Name: Spinal Cord Eletrofisiologia II: Fabricação Eletrodo de Sucção Extracelular (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-02-20T23:59:00.000+00:00
Duration: 8 min 47 s
Description: Aprenda a fabricar eletrodos de sucção extracelulares para registrar sinais eletrofisiológicos em medulas espinhais de roedores neonatos in vitro. Este método utiliza tubos de plástico PE 90 e lâmpada de álcool.

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Samuel L. Pfaff é professor no Laboratório de Expressão Gênica do Instituto Salk para Estudos Biológicos e um investigador no Instituto Médico Howard Hughes. Este trabalho foi financiado pelo Christopher Reeve e Dana Foundation. Joe Belcovson, Kent Schnoeker e Mike Sullivan em Recursos Multimídia do Instituto Salk prestou assistência com a fotografia e edição.

Gravações eletrofisiológicas de isolados medula espinhal pode revelar mudanças genéticas e de desenvolvimento de um circuito neural. Nós já demonstraram um método para dissecar os cabos do mouse neonatal da coluna vertebral 2. Aqui apresentamos um método para preparar eletrodos de sucção útil na gravação de locomoção fictícia na medula espinhal isolado 3. A ponta de um eletrodo de tubos de plástico podem ser atraídos para uma ponta muito fina à mão usando uma lâmpada de álcool a baixas temperaturas 3-5. O tubo de plástico (PE90, Clay Adams Intramedic TM) é realizada sobre a chama para suavizar o tubo em uma forma maleável. Como o tubo começa a derreter e se torna mais transparente ele é removido da fonte de calor e as extremidades são delicadamente separados. O momento de retirar o tubo da chama é importante para garantir o plástico não colapso ou dividir, enquanto sendo desenhado. A porção fina do tubo é cortado com uma lâmina de barbear de acordo com o diâmetro desejado interna, como ditado pela idade do espécime ou o nível segmentar da medula. Para facilitar a colocação de um o-ring no tubo, um corte de 45 ° é feita no final de espessura da tubulação com uma lâmina de barbear. A ponteira e o-ring são instalados na extremidade grossa para prender a ponta do eletrodo para o barril do eletrodo. Para permitir especificamente eletrodos de tamanho e evitar as dificuldades de mão-de puxar dicas eletrodo, eletrodos podem ser construídas usando tubos de pequeno inserido em um grosso tubo (PE90). Os comprimentos dos tubos são específicos para os requisitos da configuração de gravação e são variáveis. Nós apresentamos as medidas utilizadas em nossos experimentos 1-3,5. Um comprimento 1cm de PTFE tubo fino (Zeus, peças pequenas) e um comprimento de 10 cm de tubos PE90 são cortados com uma lâmina de barbear. As extremidades do tubo de pequeno porte devem ser examinados para ter certeza de que eles não são esmagados ou fechada. Eles podem ser abertos com um pino de insetos (Ferramentas Ciência Fine). Uma gota de adesivo (JB Weld) é colocado no ponto médio do tubo de PTFE. A tubagem de PTFE e adesivo são atraídos para a tubulação de sucção PE90 usando boca no tubo PE90. Um corte de 45 ° é feita no final de espessura da tubulação e uma ponteira e o-ring são fixos, como anterior. O conector BNC e ponteira são desaparafusado a partir de um eletrodo de sucção comerciais. O conector BNC é embebido em xilol por uma hora para remover o lacre de cera. O conector é então lavado com água e seca. Uma porta lateral inferior em ângulo deve ser feita no lado do barril. Uma haste de metal é aquecido através de um bico de Bunsen e pressionado para dentro do buraco existente na lateral do barril em um ângulo baixo. Um comprimento 15 centímetros de fio de prata 0,010 polegadas (AM Systems) é cortado e embebido em lixívia para 15 minutos. Isto é feito para criar um revestimento de cloreto de prata que ajuda na condução de sinal 6. O fio é lavado com água, secos, e então soldada no conector BNC. O fio conector BNC e prata são inseridos no barril eletrodo de sucção com espaço suficiente para o conector BNC para permanecer ao lado do barril. Tubo de sucção é inserido na porta lateral 2-3cm. Selante de silicone é injetado dentro do cano de aproximadamente 2-3cm. O conector BNC é enfiada para o barril do eletrodo empurrando o selante para a frente. A ponta do eletrodo está agora inserido no front end do eletrodo. Tubulação do psiquiatra também pode ser adicionado para reforçar a linha de sucção da porta lateral. Eletrodos são montados em micromanipuladores que estão ligados ao descanso magnético, e colocado perto do prato de gravação. BNC cabos coaxiais são conectados a um headstage que é ligado a um amplificador. O amplificador é conectado a um adaptador (PolyView) que é conectado a uma placa de analógico para digital (National Instruments) em um computador PC com software de aquisição de dados (PolyView). Ao gravar dados eletrofisiológicos, é necessário eliminar todas as interferências externas. O prato de gravação, amplificador, e palco de cabeça são colocados em uma mesa de ar dentro de uma gaiola de Faraday para evitar interferências elétricas e mecânicas, respectivamente. Resultados representativos: <img src="/files/ftp_upload/2580/2580fig1.jpg" alt="Figura 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 1"> Figura 1. Um eletrodo de sucção comercialmente disponíveis podem ser modificadas pela adição de um fio de prata calibre mais pesado e uma ponta de plástico que é desenhado à mão sobre uma lâmpada de álcool, ou construídas com tubos de plástico disponível comercialmente de tamanhos específicos. Além disso, o selante de parafina é substituída com mais duráveis ​​selante de silicone calafetar. <img src="/files/ftp_upload/2580/2580fig2.jpg" alt="Figura 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 2"> Figura 2. Um esquema do eletrodo de sucção em relação à mesa de ar (para isolamento mecânico), gaiola de Faraday (elétrica isolation), amplificador e computador. Deve-se notar que há um terreno referenciado para o prato de gravação e um segundo motivo que é referenciado para a mesa de ar e gaiola de Faraday.

<ol><li>Gallarda, B. W., Sharpee, T. O., Pfaff, S. L., Alaynick, W. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Defining+rhythmic+locomotor+burst+patterns+using+a+continuous+wavelet+transform%5BTitle%5D)+AND+%22Ann+N+Y+Acad+Sci%22%5BJournal%5D)">Defining rhythmic locomotor burst patterns using a continuous wavelet transform.</a> Ann N Y Acad Sci. 1198, 133-139 (2010).</li>
<li>Meyer, A., Gallarda, B. W., Pfaff, S., Alaynick, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spinal+cord+electrophysiology%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Spinal cord electrophysiology.</a> J Vis Exp. , (2010).</li>
<li>Gallarda, B. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Segregation+of+axial+motor+and+sensory+pathways+via+heterotypic+trans-axonal+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Segregation of axial motor and sensory pathways via heterotypic trans-axonal signaling.</a> Science. 320, 233-236 (2008).</li>
<li>Landmesser, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+development+of+motor+projection+patterns+in+the+chick+hind+limb%5BTitle%5D)+AND+%22J+Physiol%22%5BJournal%5D)">The development of motor projection patterns in the chick hind limb.</a> J Physiol. 284, 391-414 (1978).</li>
<li>Myers, C. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cholinergic+input+is+required+during+embryonic+development+to+mediate+proper+assembly+of+spinal+locomotor+circuits%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Cholinergic input is required during embryonic development to mediate proper assembly of spinal locomotor circuits.</a> Neuron. 46, 37-49 (2005).</li>
<li>Chanin, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+determination+of+chloride+by+use+of+the+silver-silver+chloride+electrode%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">The determination of chloride by use of the silver-silver chloride electrode.</a> Science. 119, 323-324 (1954).</li>
<li>Goulding, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Circuits+controlling+vertebrate+locomotion%3A+moving+in+a+new+direction%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Circuits controlling vertebrate locomotion: moving in a new direction.</a> Nat Rev Neurosci. 10, 507-518 (2009).</li>
</ol>

Não há conflitos de interesse declarados.

Desenvolvimento do sistema nervoso podem ser estudadas usando cabos isolados de roedores espinhal. Na presença de neurotransmissores, locomoção fictícia pode ser gerada a partir da medula espinhal na forma de padrões de atividade elétrica 1,3. Estas explosões rítmicas são produzidos em 0,2-0,5 Hz e são estampados em alternâncias esquerda-direita e flexores e extensores. Em diferentes estágios de desenvolvimento, a robustez e os padrões dessa atividade varia 1. Mutações genéticas também podem pertur...

<table><tbody><tr><td>Tubo de PTFE de Parede Fina (tubo pequeno)</td><td>Zeus</td><td>36AWG</td><td>0.005&amp;#8221; ID x 0.003&amp;#8221; de espessura (Peças pequenas). Também disponível em 0.003&amp;#8221; a 0.006&amp;#8221;</td></tr><tr><td>Tubo grande (0,86 mm (0,34&amp;#8221;))</td><td>BD Biosciences</td><td>427420</td><td>0,86 mm (0,34&amp;#8221;) de diâmetro externo, 1,27 mm (0,050&amp;#8221;)</td></tr><tr><td>Corpo do eletrodo</td><td>A-M Systems</td><td>573000</td><td></td></tr><tr><td>Adesivo</td><td>JB Weld</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Adesivo: vedante de silicone</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Estanho e ferro de solda</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Água sanitária</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Xileno</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Fio de prata: 0,010&amp;#8221;</td><td>A-M Systems</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Pinças para insetos: Austerlitz 0,1 mm</td><td>Fine Science Tools</td><td>26002-10</td><td></td></tr><tr><td>Suporte magnético</td><td>Narishige International</td><td>GJ-8</td><td></td></tr><tr><td>Micromanipulador</td><td>Narishige International</td><td>MN 151</td><td></td></tr><tr><td>Miniplaca (estágio de cabeça)</td><td>Grass Technologies</td><td>F-15EB/B1</td><td></td></tr><tr><td>Unidade adaptadora Polyview</td><td>Grass Technologies</td><td>PVA 8</td><td></td></tr><tr><td>Sistema amplificador fisiológico bipolar portátil</td><td>Grass Technologies</td><td>15LT</td><td></td></tr><tr><td>PLACA ANALÓGICA PARA DIGITAL</td><td>National Instruments</td><td>6035E</td><td></td></tr><tr><td>Mesa antivibratória; Vibraplane</td><td>Kinetic Systems</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

spinal cord eletrofisiologia ii: fabricação eletrodo de sucção extracelular

Spinal Cord Electrophysiology II: Extracellular Suction Electrode Fabrication

Desenvolvimento de circuitos neurais e locomoção podem ser estudadas usando neonatal da medula espinhal de roedores centro gerador de padrão de comportamento (CPG). Demonstramos um método para fabricar eletrodos de sucção que são usados ​​para examinar a atividade CPG, ou locomoção fictícia, em cabos de roedores dissecados espinhal. Os cabos de roedor da coluna vertebral são colocados no líquido cefalorraquidiano artificial e as raízes ventral são atraídos para o eletrodo de sucção. O eletrodo é construído através da modificação de um eletrodo de sucção disponível comercialmente. Um fio mais pesado de prata é usado em vez do fio padrão dado pelo eletrodo disponíveis comercialmente. A ponta do eletrodo de vidro em comercial é substituído com uma ponta de plástico para maior durabilidade. Nós preparamos mão eletrodos desenhado e eletrodos feitos de tamanhos específicos de tubos, permitindo a consistência e reprodutibilidade. Os dados são coletados por meio de um amplificador e software de aquisição neurograma. As gravações são realizadas em uma mesa de ar dentro de uma gaiola de Faraday para evitar interferências mecânicas e elétricas, respectivamente.

A demonstração da fabricação e uso de um eletrodo de sucção extracelular usado para medir gravações eletrofisiológicas de cordas de roedores neonatal espinhal<em&gt; In vitro</em

Spinal Cord Eletrofisiologia II: Fabricação Eletrodo de Sucção Extracelular

O desenvolvimento de circuitos neurais e da locomoção pode ser estudado utilizando o comportamento do gerador de padrões centrais (CPG) da medula espinhal de roedores neonatos. Demonstramos...

Olá. Meu nome é Resh Gary Dory, e sou assistente de pesquisa no Laboratório faf do Instituto Salk para Estudos Biológicos. Hoje vou mostrar como fabricar eletrodos de sucção extracelulares usando dois métodos. Esses eletrodos podem ser utilizados para realizar gravações eletrofisiológicas de medulas espinhais in vitro.Use uma lâmpada de álcool como fonte de calor para derreter o tubo plástico PE 90 até a largura desejada. Segure o tubo sobre a chama acesa e remova-o quando começar a derreter, puxando suavemente as extremidades para separá-las, tomando cuidado para não quebrar o centro. Esse processo é mostrado novamente.Remova o tubo conforme ele amolecer e derreter, puxando suavemente as extremidades para separá-las. Corte o tubo com uma lâmina de barbear afiada em um ponto correspondente à largura aproximada da amostra a ser medida na extremidade mais grossa do tubo. Faça um corte em um ângulo de 45 graus.Uma porca feral e uma junta tórica devem agora ser instaladas na extremidade mais grossa. Insira essa extremidade da tubulação através da abertura hexagonal da porca feral. Em seguida, insira a extremidade da tubulação na junta tórica de borracha.Essa montagem será parafusada na parte frontal do eletrodo. Corte um pedaço de tubo pequeno da Zeus com um centímetro de comprimento usando uma lâmina de barbear afiada e inspecione as extremidades para garantir um corte limpo e uma abertura desobstruída. Corte um pedaço de 10 centímetros do tubo PE 90 usando uma lâmina de barbear afiada. Coloque uma gota de cola JB Weld no ponto médio do tubo pequeno utilizando sucção bucal.Puxe a tubulação pequena e a solda para dentro do furo da tubulação grande e deixe este conjunto curar durante a noite. Embora não seja mostrado, deve-se fazer um corte de 45 graus na extremidade grossa desta tubulação, e uma braçadeira e uma junta de vedação devem ser instaladas nesta extremidade. Da mesma forma mostrada anteriormente.Desmonte um eletrodo de sucção padrão, desparafusando o feral da extremidade frontal do eletrodo e o conector BNC da traseira. Agora, deve-se fazer uma porta lateral com ângulo inferior na lateral do corpo do eletrodo. Aqueça um pedaço de metal usando um bico de Bunsen.Pressione o metal aquecido no orifício existente na lateral do barril em um ângulo baixo. Remova o fio de prata do conector BNC puxando o fio no ponto em que se conecta ao conector. Mergulhe o conector BNC em xileno por uma hora para remover a cera.Após a remoção da cera, enxágue o conector em água e seque com toalhas de papel. Corte um pedaço de fio de prata com 15 centímetros de comprimento. Mergulhe o fio em água sanitária por 15 minutos.Em seguida, enxágue e seque com papel toalha. Solde o fio de prata ao conector BNC. Insira o fio de prata na extremidade traseira do corpo do eletrodo de sucção, deixando espaço suficiente para que o conector BNC permaneça ao lado.Insira o tubo de sucção no orifício lateral aproximadamente três centímetros. Injete selante de silicone na abertura traseira do eletrodo de sucção, evitando que ele transborde pelo orifício lateral cobrindo-o com o dedo. Injete o selante aproximadamente dois a três centímetros dentro do corpo do eletrodo.Após a falha, rosqueie firmemente o conector BNC no lugar, o que empurrará o selante para frente. Deixe o selante curar durante a noite. Rosqueie o feral do tubo criado pelo método da ponta puxada ou pelo método da ponta cortada na parte frontal do endireitamento do eletrodo.O tubo ajudará a facilitar a passagem do fio de prata pelo eletrodo, que agora está completo. O conjunto de gravação é colocado dentro de uma gaiola de Faraday para reduzir interferências externas. Nosso arranjo também foi posicionado sobre uma mesa pneumática para eliminar interferências mecânicas.Os eletrodos são montados em micromanipuladores de suporte magnético e posicionados próximos à placa de gravação. Os cabos coaxiais BNC são conectados a uma etapa inicial que está ligada a um amplificador. O amplificador é conectado a um adaptador poly view, que por sua vez é ligado ao computador.Esta configuração é mostrada em close. Os cabos coaxiais BNC estão conectados a uma etapa de cabeçote. A etapa de cabeçote está conectada ao amplificador.A saída do amplificador sai da gaiola de Faraday e é conectada a um adaptador de visualização poli. O adaptador de visualização poli está conectado ao computador, que possui o software de gravação apropriado instalado. Toda a montagem deve ser aterrada corretamente.Um aterramento externo é estabelecido conectando a gaiola de Faraday e a mesa pneumática a um ponto de terra. Um aterramento interno é estabelecido ligando fios do recipiente de dissecação ao estágio de cabeça. Também é necessário aterrar as portas da gaiola ao corpo principal.Com a configuração adequada, os dados agora podem ser coletados. Obrigado por assistir a este vídeo e por ajudar a orientá-lo em seus futuros experimentos.

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