Name: Clonogênica Ensaio: células aderentes (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-03-13T11:00:00.000+00:00
Duration: 5 min 30 s
Description: Aprenda o ensaio clonogênico em células aderentes para avaliar viabilidade reprodutiva celular após radiação ou agentes químicos. Esta técnica essencial permite testar compostos radioprotetores e estudar sensibilidade à radiação em diferentes linhagens celulares.

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O apoio do Instituto Australiano de Ciência Nuclear e Engenharia é reconhecido. TCK foi o ganhador de prêmios AINSE. Lab Medicine epigenômico é suportado pelo National Health and Medical Research Council of Australia (566.559). HR é suportado por um australiano de pós-graduação e prêmios BakerIDI faísca brilhante. Este trabalho é financiado pelo CRC para Biomédica imagem Development Ltd (CRC-BID), criado e apoiado no âmbito do Governo australiano da Cooperativa programa Centros de Pesquisa. CO é o destinatário um prêmio de pós-graduação da Austrália e uma bolsa de estudos complementares CRC BID.

1. Cultura de células e Experimental Set-up <ol><li> Queratinócitos humanos são mantidos como monocamadas em 75 cm 2 frascos de cultura de tecidos contendo 15 mL de queratinócitos-SFM (K-SFM), médio (GIBCO, sem soro médio) suplementada com L-glutamina (2 mM), fator de crescimento epidérmico (5 ng / mL), extrato de hipófise bovina (40 mg / mL) e 20 mg / mL de gentamicina. As células são cultivadas em um 5% CO 2 umidificado ambiente a 37 ° C. </li><li> Células são semeadas em 12 x 25 cm 2 frascos de cultura de tecidos contendo 5 mL de K-SFM médio. </li></ol> Suspensões de células individuais são preparados por tripsinização. As células são lavadas com solução fisiológica tamponada e incubados com uma solução de tripsina 0,05% / EDTA por 5-10 minutos. Quando as células começam a se tornar arredondado e ~ 30% são individual, com 3 volumes de meio de Dulbecco modificado da águia contendo 10% de soro fetal bovino é adicionado para neutralizar o tripsina. As células são separadas por pipetagem cima e para baixo (20 vezes). As células são contadas usando um hemocitômetro. Número de células apropriadas são semeados de acordo com o tempo de duplicação da linha celular (aproximadamente 20 horas para humanos FEP-1811 queratinócitos). O objetivo é alcançar a confluência ~ 90% (~ 10 6 células por frasco) no dia do experimento. Um experimento composto por 12 frascos é ideal para um ensaio clonogênica única (seis controle não irradiado e seis frascos irradiados), que pode ser concluído em aproximadamente quatro horas. 2. Tratamento e irradiação <ol><li> Tratar células durante tempo suficiente com um composto de radiação de modificação relevante e expor as células à radiação ionizante ou radiação γ ou raios-X. </li></ol> Tipicamente seis frascos servem como revestimento de eficiência (sem tratamento) e controles única droga. Os outros seis frascos são irradiados. Neste exemplo queratinócitos humanos são tratados com a concentração de vários Cinnulin PF (CPF; Nutraceuticals Integrity International, Spring Hill, TN, EUA; dados representativos para 20 mcg / mL é mostrada abaixo), uma formulação hidrossolúvel antioxidante natural, por 1 hora a 37 ° C. Células são irradiados com 4 Gy usando uma fonte de 137 Cs (Gammacell irradiador 1000 Elite; Nordion International, ON, Canadá; 1,6 Gy / min). 3. Galvanização <ol><li> Após o tratamento, suspensões única célula são obtidas como descrito anteriormente. </li><li> O número de células em cada amostra são contados com cuidado utilizando um hemocitômetro e diluído de tal forma que o número de células apropriadas são semeados em placas de Petri (cinco repetições de cada um em 15 pratos mm). O revestimento de eficiência e / ou fração sobrevivente deve ser antecipado ao decidir o número de células de sementes por placa. O objetivo é alcançar uma faixa entre 20-150 colônias. </li> Placas de Petri são dispostos em uma caixa de clonagem umidificado plástico e incubadas em ambiente de 5% CO 2 a 37 ° C para a formação de colônia. </ol> O tempo de incubação para a formação de colônia varia de 1-3 semanas para as linhas de células diferentes, é aceito que o tempo deve ser equivalente a pelo menos seis divisões celulares. Neste exemplo, os pratos de controle para queratinócitos humanos exigem oito dias para formar clones suficientemente grande composta por 50 ou mais células. 4. Fixação e coloração Colônias Conclua as seguintes etapas em uma capela. <ol><li> Remova cuidadosamente os meios de comunicação de cada uma das placas por aspiração. </li><li> Lavar cada placa com 5 mL solução salina 0,9%. </li><li> Corrigir as colônias com 5 mL de solução-tampão de 10% de formalina neutra por 15-30 minutos. </li><li> Mancha com 5 mL de cristal violeta 0,01% (w / v) em dH 2 O por 30-60 minutos. </li><li> Lavar o excesso de cristal violeta com dH 2 O e permitir que os pratos para secar. </li></ol> 5. Contando colônia Estereomicroscópio <ol><li> Colônias com mais de 50 células individuais são contados em um estereomicroscópio. </li></ol> Imagem digital e contando com software de imagem <ol><li> Imagens digitais das colônias são obtidas usando uma câmera ou o dispositivo de digitalização </li><li> Colónias são contadas usando pacotes de software de análise de imagem, como descrito abaixo. </li></ol> Contagem de células usando ImageJ (Fiji versão 1.44a) <ol><li> Abra o arquivo de imagem em Fiji, vá ao menu Arquivo -&gt; Open. </li><li> Se for necessário converter a imagem para 8 bits formato, vá para Image -&gt; Adjust Threshold ...-&gt;. </li><li> Ajuste o limiar para reduzir os níveis de não-específico de fundo de modo que somente as colônias são detectados. </li><li> Contagem de colônias usando o seguinte: vá para Processo - Binary&gt; -&gt; Localizar maxima. </li></ol> Para este formato de imagem, tolerância ao ruído pode ser definido como 0. Garantir que a opção luz de fundo está marcada e visualizar o maxima detectada para verificar se todas as colônias de células têm sido registrado corretamente.

<ol><li>Puck, T. T., Marcus, P. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Action+of+x-rays+on+mammalian+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Exp+Med%22%5BJournal%5D)">Action of x-rays on mammalian cells.</a> J Exp Med. 103, 653-666 (1956).</li>
<li>Hurlin, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Progression+of+human+papillomavirus+type+18-immortalized+human+keratinocytes+to+a+malignant+phenotype%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Progression of human papillomavirus type 18-immortalized human keratinocytes to a malignant phenotype.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 88, 570-574 (1991).</li>
</ol>

Não há conflitos de interesse declarados.

Neste exemplo humano FEP-1811 queratinócitos foram tratados com diferentes concentrações de até 100 mcg / mL CPF; dados são apresentados por 20 mcg / mL CPF para 1 hora a 37 ° C. Células após o tratamento foram irradiados com 4 Gy usando uma fonte de 137 Cs (Gammacell irradiador 1000 Elite; Nordion International, ON, Canadá; 1,6 Gy / min). Para o controle não tratado e de drogas tratamentos apenas 100 células foram semeadas em cada placa de Petri e 1000 células por placa foram banhados para as amostras irradi...

<table><tbody><tr><td>Meio livre de soro para queratinócitos</td><td>Meio de crescimento</td><td>Invitrogen</td><td>17005042</td><td>Suplementado com 2 mM de L-glutamina, 20&amp;#x03BC;g/ml de gentamicina, fator de crescimento epidérmico e extrato de hipófise bovina.</td></tr><tr><td>Tripsina-EDTA</td><td></td><td>Invitrogen</td><td>15400-054</td><td>0,05% de tripsina/EDTA para destacar células aderentes; estoque 10x diluído em PBS sem Ca&lt;sup&gt;2+&lt;/sup&gt;/Mg&lt;sup&gt;2+&lt;/sup&gt;.</td></tr><tr><td>Meio essencial modificado de Dulbecco&amp;rsquo;s</td><td>Meio de crescimento</td><td>Invitrogen</td><td>11885-084</td><td>Suplementado com 10% de FBS e 20&amp;#x03BC;g/ml de gentamicina; utilizado para neutralizar tripsina/EDTA.</td></tr><tr><td>Solução salina 0,09%</td><td>Solução</td><td></td><td></td><td>Utilizada para lavar colônias.</td></tr><tr><td>Solução de formalina tamponada neutra a 10%</td><td>Solução</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>HT501128</td><td>~4% de formaldeído; utilizada para fixar colônias.</td></tr><tr><td>Violeta de cristal</td><td>Pó</td><td>SPI Supplies</td><td>02577-MB</td><td>Solução de violeta de cristal a 0,01%, preparada em H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O, utilizada para colorir colônias.</td></tr><tr><td>Irradiador Gammacell 1000 elite</td><td></td><td>Nordion International Inc.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Placas de Petri</td><td>60 x 15 mm</td><td>Falcon BD</td><td>353002</td><td></td></tr><tr><td>Hemocitômetro</td><td></td><td>Hawksley; Medical and Laboratory Equipment</td><td>AC1000</td><td></td></tr><tr><td>Caixa de clonagem</td><td></td><td></td><td></td><td>Caixa de plástico com furos perfurados em lados opostos da tampa; para armazenar placas de Petri durante incubação prolongada para formação de colônias.</td></tr><tr><td>Stereo microscópio</td><td>Modelo 102</td><td>Nikon Instruments</td><td></td><td>Utilizado para contar colônias constituídas por &amp;gt;50 células.</td></tr></tbody></table>

clonogênica ensaio: células aderentes

Clonogenic Assay: Adherent Cells

O clonogênica ensaio (ou formadoras de colônia) foi estabelecida há mais de 50 anos; o papel original que descreve a técnica foi publicada em 1956 1. Além de documentar o método, o estudo marco inicial gerada a curva de resposta primeira dose de radiação de raios-X de mamíferos irradiados (HeLa) células em cultura 1. Basicamente, o ensaio clonogênica permite uma avaliação das diferenças de viabilidade reprodutiva (capacidade das células de produzir descendentes, ou seja, uma única célula para formar uma colônia de 50 ou mais células) entre as células controle não tratadas e as células que sofreram vários tratamentos, como a exposição a radiação ionizante, vários compostos químicos (por exemplo, agentes citotóxicos) ou em outros casos, a manipulação genética. O ensaio tornou-se a técnica mais aceita na biologia de radiação e tem sido amplamente utilizada para avaliar a sensibilidade à radiação de linhas de células diferentes. Além disso, o ensaio clonogênica é comumente usado para monitorar a eficácia de compostos de radiação modificando e para determinar os efeitos de agentes citotóxicos e outros anti-câncer terapêuticas sobre a capacidade formadora de colônia, em linhas de células diferentes. A experiência de sobrevivência típico clonogênica usando linhas de células aderentes envolve três componentes distintos, 1) o tratamento da monocamada de células em frascos de cultura de tecidos, 2) a preparação de suspensões de células individuais e revestimento de um número adequado de células em placas de petri e 3) de fixação e coloração colônias após um período de incubação relevante, que pode variar de 1-3 semanas, dependendo da linha celular. Aqui demonstramos o procedimento geral para a realização do teste clonogênica com linhas de células aderentes com o uso de uma linha celular imortalizada dos queratinócitos humanos (FEP-1811) 2. Além disso, nossos objetivos são descrever características comuns de ensaios clonogênica incluindo o cálculo da eficiência revestimento e frações de sobrevivência após a exposição das células à radiação, e para exemplificar a modificação da radiação-resposta com o uso de uma formulação antioxidante natural.

A aplicabilidade do ensaio clonogênica na avaliação de viabilidade reprodutiva foi estabelecida há mais de 50 anos. Aqui demonstramos o procedimento geral para a realização do teste clonogênica com células aderentes.

Clonogênica Ensaio: células aderentes

O ensaio clonogênico (ou de formação de colônias) foi estabelecido há mais de 50 anos; o artigo original que descreve a técnica foi publicado em 19561. ...

Olá, meu nome é Lum e atualmente estou fazendo meu doutorado no Instituto do Coração e Diabetes BE IDI, sob a supervisão da Dra. Tom Carianne, chefe do Laboratório de Medicina Epigenômica. Neste vídeo, demonstrarei o procedimento conhecido como ensaio de sobrevivência clonogênica. Esta é uma técnica com 50 anos de existência, que permite avaliar o impacto de diferentes tratamentos, como exposição à radiação ou agentes químicos, na viabilidade reprodutiva celular.O ensaio de sobrevivência congênico é uma técnica central na biologia da radiação para avaliar a sensibilidade à radiação de diferentes linhagens celulares e testar a eficácia de diversos compostos radioprotetores ou radiosensibilizantes. Ao utilizar uma linhagem celular aderente, o ensaio de sobrevivência criogênico consiste em três fases. Primeiro, o tratamento de uma monocamada de células aderentes.Em segundo lugar, o preparo de uma suspensão de células simples e o plaqueamento de um número conhecido de células em placas pintadas, e em terceiro lugar, a coloração, contagem e as colônias formadas após um período de incubação. Neste vídeo, estarei utilizando células de linhagem imortalizada de cino humano para demonstrar como o ensaio de polônio pode ser usado para determinar as propriedades radioprotetoras do antioxidante natural. Frascos de 1225 M são semeados com células em cinco mililitros de meio previamente, de modo que no dia do experimento haja 1 milhão de células por frasco.50 microlitros do fármaco são adicionados em diferentes concentrações aos cinco mililitros de meio em cada frasco devidamente identificado para atingir a concentração desejada; cinco concentrações são utilizadas, bem como um controle de veículo, neste caso, PBS. Após a adição do fármaco, as células são incubadas por uma hora nas condições apropriadas para a linhagem celular utilizada. Após a incubação, os grupos experimentais, excluindo o grupo controle, são irradiados na dose escolhida, que neste caso é quatro gray produzida por uma fonte de césio emissora de raios gama.Após a irradiação, os meios são descartados e cada frasco é lavado com dois mililitros de PBS por cinco minutos. Após a remoção do PBS, adiciona-se dois mililitros de tripsina a 0,05% em cada frasco para destacar as células aderentes A do frasco. Em seguida, adiciona-se cinco mililitros inferiores de DMEM contendo 10% de soro bovino fetal em cada frasco para desativar a tripsina.O conteúdo completo do fasc é então transferido para tubos cónicos de 10 mililitros rotulados. Após a conclusão, esses tubos são centrifugados por cinco minutos, após o que o sobrenadante é descartado cuidadosamente sem perturbar o pellet, e cinco mililitros de meio crecy são adicionados a cada tubo. A concentração de células de cada amostra é calculada, bem como o volume necessário de cada amostra para atingir a concentração final de células a serem semeadas em cinco placas de Petri por amostra, com cinco mililitros de meio cada.Por exemplo, para o grupo controle, 100 células são semeadas por placa, portanto, o volume necessário para obter 500 células por 25 mililitros é calculado; para amostras mais concentradas, realize uma diluição de 10 vezes ou uma diluição serial de 100 vezes para minimizar o erro envolvido ao usar volumes menores que 100 microlitros. Agora, o volume previamente calculado é preparado em um tubo tipo Falcon contendo 25 mililitros de meio para cada amostra. As amostras podem então ser transferidas para placas previamente identificadas, adicionando cinco mililitros a cada placa para facilitar o manuseio e o transporte.Armazene as placas em um recipiente grande, estéril ou desinfetado. Em seguida, coloque as placas em uma estufa umidificada nas condições apropriadas e incube por oito dias. Se for utilizar queratinócitos após oito dias, remova cuidadosamente as placas da estufa e organize-as uma a uma dentro de uma cabine de segurança biológica.Manuseie o local com cuidado para não perturbar quaisquer colônias que tenham se formado. Remova as tampas e adicione cinco ml de salina 0,9% a cada placa para lavá-las. Direcione a ponta do pipetador para o canto da placa e evite tocar o fundo da placa para que as colônias não sejam acidentalmente removidas.Após cinco minutos, aspire cuidadosamente a solução salina. Agora, as colônias são fixadas com três mililitros de 4%formula, e as tampas devem ser substituídas para evitar evaporação. Após 15 minutos a meia hora, a fórmula é aspirada e descartada adequadamente.As colônias estão agora prontas para serem coradas com violeta de cristal a 0,1%; cinco mililitros são adicionados a cada placa e as tampas são recolocadas após meia hora a uma hora. O corante é então removido com água destilada e as placas são invertidas e deixadas secar durante a noite. As colônias estão agora prontas para serem contadas.As colônias podem ser contadas manualmente utilizando um microscópio estereoscópico. Qualquer agrupamento de células contendo 50 ou mais células é considerado uma colônia. E isso conclui a nossa demonstração do ensaio de sobrevivência congênico.A principal vantagem deste ensaio em relação a outras técnicas é que ele é incrivelmente sensível e pode detectar sobrevivência em uma ampla faixa, mesmo após seis ordens de magnitude de morte celular. Essa sensibilidade é alcançada ao semear números maiores de células. Este ensaio pode facilmente ser utilizado para outras finalidades, como testar a citotoxicidade.Obrigado por assistir.

Research

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Biology

Biologia

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