Clonogênica Ensaio: células aderentes

Olá, meu nome é Lum e atualmente estou realizando meu doutorado no BE IDI Heart and Diabetes Institute sob a supervisão do Dr. Tom Carianne, que é chefe do Laboratório de Medicina Epigenômica. Neste vídeo, demonstrarei o procedimento conhecido como Clon Genic Survival Assay. Trata-se de uma técnica com 50 anos de idade, que permite avaliar o impacto de diferentes tratamentos, como a exposição a radiação ou agentes químicos, na viabilidade reprodutiva celular.

O ensaio de sobrevivência congênita é uma técnica central em biologia da radiação para avaliar a sensibilidade à radiação de diferentes linhagens celulares e testar a eficácia de diferentes compostos radioprotetores ou radiossensibilizantes. Ao usar uma linha celular aderente A, o ensaio de sobrevivência criogênica consiste em três fases. Primeiro, o tratamento de uma monocamada de células aderentes.

Em segundo lugar, a preparação de uma suspensão de célula única e revestimento de um número conhecido de células e placas pintadas e, em terceiro lugar, coloração, contagem e colônias formadas após um período de incubação. Neste vídeo, usarei células imortalizadas do sítio cino humano para demonstrar como o ensaio poligênico da Bíblia pode ser usado para determinar as propriedades de proteção de rádio do antioxidante natural. 1225 M flas são semeadas de células em cinco mils de meio de antemão, de modo que no dia do experimento há 1 milhão de células por frasco.

50 microlitros da droga são adicionados em diferentes concentrações aos cinco mils de mídia em cada frasco devidamente rotulado para atingir a concentração necessária, cinco concentrações são usadas, bem como um controle de veículo neste caso, PBS. Após a adição do medicamento, as células são incubadas por uma hora nas condições apropriadas para a linha celular usada Após a incubação. O fluxo, excluindo o grupo controle, é irradiado na dosagem escolhida, que neste caso é de quatro cinzas produzidas por uma fonte emissora de césio de raios gama.

Após a irradiação, os meios são despejados e cada frasco é lavado com dois mils de PBS por cinco minutos. Depois de despejar o PBS, dois mils de 0,05% de tripsina são adicionados a cada frasco para separar as células aderentes A do frasco. Cinco mililitros inferiores de DMEM contendo 10% de soro bovino fetal são então adicionados a cada frasco para desativar a tripsina.

O conteúdo total do fasc é então transferido para tubos de falcão de 10 mililitros rotulados. Depois de concluídos, esses tubos são centrifugados por cinco minutos, após os quais o supinador é descartado cuidadosamente sem perturbar o palato, e cinco mils de meio crecy são adicionados a cada tubo. A concentração de células para cada amostra é calculada por ENC, bem como o volume necessário de cada amostra para atingir a concentração final de células a serem semeadas em cinco placas de Petri por amostra com cinco mililitros de meio cada.

Por exemplo, para o grupo de controle, 100 células são plaqueadas por prato, então o volume necessário para atingir 500 células por 25 mililitros é calculado para amostras mais concentradas, realizar uma diluição de 10 vezes ou uma diluição serial de 100 vezes para minimizar o erro envolvido ao usar volumes menores que 100 microlitros. Agora, o volume calculado anteriormente é preparado em um tubo Falcon contendo 25 mililitros de mídia para cada amostra. As amostras agora podem ser transferidas para pré-placas previamente rotuladas, adicionando cinco mililitros a cada placa para facilitar o manuseio e o transporte.

Guarde os pratos em um recipiente grande, estéril ou desinfetado. Os pratos são então colocados em uma incubadora umidificada nas condições apropriadas e incubados por oito dias. Se estiver usando queratinócitos após oito dias, remova cuidadosamente os pratos da incubadora e coloque-os todos dentro de uma capela.

Tenha cuidado para manusear o local com cuidado para que as colônias que se formaram não sejam perturbadas. Remova as tampas e adicione cinco ml de solução salina a 0,9% em cada prato para lavá-los. Aponte a ponta de preparação para o canto do prato e evite tocar no fundo do prato para que as colônias não sejam raspadas acidentalmente.

Após cinco minutos, aspire cuidadosamente a solução salina. Agora, as colônias são fixadas com três mililitros de fórmula a 4%, e os cabos devem ser substituídos para evitar a evaporação. Após 15 minutos a meia hora, a fórmula é aspirada e descartada adequadamente.

As colônias agora estão prontas para serem coradas com 0,1%Violeta cristal, cinco mililitros são adicionados a cada prato e as tampas são recolocadas após meia hora a uma hora. O corante é então lavado com água destilada e os pratos são invertidos e deixados secar durante a noite. As colônias agora estão prontas para serem contadas.

As colônias podem ser contadas manualmente usando um microscópio de dissecação. Qualquer aglomerado de células contendo 50 ou mais células é considerado uma colônia. E isso conclui nossa demonstração do ensaio de sobrevivência congênita.

A principal vantagem deste ensaio sobre outras técnicas é que ele é incrivelmente sensível e pode detectar a sobrevivência em uma grande faixa, mesmo após seis registros de morte celular. Isso, essa sensibilidade é alcançada pelo plaqueamento de números de células maiores. Este ensaio pode ser facilmente usado para outros fins, como teste, como teste de citotoxicidade.

Obrigado por assistir.