímetros.Numere a lamínula e inverta a lâmina sobre a lamínula. Remova o excesso e selar as bordas da lamínula com esmalte incolor. Por fim, analise as amostras por microscopia de fluorescência.Avalie cada núcleo por dois analistas independentes. Utilize também um software de imagem para capturar uma imagem do núcleo, a fim de confirmar o diagnóstico visual e para arquivamento de imagens como parte da garantia de qualidade do laboratório. Aqui, uma metáfase espalhada e um núcleo em intérfase preparados a partir de linfócitos do sangue periférico indicam um portador de uma translocação recíproca entre os braços curtos dos cromossomos cinco e nove, com pontos de quebra em cinco P 14.3 e nove P dois, 4.1.As sondas para FISH iluminam tanto os segmentos translocalizados quanto o segmento cêntrico dos sinais do cromossomo nove. Em núcleos em interfase de blastômeros de embriões do terceiro dia, pode-se capturar as imagens e depois combiná-las para formar uma imagem composta. Dois sinais para cada sonda indicam duas cópias de cada locus, o que é consistente com um complemento normal ou equilibrado.Para os cromossomos de translocação, os sinais coloridos indicam uma cópia do segmento translocalizado do cromossomo cinco, três cópias do segmento translocalizado do cromossomo nove e duas cópias do segmento cêntrico do cromossomo nove. Esses dados são compatíveis com um produto desequilibrado de monossomia para 5p14.3 até 5pt e trissomia para 9p24.1 até 9pt. Após assistir a este vídeo, você deverá ter uma boa compreensão de como analisar uma única célula biopsiada de um embrião humano e preparar um único núcleo utilizando a técnica de hibridização in situ por fluorescência.Isso é importante para obter resultados de teste reprodutíveis e ideais para determinar o complemento de cromossomos sexuais ou o status de translocação de um embrião.

fish-for-pre-implantation-genetic-diagnosis

Research

JoVE Journal

Medicine

Medicina

A função do gene pode ser obscurecida na perda de função experimentos se houver compensação por outro gene. O modelo de zebrafish fornece um relativamente alto rendimento significa revelar redundância funcional como em embriões vivos.

A abordagem inversa Genética para Teste de Redundância funcional durante a embriogênese

Este protocolo descreve o método de armadilha de genes de mutagénese insercional utilizando Gal4-VP16, como o repórter primário e GFP / RFP como repórteres secundárias em peixes-zebra. Cerca de um em cada dez alta expressar F0 gene rendimento peixe armadilha descendência co-expressando GFP e RFP. O processo de rastreio pode ser facilmente dimensionado para se adaptar ao tamanho do laboratório que realiza o ecrã mutagénese insercional.

Gene Trapping Usando Gal4 em Zebrafish

O peixe-zebra é um poderoso sistema modelo para biologia do desenvolvimento e pesquisa de doenças humanas devido à sua semelhança genética com vertebrados superiores. Este protocolo descreve uma metodologia para criar embriões de peixe-zebra haplóides que podem ser utilizados para estratégias de triagem direta para identificar mutações recessivas em genes essenciais para a embriogênese inicial.

Produção de Haplóide embriões Zebrafish por<em&gt; In Vitro</em&gt; Fertilização

Manipulações transgénicas e edição genoma são críticos para testar funcionalmente o papel dos genes e elementos -regulatory cis. Aqui, um protocolo detalhado para microinjecção a geração de modificações genómicas (incluindo construções Tol2 mediadas repórter fluorescentes transgene, TALENS, e CRISPR) é apresentada para o peixe modelo emergente, a Gasterosteus aculeatus.

Microinjeção para Transgénese e Genoma Edição na Threespine Sticklebacks

Um protocolo simples e eficiente de microinjeção para edição de genes em embriões de bagre de canal usando o sistema CRISPR/Cas9 é apresentado. Neste protocolo, guia de RNAs e proteínas Cas9 foram injetadas na gema de uma célula de embriões. Este protocolo foi validado por nocauteando dois genes imune-relacionados de bagre do canal.

Microinjeção de proteína CRISPR/Cas9 em bagre do canal, Ictalurus punctatus, embriões para Gene Editing

Genoma alvo edição no sistema modelo Danio rerio (zebrafish) tem sido facilitada pela emergência de abordagens baseadas em CRISPR. Aqui, descrevemos um protocolo simplificado, robusto para a geração e a identificação de alelos CRISPR-derivado absurdo que incorpora o ensaio de mobilidade doheteroduplex e identificação de mutações usando sequenciamento de próxima geração.

Produção eficiente e identificação de CRISPR/Cas9 gerado pelo Gene nocautes no sistema modelo Danio rerio

Zebrafish têm sido usados como organismos modelo genético confiável na investigação biomédica, especialmente com o advento das tecnologias de edição de gene. Quando os fenótipos larvas são esperados, identificação de DNA de extração e genótipo pode ser desafiador. Aqui, descrevemos um procedimento eficiente de genotipagem para larvas de peixe-zebra, por cauda de recorte, tão cedo quanto pós-fertilização 72-h.

Extração de DNA do elevado-throughput e genotipagem de larvas de Zebrafish 3dpf por Fin recorte

Aqui, apresentamos um método de sequenciamento de semicondutores para teste genético pré-implante para aneuploidia (PGT-A) com as vantagens de tempo de resposta curto, baixo custo e alta taxa de transferência.

Sequenciamento de semicondutores para teste genético pré-implante para aneuploidia

O desenvolvimento inicial depende de produtos herdados maternalmente, e o papel de muitos desses produtos é atualmente desconhecido. Neste trabalho, descrevemos um protocolo que utiliza CRISPR-Cas9 para identificar fenótipos de efeito materno em uma única geração.

Determinando o papel dos genes materno-expressos no desenvolvimento inicial com crispants maternos

O protocolo apresenta os procedimentos gerais em laboratório necessários em testes genéticos pré-implantação para aneuploide em uma plataforma de sequenciamento de próxima geração baseada em semicondutores. Aqui apresentamos as etapas detalhadas de amplificação completa do genoma, seleção de fragmentos de DNA, construção de bibliotecas, preparação de modelos e sequenciamento do fluxo de trabalho com resultados representativos.

Teste genético pré-implantação para aneuploidia em uma plataforma de sequenciamento de próxima geração baseada em semicondutores

As tecnologias CRISPR-Cas revolucionaram o campo da edição do genoma. No entanto, encontrar e isolar a edição de linha germinal desejada continua sendo um grande gargalo. Portanto, este protocolo descreve um método robusto para rastrear rapidamente espermatozoides de peixe-zebra injetados com CRISPR F0 para edições germinativas usando técnicas padrão de PCR, digesto de restrição e eletroforese em gel.

Triagem de espermatozoides para o isolamento rápido de edições germinativas em peixes-zebra

Aprenda a técnica de hibridização in situ por fluorescência (FISH) para diagnóstico genético pré-implantação em embriões humanos. Este método permite analisar biópsias de células únicas e detectar anomalias cromossômicas.

FISH para diagnóstico pré-implantação Genética

Explorar mais vídeos