Única partícula Reconstrução Microscopia Eletrônica do Complexo exossomo Usando o método Tilt Aleatório Conical

O objetivo geral do experimento a seguir é obter a estrutura tridimensional do complexo exossômico usando o método de inclinação cônica aleatória. Isso é conseguido depositando primeiro uma fina camada de filme de carbono na grade de carbono sagrado para fazer o substrato de suporte para o complexo de proteínas e a mancha como uma segunda etapa. A amostra e a mancha são aplicadas na grade, que enterra a amostra em sais de metais pesados.

A microscopia eletrônica é então realizada para obter pares de micrografias de inclinação da amostra. Finalmente, são obtidos resultados que mostram a estrutura tridimensional do complexo exossômico com base na análise de imagens usando o método de inclinação cônica aleatória. Geralmente, os indivíduos novos neste método terão dificuldades porque, às vezes, uma boa preparação da amostra para o método de inclinação cônica aleatória é difícil, bem como o procedimento para o processamento de imagem que segue a visualização.

A demonstração desse método é crítica, pois as etapas de preparação do grau e da amostra são difíceis de aprender sem uma ilustração da avaliação da amostra. O princípio do método de inclinação cônica aleatória requer a obtenção de um par de micrografias da mesma região de uma amostra dentro do microscópio eletrônico. Uma foto é tirada da amostra em uma posição não inclinada e a outra foto é tirada da amostra inclinada em um ângulo entre 50 e 70 graus Usando o computador, o par de micrografias digitalizadas é colocado lado a lado e as imagens das mesmas partículas são selecionadas nesta ilustração.

Essas imagens são marcadas por números em coordenadas tridimensionais. As imagens de partículas não inclinadas e seus parceiros inclinados são correlacionadas entre si pela direção do eixo de inclinação e do ângulo de inclinação. O alinhamento das imagens de partículas não inclinadas traz as imagens de partículas inclinadas para seus locais correspondentes como aMule usando várias imagens de partículas inclinadas preenchendo o espaço azimutal, a estrutura tridimensional da molécula pode ser reconstruída usando um algoritmo de retroprojeção para fabricar as grades primeiro, prepare uma solução VAR de 0,5% adicionando 0,45 gramas de resina formal de polivinil, e 90 mililitros de clorofórmio para um copo de vidro de 100 mililitros.

Em uma capela de exaustão, cubra o béquer com papel alumínio e dissolva a resina var forma. Com o oito de uma pequena barra de agitação e uma agitação magnética, a resina leva cerca de 15 minutos para se dissolver. Enquanto isso, limpe as lâminas de vidro de microscopia pré-limpas em metanol e com lenços umedecidos.

Após a forma, a resina var é totalmente dissolvida. No clorofórmio, adicione um mililitro de glicerol a 50% à superfície da solução. Ajustar o volume do glicerol adicionado afeta a densidade dos orifícios no carbono sagrado.

Despeje a ponta de um ultrassônico na solução. A cerca de uma polegada de profundidade, use a potência máxima para sonicar por um minuto, o que fará uma emulsão de gotículas de glicerol na forma de nossa solução. A sonicação mais longa causará um tamanho menor de orifícios no carbono sagrado.

A solução torna-se leitosa após esta etapa. Imediatamente após a imersão na sonicação, o vidro limpo desliza verticalmente para dentro da emulsão. Por um segundo, retire-os e seque a parte inferior das lâminas usando papel de filtro para formar uma fina película plástica sobre a superfície das lâminas.

Depois que o clorofórmio evaporar, verifique a densidade e o tamanho dos orifícios no filme sob um microscópio de luz. A condição de preparação descrita aqui deve produzir de 10 a 20 furos em cada quadrado de uma grade de malha de 400 com diâmetros entre três e quatro micrômetros. Quando as lâminas de vidro estiverem secas, corte a borda do filme plástico na superfície da lâmina.

Flutue o filme na superfície da água destilada mergulhando verticalmente a lâmina na água. A película fina na superfície da água pode ser observada em um ângulo de relance contra o reflexo da luz. Coloque grades de cobre de 400 mesh no filme, uma a uma, com a superfície lisa da grade voltada para baixo.

Pegue o filme plástico com grades usando um pedaço de papel. Vire o papel e deixe secar. Em uma placa de Petri, mergulhe o papel em metanol para remover o glicerol residual nos orifícios e deixe o papel secar ao ar.

Use um evaporador de carbono para revestir as grades com uma camada de carbono com uma espessura de aproximadamente 20 nanômetros. Usando o tempo de evaporação para controlar a espessura desejada. A espessura pode ser determinada pela cor cinza do carbono em comparação com a cor cinza de uma camada de carbono de espessura conhecida.

Mergulhe as grades em camadas de carbono com clorofórmio em uma placa de Petri de vidro por meia hora para remover a remoção da forma var var, seguida pela secagem das grades resulta em grades de carbono sagradas caseiras. Em seguida, evapore uma fina camada de carbono com cerca de cinco nanômetros de espessura em uma superfície de mica recém-clivada. Em seguida, coloque cuidadosamente as grades de carbono sagrado em um pedaço de papel de filtro embaixo da água destilada.

Em um aparelho caseiro, flutue o carbono fino da superfície da mica para a superfície da água e deposite-o lentamente nas grades de carbono sagrado. Pegue o papel de filtro com grades e deixe secar. Em uma capela de exaustão, comece a coloração negativa do complexo de exossomos fazendo uma solução fresca de formato de urinol a 2%.

Conforme descrito no procedimento escrito, cubra o tubo de solução com um pedaço de papel alumínio Para evitar a exposição à luz, a solução deve ser usada da mesma forma. O brilho diurno descarrega um carbono fino sobre uma grade totalmente de carbono usando um aparelho de descarga de brilho. Em seguida, coloque um pedaço de perfume limpo na bancada, pipete três gotículas de 50 microlitros de solução de coloração de formato de mictório no topo do perfil, dilua o complexo de exossomos a uma concentração de aproximadamente 50 nanomolares Usando tampão de diluição pipeta quatro microlitros da proteína diluída até que o brilho descarregue a grade.

Deixe a amostra permanecer na grade por um minuto e, em seguida, seque a solução residual com um pedaço de papel de filtro usando uma pinça. Vire a grade imediatamente em cima da primeira gota de mancha e enxágue a grade movendo-a para frente e para trás várias vezes por cerca de 10 segundos. Repita esse processo para cada uma das três gotículas de mancha após o último enxágue, deixe a mancha permanecer na grade por mais um minuto.

Em seguida, seque a mancha com um pedaço de papel de filtro. Mantenha uma fina camada de solução de mancha na superfície da grelha e deixe a grelha secar numa hotte. Coloque a grade de amostra no suporte de amostra e, em seguida, coloque o suporte em um microscópio eletrônico FEI TE nine 12

Verifique a grade de amostra em baixa ampliação para encontrar os melhores quadrados manchados. Um bom quadrado parece ter uma dúzia de buracos com dimensões de cerca de um a dois micrômetros e áreas manchadas escuras neles. Ligue o modo de baixa dose da interface do usuário FEI e alinhe o foco de pesquisa e a posição de exposição no modo de baixa dose.

Defina a pesquisa no modo de fração com comprimento de câmera de 1,5 metro. Defina o foco para uma ampliação de 150 K e defina a exposição para uma ampliação de 50 K com um segundo de tempo de exposição medido. Normalmente, um recurso reconhecível na grade no modo de pesquisa e exposição é usado para realizar o alinhamento.

Encontre os furos com boa coloração no modo de pesquisa e salve os locais. Tire uma foto CCD da praça. Incline a amostra a 55 graus e tire outra foto.

Compare as duas imagens e identifique os orifícios emparelhados nas duas micrografias. Incline o palco de volta a zero grau. Use o kit de baixa dose para tirar fotos de cada orifício identificado no modo de pesquisa em alta ampliação com um desfoque de cerca de menos 0,7 micrômetros.

Depois que as fotos forem tiradas de todos os orifícios, incline o palco em 55 graus usando a mesma ampliação. Faça micrografias da amostra inclinada com um desfoque de cerca de menos 1,2 micrômetros. Identifique o par de micrografias de inclinação correspondente com base nos padrões nas micrografias de baixa ampliação usando o padrão irregular das grades de carbono sagradas caseiras.

Para ajudar na correlação, escolha pares de inclinação de micrografia com partículas de distribuição uniforme e sem halos ao redor das partículas. Essas micrografias com halos de manchas óbvias ao redor delas devem ser descartadas para processar os dados. Comece com a configuração do programa no procedimento.

O processamento de imagens será demonstrado usando o processo 2D no pacote Eman. Para alterar o formato da imagem, o pacote iMagic five para fazer o alinhamento 2D e o pacote spider. Para realizar a reconstrução e refinamento 3D, converta a imagem digital DM três Gatan para o formato de imagem de aranha.

Usando o comando process 2D, escolha os pares de partículas. Usando o programa da web distribuído no pacote do programa spider, o programa salva automaticamente as coordenadas da caixa de partículas de todas as partículas selecionadas usando o script spider. O script salva as pilhas de partículas inclinadas e não inclinadas.

Converta as partículas inclinadas da ONU no formato IMAG cinco. Usando a passagem de banda do programa EM dois EM, filtre e mascare as partículas inclinadas UN usando o comando de preparação InCorp no IMAG cinco e centralize as partículas mascaradas de passagem de banda usando o comando center. Na imagem cinco, alinhe e classifique as partículas iterativamente em classes homogêneas usando um script em lote executando automaticamente os programas IMAG cinco.

Em seguida, use o comando MSA names in class no IMAG five para gerar uma tabela de pesquisa de classe das partículas, gerar um arquivo de plotagem para valores de translação e rotação de alinhamento para cada partícula usando o comando header. No iMagic five, converta as partículas alinhadas para o formato de aranha usando o programa EM two EM. Em seguida, altere a tabela de pesquisa de classes para arquivos de documento de aranha.

Os valores de translação e rotação de alinhamento para cada partícula também são convertidos em um filtro de passagem de banda de arquivo de documento de aranha, mascarar e centralizar as partículas inclinadas, assim como para as partículas não inclinadas no IMAG cinco, gerar um novo conjunto de dados para partículas inclinadas ao centro. Crie arquivos de documentos angulares a partir dos documentos de alinhamento de referência múltipla gerados a partir do IMAG cinco e dos arquivos DCB gerados pelo programa da web. Use o script de retroprojeção no spider para obter um modelo inicial para cada média de classe.

Finalmente, execute o refinamento da projeção do volume inicial usando o script de aranha contra todas as partículas não inclinadas para obter o volume final usando RCT. Cerca de 50 reconstruções do exossomo foram obtidas. Os volumes são gerados a partir de partículas inclinadas correspondentes a cada partícula nas 50 classes de partículas não inclinadas.

Usando a projeção reversa implementada no pacote spider, o refinamento de correspondência de projeção foi então realizado Usando esses volumes como modelos iniciais e o volume 3D exibido do exossomo foi gerado em cerca de 18 ang resolução extra, podemos então nos abaixar nos modelos atômicos de diferentes partes do complexo no mapa 3D. Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como usar o RCT para obter reconstruções tridimensionais, desde a geração de uma boa grade narrativa permanente de espécimes até micrografias ponto a ponto e, finalmente, a obtenção da reconstrução usando técnicas de análise de imagem. Além do protocolo que descrevemos aqui, existem vários métodos para obter as reconstruções finais na análise de imagens.

O passo mais crítico para obter uma reconstrução correta e confiável é trabalhar com uma amostra bem preparada.