Única partícula Reconstrução Microscopia Eletrônica do Complexo exossomo Usando o método Tilt Aleatório Conical

O objetivo geral do experimento a seguir é obter a estrutura tridimensional do complexo do exossomo utilizando o método de inclinação cônica aleatória. Isso é alcançado primeiro depositando uma fina camada de filme de carbono sobre a grade de carbono perfurada para formar o substrato de suporte para o complexo proteico e, em um segundo passo, para o corante. O espécime e o corante são aplicados sobre a grade, o que enterra o espécime em sais de metais pesados.

A microscopia eletrônica é então realizada para obter pares de inclinação de micrografias do espécime. Por fim, são obtidos resultados que mostram a estrutura tridimensional do complexo de exossomos com base na análise de imagens utilizando o método de inclinação cônica aleatória. Geralmente, indivíduos novos neste método enfrentarão dificuldades, pois, às vezes, o bom preparo do espécime para o método de inclinação cônica aleatória é difícil, bem como o procedimento de processamento de imagens que segue a Visualização.

A demonstração deste método é fundamental, pois as etapas de graduação e preparação de espécimes são difíceis de aprender sem uma ilustração da avaliação da amostra. O princípio do método de inclinação cônica aleatória exige a obtenção de um par de micrografias da mesma região de um espécime dentro do microscópio eletrônico. Uma imagem é obtida com o espécime em posição não inclinada, e a outra imagem é obtida com o espécime inclinado em um ângulo entre 50 e 70 graus. Usando o computador, o par de micrografias digitalizadas é colocado lado a lado e as imagens das mesmas partículas são selecionadas nesta ilustração.

Essas imagens são marcadas por números em coordenadas tridimensionais. As imagens de partículas não inclinadas e seus pares inclinados são correlacionadas entre si pela direção do eixo de inclinação e pelo ângulo de inclinação. O alinhamento das imagens de partículas não inclinadas leva as imagens das partículas inclinadas para suas respectivas localizações equivalentes em aMule; utilizando múltiplas imagens de partículas inclinadas que preenchem o espaço azimutal, a estrutura tridimensional da molécula pode ser reconstruída usando um algoritmo de retroprojeção. Para fabricar as grades, prepare primeiro uma solução de VAR 0,5% adicionando 0,45 gramas de resina de polivinil formal e 90 mililitros de clorofórmio a um béquer de vidro de 100 mililitros.

Em uma capela, cubra o béquer com papel de alumínio e dissolva a resina de formvar. Com o auxílio de um pequeno bastão de agitação e um agitador magnético, a resina leva cerca de 15 minutos para se dissolver. Enquanto isso, limpe lâminas de vidro para microscopia previamente limpas com metanol e com lenços Kim.

Após a resina de formvar estar completamente dissolvida em clorofórmio, adicione um mililitro de glicerol a 50% à superfície da solução. O ajuste do volume de glicerol adicionado afeta a densidade dos orifícios no carbono perfurado.

Incline a ponta de um ultrassom na solução. A uma profundidade de cerca de 2,5 cm, use potência máxima para sonificar durante um minuto, o que formará uma emulsão de gotículas de glicerol na forma da nossa solução. Uma sonicação mais prolongada causará um tamanho menor dos poros no carbono poroso.

A solução fica turva após esta etapa. Imediatamente após a imersão na sonicação, mergulhe verticalmente as lâminas de vidro limpas na emulsão. Retire-as após um segundo e seque a parte inferior das lâminas usando papel filtro para formar uma película fina de plástico sobre a superfície das lâminas.

Após a evaporação do clorofórmio, verifique a densidade e o tamanho dos orifícios no filme sob um microscópio óptico. A condição de preparação descrita aqui deve produzir de 10 a 20 orifícios em cada quadrado de uma grade de 400 malhas com diâmetros entre três e quatro micrômetros. Uma vez que as lâminas de vidro estejam secas, corte a borda do filme plástico na superfície da lâmina.

Deixe o filme flutuar na superfície da água destilada mergulhando verticalmente a lâmina na água. O filme fino na superfície da água pode ser observado em um ângulo rasante contra o reflexo da luz. Coloque grades de cobre de 400 mesh sobre o filme, uma por uma, com a superfície lisa da grade voltada para baixo.

Pegue o filme plástico com as grades usando uma folha de papel. Vire o papel e deixe secar. Em uma placa de Petri, mergulhe o papel em metanol para remover o glicerol residual nos orifícios e deixe o papel secar ao ar.

Utilize um evaporador de carbono para revestir as grades com uma camada de carbono com espessura de aproximadamente 20 nanômetros. Use o tempo de evaporação para controlar a espessura desejada. A espessura pode ser determinada pela cor cinza do carbono, comparada com a cor cinza de uma camada de carbono de espessura conhecida.

Deixe os suportes com camada de carbono embebidos em clorofórmio em uma placa de Petri de vidro por meia hora para remover a resina formvar; a secagem subsequente dos suportes resulta em suportes de carbono perfurados caseiros. Em seguida, evapore uma fina camada de carbono com cerca de cinco nanômetros de espessura sobre uma superfície frescamente clivada de mica. Depois, coloque cuidadosamente os suportes de carbono perfurados sobre um pedaço de papel filtro sob água destilada.

Em um aparato caseiro, flutue o carbono fino da superfície da mica sobre a superfície da água e deposite-o lentamente sobre as grades de carbono perfurado. Pegue o papel-filtro com as grades e deixe secar. Em uma cabine de segurança, inicie a coloração negativa do complexo de exossomos preparando uma solução fresca de formiato de uranila 2%.

Conforme descrito no procedimento escrito, cubra o tubo da solução com um pedaço de papel alumínio para evitar exposição à luz; a solução deve ser usada no mesmo dia. Submeta uma grade de carbono com uma fina camada de carbono a uma descarga luminiscente utilizando um aparelho de descarga luminiscente. Em seguida, coloque um pedaço de parafina limpa sobre a bancada e pipete três gotas de 50 microlitros da solução de corante de formiato de uranila sobre a parafina. Dilua o complexo de exossomos até uma concentração de aproximadamente 50 nanomolares utilizando tampão de diluição. Pipete quatro microlitros da proteína diluída sobre a grade submetida à descarga luminiscente.

Deixe a amostra permanecer na grade por um minuto, depois remova a solução residual com um pedaço de papel-filtro usando pinças. Vire imediatamente a grade sobre a primeira gota de corante e lave a grade movendo-a para frente e para trás várias vezes durante cerca de 10 segundos. Repita este processo para cada uma das três gotas de corante; após a última lavagem, deixe o corante permanecer na grade por mais um minuto.

Em seguida, remova a coloração com um pedaço de papel filtro. Mantenha uma camada fina da solução de corante na superfície da grade e deixe a grade secar em uma cabine de exaustão. Coloque a grade da amostra no porta-amostras e, então, insira o porta-amostras em um microscópio eletrônico FEI TE nine 12.

Verifique a grade da amostra em baixa ampliação para encontrar os melhores quadrados corados. Um bom quadrado parece ter cerca de uma dúzia de orifícios com dimensões de aproximadamente um a dois micrômetros e áreas escuras coradas neles. Ative o modo de baixa dose da interface do usuário FEI e alinhe o foco de busca e a posição de exposição no modo de baixa dose.

Configure a busca no modo de fração com comprimento da câmera de 1,5 metro. Ajuste o foco para ampliação de 150 K e configure a exposição para ampliação de 50 K com tempo de exposição medido de um segundo. Normalmente, uma característica reconhecível na grade em ambos os modos, busca e exposição, é utilizada para realizar o alinhamento.

Encontre os orifícios com boa coloração no modo de busca e salve as localizações. Tire uma imagem CCD do quadrado. Incline o espécime para 55 graus e tire outra imagem.

Compare as duas imagens e identifique os orifícios pareados nas duas micrografias. Incline o estágio de volta para zero graus. Use o kit de baixa dose para tirar imagens de cada orifício identificado no modo de busca com alta ampliação e um desfoque de cerca de menos 0,7 micrômetros.

Após tirar fotos de todos os orifícios, incline a platina para 55 graus usando a mesma ampliação. Tire micrografias do espécime inclinado com um desfoque de aproximadamente menos 1,2 micrômetros. Identifique o par correspondente de micrografias inclinadas com base nos padrões das micrografias de baixa ampliação, utilizando o padrão irregular das grades de carbono perfurado caseiras.

Para auxiliar a correlação, escolha pares de micrografias com inclinação que apresentem partículas com distribuição uniforme e sem halos ao redor das partículas. As micrografias com halos evidentes de corante ao redor delas devem ser descartadas para processar os dados. Inicie com a configuração do programa no procedimento.

A processamento de imagens será demonstrado utilizando o processo 2D no pacote Eman. Para alterar o formato da imagem, use o pacote iMagic cinco para realizar o alinhamento 2D e o pacote spider. Para realizar a reconstrução e refinamento 3D, converta a imagem digital DM3 da Gatan para o formato de imagem spider.

Usando o comando process 2D, selecione os pares de partículas. Utilizando o programa web distribuído no pacote do programa spider, o programa salva automaticamente as coordenadas das partículas, delimitando todas as partículas selecionadas com o script spider. O script salva as pilhas de partículas inclinadas e não inclinadas.

Converta as partículas inclinadas de UN para o formato IMAG cinco. Utilizando o programa EM de EM dois com filtro de banda passante, filtre e máscare as partículas inclinadas de UN usando o comando InCorp prep no IMAG cinco e centralize as partículas mascaradas com o filtro de banda passante utilizando o comando center. No IMAG cinco, alinhe e classifique iterativamente as partículas em classes homogêneas usando um script em lote que executa automaticamente os programas do IMAG cinco.

Em seguida, utilize os nomes de MSA no comando class no IMAG cinco para gerar a tabela de consulta das partículas da classe, gerando um arquivo de gráfico para os valores de translação e rotação do alinhamento de cada partícula usando o comando header. No iMagic cinco, converta as partículas alinhadas para o formato spider utilizando o programa EM dois EM. Em seguida, transforme a tabela de consulta das classes em arquivos de documento spider.

Os valores de translação e rotação do alinhamento para cada partícula também são convertidos em um arquivo de documento spider com filtro passa-banda, máscara e centralização das partículas inclinadas, da mesma forma que para as partículas não inclinadas na IMAG cinco, gerando um novo conjunto de dados para as partículas inclinadas centralizadas. Crie arquivos de documento angulares a partir dos documentos de alinhamento multirreferência gerados pela IMAG cinco e os arquivos DCB gerados pelo programa web. Utilize o script de retroprojeção no spider para obter um modelo inicial para cada média de classe.

Finalmente, realize o refinamento por projeção do volume inicial usando o script spider contra todas as partículas não inclinadas para obter o volume final usando RCT. Cerca de 50 reconstruções do exossomo foram obtidas. Os volumes são gerados a partir de partículas inclinadas correspondentes a cada partícula nas 50 classes de partículas não inclinadas.

Utilizando a retroprojeção implementada no pacote spider, o refinamento por correspondência de projeções foi então realizado usando esses volumes como modelos iniciais, e o volume tridimensional exibido do exossomo foi gerado com resolução de aproximadamente 18 angstroms. Em seguida, podemos encaixar os modelos atômicos de diferentes partes do complexo no mapa tridimensional. Após assistir a este vídeo, você deverá ter uma boa compreensão de como usar a RCT para obter reconstruções tridimensionais, desde a geração de uma grade bem preparada de espécimes até micrografias eletrônicas e, finalmente, à obtenção da reconstrução utilizando técnicas de análise de imagem. Além do protocolo que descrevemos aqui, existem diversos métodos para obter as reconstruções finais na análise de imagens.

O passo mais crítico para obter uma reconstrução confiável e correta é trabalhar com um espécime bem preparado.