Name: Única partícula Reconstrução Microscopia Eletrônica do Complexo exossomo Usando o método Tilt Aleatório Conical (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-03-28T14:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 10 s
Description: Aprenda a reconstrução 3D do complexo exossomo de Saccharomyces cerevisiae por microscopia eletrônica com coloração negativa usando o método de inclinação cônica aleatória. Este protocolo auxilia pesquisadores em biologia estrutural.

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Os autores gostariam de agradecer aos membros de Nogales laboratório na Universidade da Califórnia-Berkeley em ajudar a estabelecer os protocolos iniciais e os membros do Wang laboratório na Universidade de Yale em sua ajuda para estabelecer os protocolos completa. Reconhecemos também as equipes em crio-EM facilidade e alto desempenho Centro de Computação na Universidade de Yale School of Medicine, pelo seu apoio. HW é um Smith Família premiado.

<ol><li>van Heel, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Angular+reconstitution%3A+a+posteriori+assignment+of+projection+directions+for+3D+reconstruction%5BTitle%5D)+AND+%22Ultramicroscopy%22%5BJournal%5D)">Angular reconstitution: a posteriori assignment of projection directions for 3D reconstruction.</a> Ultramicroscopy. 21, 111-123 (1987).</li>
<li>Radermacher, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three-dimensional+reconstruction+of+single+particles+from+random+and+nonrandom+tilt+series%5BTitle%5D)+AND+%22J+Electron+Microsc+Tech%22%5BJournal%5D)">Three-dimensional reconstruction of single particles from random and nonrandom tilt series.</a> J Electron Microsc Tech. 9, 359-394 (1988).</li>
<li>Penczek, P. A., Grassucci, R. A., Frank, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+ribosome+at+improved+resolution%3A+new+techniques+for+merging+and+orientation+refinement+in+3D+cryo-electron+microscopy+of+biological+particles%5BTitle%5D)+AND+%22Ultramicroscopy%22%5BJournal%5D)">The ribosome at improved resolution: new techniques for merging and orientation refinement in 3D cryo-electron microscopy of biological particles.</a> Ultramicroscopy. 53, 251-270 (1994).</li>
<li>Ohi, M., Li, Y., Cheng, Y., Walz, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Negative+staining+and+image+classification+-+powerful+tools+in+modern+electron+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Biol+Proced+Online%22%5BJournal%5D)">Negative staining and image classification - powerful tools in modern electron microscopy.</a> Biol Proced Online. 6, 23-34 (2004).</li>
<li>Frank, J., Radermacher, M., Penczek, P., Zhu, J., Li, Y., Ladjadj, M., Leith, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SPIDER+and+WEB%3A+processing+and+visualization+of+images+in+3D+electron+microscopy+and+related+fields%5BTitle%5D)+AND+%22J+Struct+Biol%22%5BJournal%5D)">SPIDER and WEB: processing and visualization of images in 3D electron microscopy and related fields.</a> J Struct Biol. 116, 190-199 (1996).</li>
<li>Shaikh, T. R., Gao, H., Baxter, W. T., Asturias, F. J., Boisset, N., Leith, A., Frank, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SPIDER+image+processing+for+single+particle+reconstruction+of+biological+macromolecules+from+electron+micrographs%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">SPIDER image processing for single particle reconstruction of biological macromolecules from electron micrographs.</a> Nat Protoc. 3, 1941-1974 (2008).</li>
<li>Heel, M. van, Harauz, G., Orlova, E. V., Schmidt, R., Schatz, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+new+generation+of+the+IMAGIC+image+processing+system%5BTitle%5D)+AND+%22J+Struct+Biol%22%5BJournal%5D)">A new generation of the IMAGIC image processing system.</a> J Struct Biol. 116, 17-24 (1996).</li>
<li>Ludtke, S. J., Baldwin, P. R., Chiu, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((EMAN%3A+semiautomated+software+for+high-resolution+single-particle+reconstructions%5BTitle%5D)+AND+%22J+Struct+Biol%22%5BJournal%5D)">EMAN: semiautomated software for high-resolution single-particle reconstructions.</a> J Struct Biol. 128, 82-97 (1999).</li>
<li>Pettersen, E. F., Goddard, T. D., Huang, C. C., Couch, G. S., Greenblatt, D. M., Meng, E. C., Ferrin, T. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((UCSF+Chimera--a+visualization+system+for+exploratory+research+and+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22J+Comput+Chem%22%5BJournal%5D)">UCSF Chimera--a visualization system for exploratory research and analysis.</a> J Comput Chem. 25, 1605-1612 (2004).</li>
<li>Wang, H. W., Wang, J., Ding, F., Callahan, K., Bratkowski, M. A., Buttler, J. S., Nogales, E., Ke, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Architecture+of+the+yeast+Rrp44+exosome+complex+suggests+routes+of+RNA+recruitment+for+3%27+end+processing%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+USA%22%5BJournal%5D)">Architecture of the yeast Rrp44 exosome complex suggests routes of RNA recruitment for 3' end processing.</a> Proc Natl Acad Sci USA. 104, 16844-16849 (2007).</li>
<li>Scheres, S. H., Nunez-Ramirez, R., Sorzano, C. O., Carazo, J. M., Marabini, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Image+processing+for+electron+microscopy+single-particle+analysis+using+Xmipp%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Image processing for electron microscopy single-particle analysis using Xmipp.</a> Nat Protoc. 3, 977-990 (2008).</li>
<li>Yoshioka, C., Pulokas, J., Fellmann, D., Potter, C. S., Milligan, R. A., Carragher, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Automation+of+random+conical+tilt+and+orthogonal+tilt+data+collection+using+feature-based+correlation%5BTitle%5D)+AND+%22J+Struct+Biol%22%5BJournal%5D)">Automation of random conical tilt and orthogonal tilt data collection using feature-based correlation.</a> J Struct Biol. 159, 335-346 (2007).</li>
</ol>

Não há conflitos de interesse declarados.

Neste artigo apresentamos um protocolo detalhado de preparação de amostras e reconstrução tridimensional do complexo exossomo meio de microscopia eletrônica negativa coloração. Usando este método, obtivemos a reconstrução em 3D usando o método aleatório inclinação cônica sem qualquer conhecimento prévio da estrutura. Método aleatório inclinação cônica não exige necessariamente uma amostra homogênea, mas o seguinte projeção passo de refinamento de correspondência seria necessário uma amostra homogênea a fim de alcançar e...

<table><tbody><tr><td>Resina de Formaldeído de Polivinil</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>63450-15-7</td><td></td></tr><tr><td>Formiato de Urânio</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>22451</td><td></td></tr><tr><td>Lâminas Microscópicas Superfrost</td><td>Thermo Fisher Scientific, Inc.</td><td>4951F-001</td><td></td></tr><tr><td>Grade de 400 mesh regular</td><td>SPI Supplies</td><td>3040C</td><td></td></tr><tr><td>Recobridor de carbono Auto 306</td><td>Edwards Lifesciences</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Microscópio Eletrônico Tecnai-12</td><td>FEI</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Descarregador por Ionização</td><td>BAL-TEC</td><td></td><td>Recobridor por Espalhamento SCD 005</td></tr></tbody></table>

Única partícula reconstrução microscopia eletrônica do complexo exossomo usando o método tilt aleatório conical

Single Particle Electron Microscopy Reconstruction of the Exosome Complex Using the Random Conical Tilt Method

Microscopia eletrônica única partícula (EM) de reconstrução recentemente se tornou uma ferramenta popular para obter a estrutura tridimensional (3D) de complexos macromoleculares grandes. Comparado a cristalografia de raios X, ele tem algumas vantagens exclusivas. Primeiro, única partícula EM reconstrução não precisa cristalizar a amostra de proteína, que é o gargalo em cristalografia de raios X, especialmente para grandes complexos macromoleculares. Em segundo lugar, ele não precisa de grandes quantidades de amostras de proteínas. Em comparação com miligramas de proteínas necessárias para a cristalização, única partícula de reconstrução EM só precisa de vários micro-litros de solução de proteína em concentrações nano-molar, utilizando o método de coloração negativa EM. No entanto, apesar de uma assembleias macromolecular poucos com simetria de alta, única partícula EM é limitada a uma resolução relativamente baixa (inferior a 1 nm Resolução) para muitos espécimes especialmente aqueles sem simetria. Esta técnica também é limitada pelo tamanho das moléculas em estudo, ou seja, 100 kDa para os espécimes negativamente coradas e 300 kDa para congelados hidratado espécimes em geral. Para uma nova amostra de estrutura desconhecida, geralmente usamos uma solução de metais pesados ​​para incorporar as moléculas através da coloração negativa. A amostra é então examinado em um microscópio eletrônico de transmissão de tomar duas dimensões (2D) micrografias das moléculas. Idealmente, as moléculas de proteína têm uma estrutura homogênea 3D, mas apresentam diferentes orientações na micrografias. Essas micrografias são digitalizadas e processadas em computadores como &quot;partículas single&quot;. Usando dois-dimensional de alinhamento e técnicas de classificação, as moléculas homogêneas no mesmos pontos de vista são agrupados em classes. Suas médias melhorar o sinal de formas 2D da molécula. Depois vamos atribuir as partículas com a orientação adequada relativa (ângulos de Euler), seremos capazes de reconstruir as imagens das partículas 2D em um volume 3D virtual. Na única partícula de reconstrução 3D, é um passo essencial para atribuir corretamente a orientação adequada de cada partícula. Existem vários métodos para atribuir o ponto de vista de cada partícula, incluindo a reconstituição angular 1 e aleatória cônica tilt método (RCT) 2. Neste protocolo, descrevemos nossa prática no sentido de obter a reconstrução 3D do complexo levedura exossomo usando coloração negativa EM e RCT. Deve-se notar que o nosso protocolo de microscopia eletrônica e processamento de imagem segue o princípio básico da RCT, mas não é a única maneira de executar o método. Primeiro, descrevem como incorporar a amostra de proteína em uma camada de uranilo Formate com uma espessura comparável ao tamanho da proteína, utilizando uma grade de carbono holey coberto com uma camada de película de carbono contínua fina. Em seguida, a amostra é inserida em um microscópio eletrônico de transmissão de recolher untilted (0 graus) e inclinada (55 graus) pares de micrografias, que será usado posteriormente para o processamento e obtenção de um modelo inicial em 3D do exossomo levedura. Para este fim, realizamos RCT e refinar o modelo inicial em 3D usando o método de projeção combinando refinamento 3.

Este artigo descreve um método padrão para obter uma reconstrução tridimensional (3D) de macromoléculas biológicas por microscopia eletrônica de coloração negativa (EM). Neste protocolo, vamos explicar como obter a estrutura 3D do complexo exossomo Saccharomyces cerevisiae em média resolução usando o método de reconstrução cônica aleatória de inclinação (RCT).

Única partícula Reconstrução Microscopia Eletrônica do Complexo exossomo Usando o método Tilt Aleatório Conical

A reconstrução por microscopia eletrônica (ME) de partícula única tornou-se recentemente uma ferramenta popular para obter a estrutura tridimensional (3D) de grandes...

O objetivo geral do experimento a seguir é obter a estrutura tridimensional do complexo do exossomo utilizando o método de inclinação cônica aleatória. Isso é alcançado primeiro depositando uma fina camada de filme de carbono sobre a grade de carbono perfurada para formar o substrato de suporte para o complexo proteico e, em um segundo passo, para o corante. O espécime e o corante são aplicados sobre a grade, o que enterra o espécime em sais de metais pesados.A microscopia eletrônica é então realizada para obter pares de inclinação de micrografias do espécime. Por fim, são obtidos resultados que mostram a estrutura tridimensional do complexo de exossomos com base na análise de imagens utilizando o método de inclinação cônica aleatória. Geralmente, indivíduos novos neste método terão dificuldades, pois, às vezes, o bom preparo do espécime para o método de inclinação cônica aleatória é difícil, bem como o procedimento para o processamento de imagens que segue a Visualização.A demonstração deste método é fundamental, pois os passos de classificação e preparação da amostra são difíceis de aprender sem uma ilustração da avaliação da amostra. O princípio do método de inclinação cônica aleatória exige a obtenção de um par de micrografias da mesma região de um espécime no interior do microscópio eletrônico. Uma imagem é obtida com o espécime em posição não inclinada, e a outra imagem é obtida com o espécime inclinado em um ângulo entre 50 e 70 graus. Usando o computador, o par de micrografias digitalizadas é colocado lado a lado e as imagens das mesmas partículas são selecionadas nesta ilustração.Essas imagens são marcadas por números em coordenadas tridimensionais. As imagens de partículas não inclinadas e seus pares inclinados são correlacionadas entre si pela direção do eixo de inclinação e pelo ângulo de inclinação. O alinhamento das imagens de partículas não inclinadas traz as imagens das partículas inclinadas para suas respectivas localizações correspondentes; utilizando múltiplas imagens de partículas inclinadas que preenchem o espaço azimutal, a estrutura tridimensional da molécula pode ser reconstruída usando um algoritmo de retroprojeção. Para fabricar as grades primeiro, prepare uma solução de 0,5% de form VAR adicionando 0,45 gramas de resina de polivinil formal e 90 mililitros de clorofórmio a um béquer de vidro de 100 mililitros.Em uma capela de exaustão, cubra o béquer com papel de alumínio e dissolva a resina de formvar. Com o auxílio de um pequeno bastão de agitação e um agitador magnético, a resina leva cerca de 15 minutos para se dissolver. Enquanto isso, limpe lâminas de vidro para microscopia previamente limpas com metanol e com lenços Kim.Após a resina de formvar estar completamente dissolvida em clorofórmio, adicione um mililitro de glicerol a 50% à superfície da solução. O ajuste do volume de glicerol adicionado afeta a densidade dos orifícios no carbono perfurado.Incline a ponta de um ultrassom na solução. A uma profundidade de cerca de 2,5 cm, use potência máxima para sonicação por um minuto, o que formará uma emulsão de gotículas de glicerol na forma da nossa solução. Uma sonicação mais prolongada causará um tamanho menor dos poros no carbono poroso.A solução fica turva após esta etapa. Imediatamente após a imersão na sonicação, mergulhe verticalmente lâminas de vidro limpas na emulsão. Retire-as após um segundo e seque a parte inferior das lâminas usando papel filtro para formar uma película fina de plástico sobre a superfície das lâminas.Após a evaporação do clorofórmio, verifique a densidade e o tamanho dos orifícios no filme sob um microscópio óptico. A condição de preparação descrita aqui deve produzir de 10 a 20 orifícios em cada quadrado de uma grade de 400 malhas com diâmetros entre três e quatro micrômetros. Assim que as lâminas de vidro estiverem secas, corte a borda do filme plástico na superfície da lâmina.Deixe a película flutuar na superfície da água destilada mergulhando verticalmente a lâmina na água. A película fina na superfície da água pode ser observada em um ângulo rasante contra o reflexo da luz. Coloque grades de cobre de 400 malhas sobre a película, uma a uma, com a superfície lisa da grade voltada para baixo.Retire o filme plástico com as grades usando uma folha de papel. Vire o papel e deixe secar. Em uma placa de Petri, mergulhe o papel em metanol para remover o glicerol residual nos orifícios e deixe o papel secar ao ar.Use um evaporador de carbono para revestir as grades com uma camada de carbono com espessura de aproximadamente 20 nanômetros. Utilize o tempo de evaporação para controlar a espessura desejada. A espessura pode ser determinada pela cor cinza do carbono, comparada com a cor cinza de uma camada de carbono de espessura conhecida.Deixe os suportes com camada de carbono embebidos em clorofórmio em uma placa de Petri de vidro por meia hora para remover a resina formvar; a secagem subsequente dos suportes resulta em suportes de carbono perfurados caseiros. Em seguida, evapore uma fina camada de carbono com cerca de cinco nanômetros de espessura sobre uma superfície de mica recém-cindida. Depois, coloque cuidadosamente os suportes de carbono perfurados sobre um pedaço de papel filtro sob água destilada.Em um aparato caseiro, flutue o carbono fino da superfície da mica sobre a superfície da água e deposite-o lentamente sobre as grades de carbono perfurado. Pegue o papel-filtro com as grades e deixe secar. Em uma cabine de segurança, inicie a coloração negativa do complexo de exossomos preparando uma solução fresca de formiato de uranila 2%.Conforme descrito no procedimento escrito, cubra o tubo da solução com um pedaço de papel alumínio para evitar a exposição à luz; a solução deve ser usada no mesmo dia. Submeta uma grade de carbono fina a descarga luminiscente usando um aparelho de descarga luminiscente. Em seguida, coloque um pedaço limpo de película parafilm sobre a bancada e pipete três gotas de 50 microlitros da solução de corante de formiato de uranila sobre o parafilm, dilua o complexo de exossomo até uma concentração de aproximadamente 50 nanomolar usando tampão de diluição e pipete quatro microlitros da proteína diluída sobre a grade submetida à descarga luminiscente.Deixe a amostra permanecer na grade por um minuto, depois remova a solução residual com um pedaço de papel-filtro usando pinças. Vire imediatamente a grade sobre a primeira gota do corante e lave a grade movendo-a para frente e para trás várias vezes durante cerca de 10 segundos. Repita este processo para cada uma das três gotas de corante; após a última lavagem, deixe o corante permanecer na grade por mais um minuto.Em seguida, remova a coloração com um pedaço de papel filtro. Mantenha uma camada fina da solução de corante sobre a superfície da grade e deixe a grade secar em uma cabine de segurança. Coloque a grade da amostra no porta-amostras e, em seguida, insira o porta-amostras em um microscópio eletrônico FEI TE nine 12.Verifique a grade da amostra em baixa ampliação para encontrar os melhores quadrados corados. Um bom quadrado parece ter cerca de uma dúzia de orifícios com dimensões de aproximadamente um a dois micrômetros e áreas escuras coradas dentro deles. Ative o modo de baixa dose da interface do usuário FEI e alinhe o foco de busca e a posição de exposição no modo de baixa dose.Configure a busca no modo de fração com comprimento da câmera de 1,5 metro. Ajuste o foco para ampliação de 150 K e configure a exposição para ampliação de 50 K com tempo de exposição medido de um segundo. Normalmente, uma característica reconhecível na grade em ambos os modos, de busca e de exposição, é utilizada para realizar o alinhamento.Encontre os orifícios com boa coloração no modo de busca e salve as localizações. Tire uma imagem CCD do quadrado. Incline o espécime para 55 graus e tire outra imagem.Compare as duas imagens e identifique os orifícios pareados nas duas micrografias. Incline o estágio de volta para zero graus. Use o kit de baixa dose para tirar imagens de cada orifício identificado no modo de busca com alta ampliação e um desfoque de cerca de menos 0,7 micrômetros.Após terem sido tiradas imagens de todos os orifícios, incline o estágio para 55 graus usando a mesma ampliação. Tire micrografias do espécime inclinado com um desfoque de aproximadamente menos 1,2 micrômetros. Identifique o par correspondente de micrografias inclinadas com base nos padrões das micrografias de baixa ampliação, utilizando o padrão irregular das grades de carbono perfurado caseiras.Para auxiliar a correlação, escolha pares de micrografias com inclinação que apresentem partículas com distribuição uniforme e sem halos ao redor das partículas. As micrografias com halos evidentes de corante ao redor delas devem ser descartadas para o processamento dos dados. Inicie com a configuração do programa no procedimento.A processamento de imagens será demonstrado utilizando o processo 2D no pacote Eman. Para alterar o formato da imagem, use o pacote iMagic cinco para realizar o alinhamento 2D e o pacote spider. Para realizar a reconstrução e refinamento 3D, converta a imagem digital DM3 da Gatan para o formato de imagem spider.Usando o comando process 2D, selecione os pares de partículas. Utilizando o programa web distribuído no pacote do programa spider, o programa salva automaticamente as coordenadas das partículas, recortando todas as partículas selecionadas com o script spider. O script salva as pilhas de partículas inclinadas e não inclinadas.Converta as partículas inclinadas de UN para o formato IMAG cinco. Utilizando o programa EM dois EM com filtro de banda passante, filtre e máscare as partículas inclinadas de UN usando o comando InCorp prep no IMAG cinco e centralize as partículas mascaradas com o filtro de banda passante utilizando o comando center. No IMAG cinco, alinhe e classifique iterativamente as partículas em classes homogêneas usando um script em lote que executa automaticamente os programas do IMAG cinco.Em seguida, utilize os nomes de MSA no comando class no IMAG cinco para gerar a tabela de consulta da classe das partículas e gere um arquivo de gráfico para os valores de translação e rotação do alinhamento de cada partícula usando o comando header. No iMagic cinco, converta as partículas alinhadas para o formato spider utilizando o programa EM dois EM. Em seguida, transforme a tabela de consulta das classes em arquivos de documento spider.Os valores de translação e rotação do alinhamento para cada partícula também são convertidos em um arquivo de documento spider com filtro passa-faixa, máscara e centralização das partículas inclinadas da mesma forma que para as partículas não inclinadas na IMAG cinco, gerando um novo conjunto de dados para as partículas inclinadas centralizadas. Crie arquivos de documento angulares a partir dos documentos de alinhamento multirreferência gerados pela IMAG cinco e os arquivos DCB gerados pelo programa web. Utilize o script de retroprojeção no spider para obter um modelo inicial para cada média de classe.Finalmente, realize o refinamento por projeção do volume inicial usando o script spider contra todas as partículas não inclinadas para obter o volume final usando RCT. Cerca de 50 reconstruções do exossomo foram obtidas. Os volumes são gerados a partir de partículas inclinadas correspondentes a cada partícula nas 50 classes de partículas não inclinadas.Utilizando a retroprojeção implementada no pacote spider, o refinamento por correspondência de projeção foi então realizado usando esses volumes como modelos iniciais, e o volume tridimensional exibido do exossomo foi gerado com resolução de aproximadamente 18 angstroms. Em seguida, podemos encaixar os modelos atômicos de diferentes partes do complexo no mapa tridimensional. Após assistir a este vídeo, você deverá ter uma boa compreensão de como usar a RCT para obter reconstruções tridimensionais, desde a geração de uma grade adequada de espécimes até micrografias eletrônicas e, finalmente, à obtenção da reconstrução utilizando técnicas de análise de imagem. Além do protocolo que descrevemos aqui, existem diversos métodos para obter as reconstruções finais na análise de imagens.O passo mais crítico para obter uma reconstrução confiável e correta é trabalhar com um espécime bem preparado.

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JoVE Journal

Biology

Biologia

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