Name: Ion Beam centrada Fresagem e Microscopia Eletrônica de Varredura do Tecido Cerebral (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-07-06T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 57 s
Description: Aprenda a preparar e imaginar tecido cerebral em resina usando microscopia eletrônica de varredura com feixe de íons focalizado. Este método permite obter imagens seriadas tridimensionais de alta resolução para análise estrutural detalhada.

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1. Fixação da amostra e incorporação de resina <ol><li> Amostras de tecido fresco e as células são fixadas por pelo menos duas horas em paraformaldeído 2% e glutaraldeído 2,5% em tampão fosfato 0,1 M em um pH de 7,4. O tamanho da amostra não deve exceder 0,150 milímetro de espessura para permitir a penetração adequada ou fixador, e não deve ser deixado na correção para mais de 12 horas. </li><li> Colocar as amostras em frascos de cintilação 20ml de vidro e lavá-los três vezes, 5 minutos cada, em tampão cacodilato 0,1 M. </li><li> Mancha com 1,5% (w / v) tetróxido de ósmio ferrocianeto de potássio e 1% (w / v) em tampão cacodilato 0,1 M (0,1 M, pH 7,4) por 30 minutos. </li><li> Mancha com tetróxido de ósmio 1,0% (w / v) em tampão cacodilato 0,1 M por 30 minutos. </li><li> Lave uma vez com água destilada duas vezes por 3 minutos. </li><li> Mancha com 1% (w / v) acetato de uranila em água destilada duas vezes por 30 minutos. </li><li> Enxágüe seções por 5 minutos em água destilada duas vezes, e depois desidratar em série de álcool graduada, 2 minutos cada mudança (1 x 50%, 1 x 70%, 1 x 90%, 1 x 95%, 2 x 100%). </li><li> Incorporar em concentrações crescentes de resina Durcupan misturado com etanol, 30 minutos cada mudança, a partir de Durcupan 50% em etanol, seguido por: 70%, 90%, 95%, e depois de 100%. </li><li> Substituir com Durcupan fresca e agitar lentamente por 4 horas. </li><li> Seções lugar, usando palitos cocktail de madeira, em microscópios lâminas de vidro revestidas com agente molde de separação, e colocar em 65 ° C forno por 24 horas. </li></ol> 2. Preparação da amostra para o FIB / SEM <ol start="11"><li> Separar a camada de resina, contendo as amostras, de entre as duas lâminas de microscópio de vidro e lave bem para remover todo o molde separar agente. </li><li> Usando um microscópio de luz transmitida com os objetivos de baixa potência, ou dissecar microscópio com iluminação transmitida, para identificar a região de interesse dentro da fatia de resina. </li><li> Um pequeno corte (3 mm x 3 mm) quadrado ao redor da região de interesse usando uma lâmina de barbear e pau esta para o topo do bloco de resina em branco com cola acrílica (Figura 1). Espere 5 minutos para a cola para endurecer, e então prosseguir com a próxima etapa. </li><li> Prenda o bloco para o titular do ulramicrotome e, usando a lupa em anexo, acabamento ao redor da região de interesse com uma lâmina de barbear até que apenas uma pequena pirâmide de restos de material. </li><li> Ainda cortar o bloco, usando uma faca de vidro fixo no ultramicrótomo, de modo que a região de interesse pode ser precisamente localizado no que diz respeito às dimensões da superfície do bloco (Figura 1). Cortar uma borda do bloco, perto da região de interesse, de modo que um passo perpendicular é cortado através da amostra (Figura 1 e 2). Esta etapa forma o rosto de imagem (Figura 2). </li><li> Remover o bloco do ultramicrótomo e fotografar a região de interesse dentro do bloco, utilizando um microscópio de luz transmitida. </li><li> Corte o bloco cortado longe do topo da resina remanescente. Isso é feito usando viu um joalheiro e garante que apenas um pequeno bloco é colocado dentro do FIB / SEM. A altura total deste bloco não deve ser superior a 5 mm. </li><li> Cola para bloquear a um stub de alumínio com pasta de carbono garantindo que o lado a ser trabalhada é na parte mais externa (Figura 1). </li><li> Depois que a cola secar, o revestimento do bloco com uma fina camada de ouro (&gt; 20 nm; Cressington sistema de evaporação a vácuo). </li></ol> 3. Imagem na FIB / SEM <ol start="20"><li> Com uma ampliação baixo, e utilizando elétrons secundários de imagem (5 kV, 0,5 NAMP), orientar o bloco de modo que a região de interesse escolhida eo lado do bloco a ser trabalhada é de frente para o operador (Figura 2 c, d). </li><li> Orientar o bloco de modo que a face a ser trabalhada fica paralela ao feixe de moagem. Isto significa que feixe de elétrons é orientado a 54 ° a esta face (Figura 2 b). </li><li> Usando um feixe de íons atual de 13-27 NAMPS em 30 kV remover uma faixa estreita de resina a partir da frente da região a ser trabalhada. </li><li> Alternar para o modo de imagem retroespalhados para ver a cara moída que recobre a região de interesse. </li><li> Usando a imagem de referência luz microscopia (tomada no passo 16) ea imagem da face moída localizar a região exata no bloco a ser moído e fotografada (Figura 2). </li><li> Depositar uma camada protetora (aproximadamente 1 mícron de espessura) de carbono (ou metal), utilizando o sistema de injeção de gás do microscópio, sobre a superfície do bloco, acima da região de interesse (Figura 2). </li><li> Usando uma corrente de 700 picoAmps, moinho finamente a região do bloco no qual as imagens finais serão tomadas. </li><li> Deixe o feixe de moagem moinho completamente este rosto imagem até sem artefatos moagem pode ser visto no rosto. A fábrica completa da face é verificado observando alterações em cada imagem subseqüente em todo o campo de visão. Moagem inadequada pode também visto como listras brancas ou "cortinas" aparecendo vertically na imagem. </li><li> Deixe o microscópio para, pelo menos, duas horas para todas as mudanças térmicas a se dissipar. Isso reduz o risco de que o bloco irá enfrentar drift durante o exame, resultando em imagens desalinhados. </li><li> Selecionar os parâmetros para geração de imagens de microscópio do rosto em série. Garantir que o feixe de elétrons tem uma tensão que é baixo o suficiente para a imagem apenas uma profundidade muito superficial de material em face bloco. Isso também deve ser muito mais rasa do que a espessura da face para ser removido. Parâmetros típicos para geração de imagens são tensões entre 1,2-2,0 kV, com tamanhos de pixel entre 4-20 nm. O pixel habitar precisa de tempo para ser mantido em torno de 10 μsecs de modo que o tempo total para moer o rosto e adquirir uma imagem é mantido abaixo dos 2 minutos (Figura 3). </li></ol> 4. Segredos para o sucesso Passo 1) Verifique as amostras não são mais espessas do que 150 mícrons. Isto irá permitir uma penetração adequada das manchas diferentes e resina para o material. Isto pode ser conseguido pela secção das amostras com uma vibratome imediatamente após a fixação. Esta espessura é apropriado para o tecido cerebral. Outros tecidos precisam ser testados para garantir a fixação adequada e coloração. Etapa 3) As amostras devem ser distribuído gratuitamente em toda a solução, e não se agrupou em uma parte do frasco enquanto este fixador secundário é introduzido. Isto irá assegurar a máxima penetração da amostra e reduzir a amostra se tornar distorcidas durante esse processo de fixação. Isto é conseguido rodando suavemente as amostras dentro do frasco imediatamente após a solução é adicionada. Passo 15) Certifique-se que a região de interesse está localizado imediatamente abaixo (&lt;30 microns) a superfície do bloco. Isto irá reduzir a quantidade de moagem pelo feixe de íons durante a fase de aquisição de imagem. Passo 22) O tempo de varredura do feixe de íons precisa ser adequa-da para garantir que o rosto de imagem inteiro é completamente moído. Moagem inadequada será mostrado como listras brancas, ou "cortinas" que aparece verticalmente para baixo o rosto de imagem. Passo 26) A face final, moído deve ser maior do que o cara que é imaginada. Isto é porque a resina moída é ejetado do bloco e redeposita na superfície do bloco nas imediações. Este redeposição pode interferir no campo de imagem de vista e é evitada por moagem uma área muito grande do que é imaginado. Para uma janela de imagem que é de 20 mícrons de largura, a face moída bloco é maior do que 30 microns de largura. Passo 29) É fundamental que os parâmetros de feixe de elétrons são tais que a imagem é gerada por elétrons que emergem apenas os primeiros poucos nanômetros da superfície do bloco. Este um acheved, minimizando a tensão a menos de 2 kV e garantindo que nenhum elétrons penetrar muito longe. Este é também ajudou usando uma tensão de rede no detector de modo que apenas o elétron com maior energia contribuem para a imagem final. Normalmente, uma tensão de 1,3 kV grade é usada para uma tensão de 1,5 kV imagem. 5. Resultados representativos: <img src="/files/ftp_upload/2588/2588fig1.jpg" alt="Figura 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 1"> Figura 1. Preparação de bloco de resina. Resina) incorporado secção coronal (80 mícrons de espessura) através de um cérebro de rato adulto visto em um steromicroscope. A imagem mostra claramente a diferentes regiões do cérebro que pode ser cortado a partir da seção (b), utilizando uma lâmina de bisturi. Aqui, um quadrado de 1 mm a partir do córtex é removido e (c) preso a um bloco de resina em branco. D) O bloco de resina é então cortada com uma faca de vidro montada em um ultramicrótomo, e uma vez que o bloco foi reduzido para apenas deixar o região de interesse (e), um passo é cortar perpendicular à superfície frontal do material incorporado. f) Toda esta região cortada é então cortada do resto da resina e montados em um topo de alumínio prontas para o revestimento de metal e de imagem no microscópio eletrônico de varredura. <img src="/files/ftp_upload/2588/2588fig2.jpg" alt="Figura 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 2"> Figura 2. Preparação do bloco para enfrentar FIB / SEM imagem. A) e b) mostram ilustrações do bloco e da borda que é moído para criar o rosto de imagem (indicado com a seta de duas pontas pretas). A posição do feixe de íons (branco) é mostrada paralelamente à face de imagem, eo feixe de elétrons (cinza) é mostrado batendo o rosto a 54 ° para o feixe de íons. C) mostra uma vista do bloco de tomadas com o feixe de elétrons e fotografada com os elétrons secundários. Ao longo deste lado do bloco de uma região escura (indicado com caixa branca pontilhada) mostra uma parte do rosto que foi mais ou menos moído (mostrado com duas cabeçased seta preta) para revelar a amostra subjacente. d) Quando esta região é fotografada usando apenas os elétrons retroespalhados o tecido incorporado pode ser visto. Aqui, a largura total da secção de tecido incorporado é indicado com uma seta dupla cabeça branca. Barra de escala em c) é de 100 microns. <img src="/files/ftp_upload/2588/2588fig3.jpg" alt="Figura 3" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 3"> Figura 3. Imagens do um volume de tecido do cérebro com voxels isotrópicos. A) Invertida imagem contraste retroespalhados da face de blocos mostrando a ultra-estrutura dentro de uma região do cérebro do rato. Todas as membranas são visíveis, bem como estruturas macromoleculares grande. B) Um total de 1.600 imagens foram coletadas em cinco espaçamentos nm, resultando em uma pilha de imagens com voxels isotrópicos. C) Essa pilha pode ser trabalhada em qualquer plano com a mesma resolução. Esta imagem mostra conexão sináptica única que é imaginada no plano xy eo plano yz.

<ol><li>Knott, G., Marchman, H., Wall, D., Lich, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Serial+section+scanning+electron+microscopy+of+adult+brain+tissue+using+focused+ion+beam+milling%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Serial section scanning electron microscopy of adult brain tissue using focused ion beam milling.</a> J Neurosci. 28, 2959-2964 (2008).</li>
<li>Hekking, L. H., Lebbink, M. N., De Winter, D. A., Schneijdenberg, C. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Focused+ion+beam-scanning+electron+microscope%3A+exploring+large+volumes+of+atherosclerotic+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22J+Microsc%22%5BJournal%5D)">Focused ion beam-scanning electron microscope: exploring large volumes of atherosclerotic tissue.</a> J Microsc. 235, 336-347 (2009).</li>
<li>Armer, H. E., Mariggi, G., Png, K. M., Genoud, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+transient+blood+vessel+fusion+events+in+zebrafish+by+correlative+volume+electron+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Imaging transient blood vessel fusion events in zebrafish by correlative volume electron microscopy.</a> PLoS One. 4, e7716-e7716 (2009).</li>
</ol>

Não há conflitos de interesse declarados.

A técnica da FIB / SEM funciona perfeitamente quando a região de interesse não é muito grande. O limite superior para um volume imaged depende do feixe de íons e da área que pode consistentemente moinho repetidamente durante muitas horas. Até agora isso tem sido feito com áreas de cerca de 60 x 60 microns, no entanto, imaging toda esta área não é possível com uma resolução de imagem adequada, principalmente devido ao fator tempo na coleta de uma imagem tão grande. Como exemplo, a 4 imagem kx 4 k com um pixel tempo de permanência de 10 microssegundos levaria 2 minutos e 40 segundos para adquirir, e para um campo de visão de 60 microns isso só dar um tamanho de pixel de 15 nm. Para geração de imagens da ultra-estrutura das células e tecidos, um tamanho de pixel menor é mais adequado, geralmente entre 4 e 10 nm / pixel. Para uma área de 60 x 60 microns a imagem seria adquirido em 10 horas, mesmo se o microscópio tinha essa capacidade. Por estas razões, o microscópio é uma ferramenta ideal para volumes de imagem na ordem de 10 x 10 x 10 microns, ou regiões significativas de células inteiras. Isso pode facilmente ser feito dentro de um período de 48 horas em amostras que são bem contrastadas com este procedimento. Até agora, o protocolo tem sido usado principalmente com o tecido cerebral, bem como vários tipos de culturas de células de mamíferos aderir em lamínulas. No entanto, o procedimento de fixação e coloração pode ser usado com muitos outros tipos de material biológico, incluindo material de planta para produzir igualmente pilhas de imagens bem contrastadas. Portanto, a principal vantagem desta técnica é a sua capacidade de volumes imagem com voxels isotrópicos. Pilhas de imagens deste tipo permitem a análise do volume 3D usando imagens feitas em qualquer avião na pilha. A vantagem disto é permitir que o observador a características de imagem na série de imagens de qualquer direção e proporcionando um maior detalhe de imagem (Figura 3).

<table border="1"><tbody><tr><th> Nome do reagente </th><th> Companhia </th><th> Número de catálogo </th></tr><tr><td> Cola de cianoacrilato </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Microscópio de dissecação: Leica MZ8 </td><td> Leica Microsystems, Alemanha </td><td></td></tr><tr><td> Durcupan resina </td><td> Sigma-Aldrich Chemie GmbH, Suíça </td><td></td></tr><tr><td> FIB / SEM microscópio (Zeiss, NVision 40) </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Slides de vidro histologia </td><td> Menzel-Glaser, Alemanha </td><td> AA00008032E </td></tr><tr><td> Fabricante de vidro faca: Leica EM KMR2 </td><td> Leica Microsystems, Alemanha </td><td></td></tr><tr><td> Cintilação de vidro frascos (20ml) </td><td> EMS, EUA </td><td> 72634 </td></tr><tr><td> Glutaraldeído </td><td> EMS, EUA </td><td> 16222 </td></tr><tr><td> Viu joalheiro </td><td> EMS, EUA </td><td> 72010 </td></tr><tr><td> Agente Mould separando </td><td> Glorex, Suíça </td><td> 62407445 </td></tr><tr><td> Tetróxido de ósmio </td><td> EMS, EUA </td><td> 19110 </td></tr><tr><td> Paraformaldeído </td><td> EMS, EUA </td><td> RT 19208 </td></tr><tr><td> Sais de fosfato de tampão fosfato </td><td> Sigma-Aldrich Chemie GmbH, Suíça </td><td> 71642 e 71496 </td></tr><tr><td> Cacodilato de sódio </td><td> Sigma-Aldrich Chemie GmbH, Suíça </td><td> 20840 </td></tr><tr><td> Sputter Coater com o objectivo de ouro </td><td> Cressington, EUA </td><td></td></tr><tr><td> Tris base (TBS) </td><td> Sigma-Aldrich Chemie GmbH, Suíça </td><td> T1378 </td></tr><tr><td> Ultramicrótomo: Leica UCT </td><td> Leica Microsystems, Alemanha </td><td></td></tr><tr><td> Acetato de uranila </td><td> EMS, EUA </td><td> RT 22451 </td></tr></tbody></table>

ion beam centrada fresagem e microscopia eletrônica de varredura do tecido cerebral

Focussed Ion Beam Milling and Scanning Electron Microscopy of Brain Tissue

Este protocolo descreve como de amostras biológicas, como o tecido cerebral, pode ser trabalhada em três dimensões usando o microscópio de íon focado feixe de elétrons / digitalização (FIB / SEM). As amostras são fixadas com aldeídos manchado metal, heavy utilizando tetróxido de ósmio e acetato de uranila. Em seguida, são desidratados com álcool e infiltradas com a resina, que é então endurecido. Usando um microscópio de luz e ultramicrótomo com navalhas de vidro, um pequeno bloco contendo os juros região próxima à superfície é feita. O bloco é então colocado dentro da FIB / SEM, eo feixe de íons usados ​​para cerca de um moinho de face vertical de um lado da quadra, próximo a esta região. Utilizando elétrons retroespalhados para a imagem das estruturas subjacentes, um pequeno rosto é, então, moída com um fino feixe de íons ea superfície examinado mais de perto para determinar a área exata da face a ser trabalhada e moído. Os parâmetros do microscópio são, então, definido de modo que o rosto é repetidamente moído e fotografada para que as imagens em série são coletados através de um volume do bloco. A pilha de imagem normalmente contêm voxels isotrópicos com dimensões como nm uma pequena 4 em cada direção. Esta qualidade de imagem em qualquer plano de imagem permite ao usuário analisar ultra-estrutura celular em qualquer ângulo de visão dentro da pilha de imagens.

Este protocolo descreve como resina de tecido cerebral incorporado pode ser preparada e fotografada nas três dimensões do feixe de íons focalizado, microscópio eletrônico de varredura.

Ion Beam centrada Fresagem e Microscopia Eletrônica de Varredura do Tecido Cerebral

Este protocolo descreve como amostras biológicas, como tecido cerebral, podem ser imageadas em três dimensões utilizando o feixe de íons focalizado/microscópio eletrônico de varredura...

O objetivo deste procedimento é coletar imagens em série por meio de uma região específica do tecido cerebral utilizando o microscópio de íons focalizados e microscopia eletrônica de varredura. Isso é realizado primeiramente seccionando o cérebro em fatias que são coradas e posteriormente emblocadas em resina. O segundo passo consiste em cortar a região de interesse do segmento cerebral emblocado e montá-la sobre um bloco de resina virgem.O terceiro passo é aparar o bloco de resina com um ultramicrótomo e usar o feixe de íons do microscópio para isolar somente a região a ser imageada. O passo final consiste em obter imagens em série de uma face do bloco de resina, utilizando o feixe de íons para remover repetidamente camadas finas antes de cada aquisição de imagem. Em última análise, podem ser obtidos resultados que mostram imagens em série através de uma região de interesse.A série de imagens é coletada automaticamente e o conjunto de dados geralmente possui vóxeis isotrópicos, de modo que as estruturas da imagem possam ser visualizadas de qualquer ângulo na pilha. A principal vantagem desta técnica em relação aos métodos existentes, como a microscopia eletrônica de transmissão em seções seriadas, é a capacidade de alcançar uma resolução Z muito maior. Em comparação com a tomografia eletrônica, é capaz de imagens de volumes muito maiores em uma resolução ideal para amostras embutidas em resina.O procedimento começa com a dissecação do cérebro fixado de uma rata anestesiada e perfundida. Incorpore o cérebro em aerossol a 5% aquecido em um molde plástico, oriente o cérebro para o ângulo correto antes que o aerossol solidifique e monte o bloco de aerossol com o cérebro em um suporte de amostra usando um vibrátomo. Corte secções coronais de 80 mícrons, obtendo tantas secções quanto forem necessárias para incluir a região de interesse.Em seguida, coloque as amostras em frascos de vidro com isolamento de 20 mililitros. Coloque até 10 seções por frasco. Lave as amostras três vezes, por cinco minutos cada, em tampão K coate 0,1 molar.Em seguida, corar as amostras com cianeto de potássio a 1,5% e tetróxido de ósmio a 1% em tampão K coate 0,1 molar por 30 minutos. Continuar a coloração das amostras com tetróxido de ósmio a 1% em tampão K coate 0,1 molar por 30 minutos. Após isso, lavar uma vez com água destilada duplamente por três minutos, em seguida corar com acetato de alumínio a 1% em água destilada duplamente por 30 minutos.Em seguida, lave as seções por cinco minutos em água destilada duplamente, e então desidrate-as em uma série de álcool em gradiente, permitindo dois minutos para cada mudança. O próximo passo é embutir as seções em concentrações crescentes de resina Duran misturada com álcool, permitindo 30 minutos entre cada mudança. Inicie com 50 de etanol para 50 de resina, depois 30 para 70, depois 10 para 90, finalmente colocando as seções em resina a 100% por 30 minutos.Em seguida, substitua o meio por resina duran fresca a 100%. Agite lentamente por uma hora no misturador rotativo. Após a inclusão, use um palito de madeira para posicionar as seções em lâminas de microscopia de vidro previamente revestidas com agentes separadores de molde.Coloque o maior número possível de seções nos lâminas, mas tome cuidado para não sobrecarregar as lâminas. Certifique-se de que uma etiqueta de identificação também seja colocada entre as lâminas do microscópio. Coloque as lâminas em uma estufa a 65 graus Celsius por 24 horas.No dia seguinte, retire as amostras do forno. Empurre suavemente uma lâmina de barbear entre as lâminas de vidro do microscópio e remova a camada de resina contendo as amostras de entre as lâminas, segurando a camada de resina com os dedos. Lave suavemente a amostra sob água corrente.Para remover quaisquer agentes de separação de molde, coloque a amostra sob um microscópio estereoscópico com iluminação transmitida, utilizando uma objetiva de baixo aumento. Marque a região de interesse com uma agulha fina. Use uma lâmina de barbear para cortar um pequeno quadrado de três milímetros por três milímetros ao redor da região de interesse.Use cola acrílica para fixar o bloco pequeno de resina na parte superior de um bloco de resina em branco. Em seguida, prenda o bloco no suporte do ultramicrótomo. Olhando através do microscópio estereoscópico acoplado, use uma lâmina de barbear para aparar ao redor da região de interesse até que reste apenas uma pequena pirâmide de material.Corte a borda do bloco próximo à região de interesse em um ângulo em relação à superfície superior do bloco usando uma lâmina de vidro fixada ao ultramicrótomo. Apare ainda mais o bloco para que a região de interesse possa ser localizada com precisão em relação às dimensões da superfície do bloco. Remova o bloco do ultramicrótomo e coloque-o sob um microscópio de luz transmitida.Fotografe a região de interesse. Use uma serra de ourives para cortar o bloco aparado longe do restante do toco de resina com tinta de carbono. Fixe o bloco SA no suporte de amostra de MEV e oriente-o de modo que o lado a ser imageado fique voltado para a borda mais externa.Após a cola ter secado, transfira o preparo para um sistema de evaporação sob vácuo em crescente e recubra o bloco com uma fina camada de ouro com espessura superior a 20 nanômetros. O bloco de tecido embutido em resina está agora pronto para ser analisado no microscópio eletrônico de varredura com feixe de íons focalizado. Insira a amostra, em seu suporte, no microscópio com baixa ampliação e, utilizando a imagem de elétrons secundários, oriente o bloco de modo que a região de interesse e a face do bloco a ser analisada estejam voltadas para frente.O operador orienta o bloco de modo que a face a ser imageada fique paralela ao feixe de usinagem. Isso faz com que o feixe de elétrons seja orientado a 54 graus em relação a essa face, utilizando uma corrente de feixe iônico de 13 a 27 nanoampères a 30 quilovolts.Remova uma faixa estreita de resina da frente da região a ser imageada. Em seguida, mude para o modo de imagem de elétrons retroespalhados para visualizar a face usinada que recobre a região de interesse. Usando a imagem de referência de microscopia óptica obtida anteriormente e a imagem da face usinada, localize a região exata no bloco a ser usinada e imageada utilizando o sistema de injeção de gás do microscópio.Deposite uma camada protetora de carbono ou metal com cerca de um mícron de espessura sobre a superfície do bloco acima da região de interesse, utilizando uma corrente de 700 picoampères. Por fim, usine a região do bloco onde serão obtidas as imagens finais. Permite-se que o feixe de usinagem remova completamente essa face de imagem até que não sejam visíveis artefatos de usinagem na superfície.Selecione os parâmetros do microscópio para a aquisição de imagens em série da face. Os parâmetros típicos são tensões entre 1,2 e dois quilovolts, com tamanhos de pixel entre quatro e 20 nanômetros. O tempo de permanência do pixel deve ser de aproximadamente 10 microssegundos, de modo que o tempo total para usinar a face e adquirir uma imagem seja inferior a dois minutos.Deixe o microscópio em repouso por pelo menos duas horas para que quaisquer alterações térmicas se estabilizem. Para dissipar, inicie o processo de moagem e imageamento para adquirir imagens em série através da região de interesse. Esta figura mostra a imagem reversa de elétrons retroespalhados da face do bloco, revelando a ultraestrutura dentro de uma região do cérebro envolto.Todas as membranas são visíveis, bem como estruturas macromoleculares grandes. Esta figura é composta por um total de 1.600 imagens coletadas com espaçamento de cinco nanômetros, resultando em uma pilha de imagens com vóxeis isotrópicos. Essa pilha pode ser visualizada em qualquer plano com a mesma resolução.Após assistir a este vídeo, você deverá ter uma boa compreensão de como preparar tecido cerebral para imageamento em série com o microscópio eletrônico de varredura com feixe focado.

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Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neurociência

Pegue uma seção fixa de tecido cerebral cortical de camundongo exibindo axônios e dendritos neuronais. Os dendritos possuem saliências, conhecidas como espinhas dendríticas, que formam sinapses com axônios. Incube o tecido com ferrocianeto de ósmio, que se liga aos lipídios, seguido por outra aplicação de ósmio, que aumenta o contraste estrutural para a imagem. Mancha com um composto de metal pesado que se liga a macromoléculas e aumenta o contraste. Desidratar usando concentrações crescentes...

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Aqui, nós apresentamos um protocolo para combinar eficientemente a cara de bloco de série e a microscopia de elétron de varredura focalizada do feixe de íon para alvejar uma área de interesse. Isso permite a pesquisa eficiente, em três dimensões, e a localização de eventos raros em um grande campo de visão.

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Litografia de feixe de íons focada para etch nano-arquiteturas em microeletrodos

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Preparação de amostras por fresagem de feixe de íons com foco correlativo 3D para tomografia crioeletrônica de alta resolução

Esse fluxo de trabalho permite a produção de lamelas direcionadas a estruturas biológicas marcadas com fluorescência que são pequenas (&lt;1 μm de extensão axial) e raras (1 cópia por célula) usando uma plataforma de imagem tricoincidente criogênica. Esta plataforma integra microscopia de fluorescência, fresagem de feixe de íons focalizada e microscopia eletrônica de varredura em uma única posição focal e permite microscopia de fluorescência simultânea durante a fresagem.

Fluxo de trabalho usando um microscópio de fluorescência coincidente criogênica, elétron e feixe de íons para moagem direcionada de células

Introduzimos uma técnica inovadora de imagem chamada Tomografia de Interferência Óptica Multicamada (OMLIT), que permite a imagem não enviesada de todas as células em amostras cerebrais na mesoescala e pode ser integrada perfeitamente ao fluxo de trabalho de imagem da microscopia eletrônica serial de varredura baseada em fita na mesma amostra.

Um Método de Imagem Óptica Compatível com Microscopia Eletrônica de Varredura para Mapeamento Cerebral Mesoscópico de Todas as Células

Aprenda a preparar e imaginar tecido cerebral em resina usando microscopia eletrônica de varredura com feixe de íons focalizado. Este método permite obter imagens seriadas tridimensionais de alta resolução para análise estrutural detalhada.

Ion Beam centrada Fresagem e Microscopia Eletrônica de Varredura do Tecido Cerebral

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