Name: Única partícula Reconstrução Microscopia Eletrônica do Complexo exossomo Usando o método Tilt Aleatório Conical (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-03-28T14:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 10 s
Description: Aprenda a reconstrução 3D do complexo exossomo de Saccharomyces cerevisiae por microscopia eletrônica com coloração negativa usando o método de inclinação cônica aleatória. Este protocolo auxilia pesquisadores em biologia estrutural.

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Os autores gostariam de agradecer aos membros de Nogales laboratório na Universidade da Califórnia-Berkeley em ajudar a estabelecer os protocolos iniciais e os membros do Wang laboratório na Universidade de Yale em sua ajuda para estabelecer os protocolos completa. Reconhecemos também as equipes em crio-EM facilidade e alto desempenho Centro de Computação na Universidade de Yale School of Medicine, pelo seu apoio. HW é um Smith Família premiado.

<ol><li>van Heel, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Angular+reconstitution%3A+a+posteriori+assignment+of+projection+directions+for+3D+reconstruction%5BTitle%5D)+AND+%22Ultramicroscopy%22%5BJournal%5D)">Angular reconstitution: a posteriori assignment of projection directions for 3D reconstruction.</a> Ultramicroscopy. 21, 111-123 (1987).</li>
<li>Radermacher, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three-dimensional+reconstruction+of+single+particles+from+random+and+nonrandom+tilt+series%5BTitle%5D)+AND+%22J+Electron+Microsc+Tech%22%5BJournal%5D)">Three-dimensional reconstruction of single particles from random and nonrandom tilt series.</a> J Electron Microsc Tech. 9, 359-394 (1988).</li>
<li>Penczek, P. A., Grassucci, R. A., Frank, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+ribosome+at+improved+resolution%3A+new+techniques+for+merging+and+orientation+refinement+in+3D+cryo-electron+microscopy+of+biological+particles%5BTitle%5D)+AND+%22Ultramicroscopy%22%5BJournal%5D)">The ribosome at improved resolution: new techniques for merging and orientation refinement in 3D cryo-electron microscopy of biological particles.</a> Ultramicroscopy. 53, 251-270 (1994).</li>
<li>Ohi, M., Li, Y., Cheng, Y., Walz, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Negative+staining+and+image+classification+-+powerful+tools+in+modern+electron+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Biol+Proced+Online%22%5BJournal%5D)">Negative staining and image classification - powerful tools in modern electron microscopy.</a> Biol Proced Online. 6, 23-34 (2004).</li>
<li>Frank, J., Radermacher, M., Penczek, P., Zhu, J., Li, Y., Ladjadj, M., Leith, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SPIDER+and+WEB%3A+processing+and+visualization+of+images+in+3D+electron+microscopy+and+related+fields%5BTitle%5D)+AND+%22J+Struct+Biol%22%5BJournal%5D)">SPIDER and WEB: processing and visualization of images in 3D electron microscopy and related fields.</a> J Struct Biol. 116, 190-199 (1996).</li>
<li>Shaikh, T. R., Gao, H., Baxter, W. T., Asturias, F. J., Boisset, N., Leith, A., Frank, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SPIDER+image+processing+for+single+particle+reconstruction+of+biological+macromolecules+from+electron+micrographs%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">SPIDER image processing for single particle reconstruction of biological macromolecules from electron micrographs.</a> Nat Protoc. 3, 1941-1974 (2008).</li>
<li>Heel, M. van, Harauz, G., Orlova, E. V., Schmidt, R., Schatz, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+new+generation+of+the+IMAGIC+image+processing+system%5BTitle%5D)+AND+%22J+Struct+Biol%22%5BJournal%5D)">A new generation of the IMAGIC image processing system.</a> J Struct Biol. 116, 17-24 (1996).</li>
<li>Ludtke, S. J., Baldwin, P. R., Chiu, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((EMAN%3A+semiautomated+software+for+high-resolution+single-particle+reconstructions%5BTitle%5D)+AND+%22J+Struct+Biol%22%5BJournal%5D)">EMAN: semiautomated software for high-resolution single-particle reconstructions.</a> J Struct Biol. 128, 82-97 (1999).</li>
<li>Pettersen, E. F., Goddard, T. D., Huang, C. C., Couch, G. S., Greenblatt, D. M., Meng, E. C., Ferrin, T. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((UCSF+Chimera--a+visualization+system+for+exploratory+research+and+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22J+Comput+Chem%22%5BJournal%5D)">UCSF Chimera--a visualization system for exploratory research and analysis.</a> J Comput Chem. 25, 1605-1612 (2004).</li>
<li>Wang, H. W., Wang, J., Ding, F., Callahan, K., Bratkowski, M. A., Buttler, J. S., Nogales, E., Ke, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Architecture+of+the+yeast+Rrp44+exosome+complex+suggests+routes+of+RNA+recruitment+for+3%27+end+processing%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+USA%22%5BJournal%5D)">Architecture of the yeast Rrp44 exosome complex suggests routes of RNA recruitment for 3' end processing.</a> Proc Natl Acad Sci USA. 104, 16844-16849 (2007).</li>
<li>Scheres, S. H., Nunez-Ramirez, R., Sorzano, C. O., Carazo, J. M., Marabini, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Image+processing+for+electron+microscopy+single-particle+analysis+using+Xmipp%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Image processing for electron microscopy single-particle analysis using Xmipp.</a> Nat Protoc. 3, 977-990 (2008).</li>
<li>Yoshioka, C., Pulokas, J., Fellmann, D., Potter, C. S., Milligan, R. A., Carragher, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Automation+of+random+conical+tilt+and+orthogonal+tilt+data+collection+using+feature-based+correlation%5BTitle%5D)+AND+%22J+Struct+Biol%22%5BJournal%5D)">Automation of random conical tilt and orthogonal tilt data collection using feature-based correlation.</a> J Struct Biol. 159, 335-346 (2007).</li>
</ol>

Não há conflitos de interesse declarados.

Neste artigo apresentamos um protocolo detalhado de preparação de amostras e reconstrução tridimensional do complexo exossomo meio de microscopia eletrônica negativa coloração. Usando este método, obtivemos a reconstrução em 3D usando o método aleatório inclinação cônica sem qualquer conhecimento prévio da estrutura. Método aleatório inclinação cônica não exige necessariamente uma amostra homogênea, mas o seguinte projeção passo de refinamento de correspondência seria necessário uma amostra homogênea a fim de alcançar e...

<table><tbody><tr><td>Resina de Formaldeído de Polivinil</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>63450-15-7</td><td></td></tr><tr><td>Formiato de Urânio</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>22451</td><td></td></tr><tr><td>Lâminas Microscópicas Superfrost</td><td>Thermo Fisher Scientific, Inc.</td><td>4951F-001</td><td></td></tr><tr><td>Grade de 400 mesh regular</td><td>SPI Supplies</td><td>3040C</td><td></td></tr><tr><td>Recobridor de carbono Auto 306</td><td>Edwards Lifesciences</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Microscópio Eletrônico Tecnai-12</td><td>FEI</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Descarregador por Ionização</td><td>BAL-TEC</td><td></td><td>Recobridor por Espalhamento SCD 005</td></tr></tbody></table>

Única partícula reconstrução microscopia eletrônica do complexo exossomo usando o método tilt aleatório conical

Single Particle Electron Microscopy Reconstruction of the Exosome Complex Using the Random Conical Tilt Method

Microscopia eletrônica única partícula (EM) de reconstrução recentemente se tornou uma ferramenta popular para obter a estrutura tridimensional (3D) de complexos macromoleculares grandes. Comparado a cristalografia de raios X, ele tem algumas vantagens exclusivas. Primeiro, única partícula EM reconstrução não precisa cristalizar a amostra de proteína, que é o gargalo em cristalografia de raios X, especialmente para grandes complexos macromoleculares. Em segundo lugar, ele não precisa de grandes quantidades de amostras de proteínas. Em comparação com miligramas de proteínas necessárias para a cristalização, única partícula de reconstrução EM só precisa de vários micro-litros de solução de proteína em concentrações nano-molar, utilizando o método de coloração negativa EM. No entanto, apesar de uma assembleias macromolecular poucos com simetria de alta, única partícula EM é limitada a uma resolução relativamente baixa (inferior a 1 nm Resolução) para muitos espécimes especialmente aqueles sem simetria. Esta técnica também é limitada pelo tamanho das moléculas em estudo, ou seja, 100 kDa para os espécimes negativamente coradas e 300 kDa para congelados hidratado espécimes em geral. Para uma nova amostra de estrutura desconhecida, geralmente usamos uma solução de metais pesados ​​para incorporar as moléculas através da coloração negativa. A amostra é então examinado em um microscópio eletrônico de transmissão de tomar duas dimensões (2D) micrografias das moléculas. Idealmente, as moléculas de proteína têm uma estrutura homogênea 3D, mas apresentam diferentes orientações na micrografias. Essas micrografias são digitalizadas e processadas em computadores como &quot;partículas single&quot;. Usando dois-dimensional de alinhamento e técnicas de classificação, as moléculas homogêneas no mesmos pontos de vista são agrupados em classes. Suas médias melhorar o sinal de formas 2D da molécula. Depois vamos atribuir as partículas com a orientação adequada relativa (ângulos de Euler), seremos capazes de reconstruir as imagens das partículas 2D em um volume 3D virtual. Na única partícula de reconstrução 3D, é um passo essencial para atribuir corretamente a orientação adequada de cada partícula. Existem vários métodos para atribuir o ponto de vista de cada partícula, incluindo a reconstituição angular 1 e aleatória cônica tilt método (RCT) 2. Neste protocolo, descrevemos nossa prática no sentido de obter a reconstrução 3D do complexo levedura exossomo usando coloração negativa EM e RCT. Deve-se notar que o nosso protocolo de microscopia eletrônica e processamento de imagem segue o princípio básico da RCT, mas não é a única maneira de executar o método. Primeiro, descrevem como incorporar a amostra de proteína em uma camada de uranilo Formate com uma espessura comparável ao tamanho da proteína, utilizando uma grade de carbono holey coberto com uma camada de película de carbono contínua fina. Em seguida, a amostra é inserida em um microscópio eletrônico de transmissão de recolher untilted (0 graus) e inclinada (55 graus) pares de micrografias, que será usado posteriormente para o processamento e obtenção de um modelo inicial em 3D do exossomo levedura. Para este fim, realizamos RCT e refinar o modelo inicial em 3D usando o método de projeção combinando refinamento 3.

Este artigo descreve um método padrão para obter uma reconstrução tridimensional (3D) de macromoléculas biológicas por microscopia eletrônica de coloração negativa (EM). Neste protocolo, vamos explicar como obter a estrutura 3D do complexo exossomo Saccharomyces cerevisiae em média resolução usando o método de reconstrução cônica aleatória de inclinação (RCT).

Única partícula Reconstrução Microscopia Eletrônica do Complexo exossomo Usando o método Tilt Aleatório Conical

A reconstrução por microscopia eletrônica (ME) de partícula única tornou-se recentemente uma ferramenta popular para obter a estrutura tridimensional (3D) de grandes...

O objetivo geral do experimento a seguir é obter a estrutura tridimensional do complexo do exossomo utilizando o método de inclinação cônica aleatória. Isso é alcançado primeiro depositando uma fina camada de filme de carbono sobre a grade de carbono perfurada para formar o substrato de suporte para o complexo proteico e, em um segundo passo, para o corante. O espécime e o corante são aplicados sobre a grade, o que enterra o espécime em sais de metais pesados.A microscopia eletrônica é então realizada para obter pares de inclinação de micrografias do espécime. Por fim, são obtidos resultados que mostram a estrutura tridimensional do complexo de exossomos com base na análise de imagens utilizando o método de inclinação cônica aleatória. Geralmente, indivíduos novos neste método terão dificuldades, pois, às vezes, o bom preparo do espécime para o método de inclinação cônica aleatória é difícil, bem como o procedimento para o processamento de imagens que segue a Visualização.A demonstração deste método é fundamental, pois os passos de classificação e preparação da amostra são difíceis de aprender sem uma ilustração da avaliação da amostra. O princípio do método de inclinação cônica al

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Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Este vídeo descreve a técnica para preparar uma seção fina de exossomos incorporados. Essas seções podem ser coradas e fotografadas usando microscopia eletrônica de transmissão, ou TEM, para estudar as características estruturais dos exossomos.

Seccionamento, coloração e imagem TEM de exossomos incorporados: um protocolo para visualizar as características estruturais de exossomos usando TEM

O líquido biliar é uma fonte valiosa de vesículas/exossomos extracelulares que contêm biomarcadores potencialmente importantes. Este protocolo representa um método robusto para isolar exossomos da bile humana para análises adicionais, incluindo perfis de miRNA.

Isolamento e Caracterização do perfil de exossomas de bílis humana contendo MicroRNA-

Este artigo apresenta um protocolo para processamento de imagens cryo-EM usando o software suite SPHIRE. O presente protocolo pode ser aplicado para quase todos os projetos de EM de partículas individuais que visam a resolução quase atômica.

Análise de uma única partícula de alta resolução a partir de imagens de crio-microscopia de elétrons usando SPHIRE

Este protocolo descreve as várias técnicas necessárias para microscopia eletrônica de transmissão incluindo coloração negativa, seccionamento ultrafinos de estrutura detalhada e imuno-ouro rotulagem para determinar as posições de proteínas específicas em exosomes.

Preparação da amostra e a imagem latente de Exosomes por microscopia eletrônica de transmissão

A análise de partículas únicas na microscopia crio-elétron é uma das principais técnicas utilizadas para determinar a estrutura dos conjuntos biológicos em alta resolução. A Scipion fornece as ferramentas para criar todo o gasoduto para processar as informações adquiridas pelo microscópio e alcançar uma reconstrução 3D do espécime biológico.

Crio-EM e Análise de Partículas Únicas com Scipion

A determinação da estrutura dos complexos macromoleculares utilizando o crioEM tornou-se rotina para certas classes de proteínas e complexos. Aqui, este pipeline é resumido (preparação de amostras, triagem, aquisição e processamento de dados) e os leitores são direcionados para recursos e variáveis mais detalhados que podem ser alterados no caso de espécimes mais desafiadores.

Microscopia crio-elétron de partículas únicas: da amostra à estrutura

A microscopia de reconstrução óptica estocástica direta (dSTORM) é usada para contornar o limite típico de difração de microscopia leve e para visualizar exosóis na escala de nanômetros. Pode ser empregado em duas e três dimensões para caracterizar exossomos.

Microscopia de Reconstrução Óptica Estocástica Direta de Vesículos Extracelulares em Três Dimensões

Este artigo descreve como utilizar efetivamente três plataformas de processamento crio-EM, ou seja, crioSPARC v3, RELION-3 e Scipion 3, para criar um fluxo de trabalho único e robusto aplicável a uma variedade de conjuntos de dados de partículas únicas para determinação da estrutura de alta resolução.

Um fluxo de trabalho robusto de crio-elétron de partículas únicas (crio-EM) com cryoSPARC, RELION e Scipion

Septinas são proteínas citoesqueléticos. Eles interagem com membranas lipídicas e podem sentir, mas também gerar curvatura de membrana na escala de míces. Descrevemos neste protocolo metodologias in vitro para analisar deformações de membrana, ligação de septina sensível à curvatura e ultraestrutura de filamento de septina.

Métodos in vitro de baixo para cima para avaliar a organização ultraestrutural, remodelação da membrana e comportamento de sensibilidade da curvatura dos septinos

O presente protocolo descreve um esquema generalizado e de fácil implementação para coleta de dados de partícula única inclinada em experimentos de crio-EM. Tal procedimento é especialmente útil para a obtenção de um mapa EM de alta qualidade para amostras que sofrem de viés de orientação preferencial devido à aderência à interface ar-água.

Coleta de dados crio-EM de partícula única com inclinação do estágio usando Leginon

Aprenda a reconstrução 3D do complexo exossomo de Saccharomyces cerevisiae por microscopia eletrônica com coloração negativa usando o método de inclinação cônica aleatória. Este protocolo auxilia pesquisadores em biologia estrutural.

Única partícula Reconstrução Microscopia Eletrônica do Complexo exossomo Usando o método Tilt Aleatório Conical

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