Células padronização na opticamente transparentes Indium Tin Oxide Eletrodos

Olá, eu sou Isha. Sou aluna de pós-graduação do segundo ano no laboratório da Dra. Zen. Estamos aqui no Departamento de Engenharia Biomédica da Universidade da Califórnia em Davis.

Hoje vou mostrar a vocês o controle de Ian em eletrodos de óxido de índio estanho microfabricados opticamente transparentes. Em esforços de engenharia e regeneração de tecidos, têm sido feitas tentativas para imitar o microambiente do órgão. Para criar esse microambiente in vitro, é essencial isolar espacial e temporalmente as células em um substrato. Estamos interessados em projetar superfícies nas quais possamos controlar a localização de diferentes tipos de células hepáticas.

No experimento de hoje, usaremos modificação de superfície, microfabricação e eletroquímica para formar uma superfície que possa ser alternada de não adesiva a adesiva para células. O primeiro passo é a fotolitografia. Abaixo há um diagrama de fluxo de como esse processo será realizado.

O azul é a luz do vidro, o verde é o óxido de índio 10 que é revestido sobre a luz do vidro. Primeiro, vamos aplicar por spin coating o fotoresiste vermelho mostrado aqui sobre o vidro com revestimento de óxido de índio 10. Em seguida, vamos expor esse conjunto a uma máscara fotográfica com luz ultravioleta, e as regiões expostas serão desenvolvidas em uma solução reveladora.

As regiões de ITO que não estão protegidas pela resistência fotográfica serão removidas na etapa de gravação do ITO. Em seguida, toda a resistência fotográfica remanescente será removida em acetona para formar nossos eletrodos de ITO. Abaixo está o diagrama de fluxo dos três passos restantes.

Primeiro, vamos modificar toda a superfície com peg ciliado. Isso tornará a superfície não aderente, e nenhuma célula ou proteína se ligará a ela. Em seguida, vamos utilizar eletroquímica para absorver especificamente o peg ciliado apenas nos dois eletrodos que fabricamos anteriormente.

E finalmente, vamos incubar fibroblastos sobre a superfície, e eles se ligarão seletivamente apenas às regiões das faixas. Agora estamos prontos para iniciar nosso experimento. O primeiro passo envolve a fotolitografia, que será realizada em uma sala limpa.

Então vamos adiante e entrar na sala limpa. Agora estamos em nossa sala limpa. Antes de iniciar nosso experimento, vamos aquecer nossas amostras revestidas com óxido de índio e estanho, ou ITO, a 200 °C em nosso forno.

Dessa forma, podemos desidratar todas as nossas superfícies. E após aquecê-las a 200 °C é quando vamos colocá-las na nossa centrífuga e aplicar efetivamente o fotoresiste. Assim, após desidratarmos o nosso substrato de ITO, vamos pegá-lo e colocá-lo no porta-amostras da centrífuga.

Este porta-mandril é grande o suficiente apenas para segurar um quarto de um vidro fino. Em seguida, vamos aplicar vácuo. Depois disso, aplicamos uma resistência fotossensível de tom positivo sobre o substrato.

Após a aplicação da resistência fotográfica, prosseguimos imediatamente. Isso envolve duas etapas. A primeira é a distribuição, e a segunda é o revestimento por centrifugação na etapa de distribuição.

O porta-mandril gira a 800 RPM e isso espalha uniformemente o fotoresiste sobre toda a superfície. No entanto, o próximo passo é a centrifugação, que ocorre a 4.000 RPM, e a essa velocidade forma-se uma camada muito fina. Por fina, quero dizer cerca de um mícron.

Se você separar a palavra photo, resist, ela se divide em photo e resist. É ativada pela luz. Portanto, trabalhamos na sala limpa e usamos luz filtrada para que o nosso fotoresiste não seja ativado pela luz, e é resistente a agentes químicos, uma propriedade que utilizaremos posteriormente quando realizarmos a gravação.

Agora terminamos a centrifugação, com o fotoresiste na superfície, e vamos apenas retirá-lo e passar para a próxima etapa. Após aquecer a amostra por um minuto e 45 segundos, vamos retirá-la da placa aquecida e levá-la para o nosso alinhador de máscara canônico. Aqui pegamos a máscara necessária e a colocamos sobre o nosso substrato, de modo a obter uma impressão por contato entre o nosso substrato com o fotoresiste e a máscara; colocamos uma pastilha de vidro de quatro polegadas em cima apenas para adicionar peso.

E uma vez que terminamos com isso, simplesmente recolocamos o obturador e, em seguida, expomos a amostra à luz UV. Após a conclusão da exposição, afastamos a tampa em ordem inversa. Retiramos nossa lâmina de vidro, removemos nossa máscara e, então, retiramos nosso substrato e o levamos para desenvolvimento.

Após expor a amostra, colocamo-la em uma solução reveladora. Quando a amostra foi exposta à luz UV, houve formação de íons hidrogênio, que foram neutralizados pela base na solução reveladora e efetivamente removidos da superfície. Portanto, agora você deve garantir, ao manipular a amostra, que está movimentando constantemente o substrato.

E quando você faz isso, é possível observar, em cerca de um minuto ou um minuto e meio, que as regiões expostas são realmente desenvolvidas e removidas da superfície. Mas, para que o desenvolvimento seja completo, deixamos imerso na solução reveladora por cerca de cinco minutos. Após a conclusão do desenvolvimento, vamos retirá-lo, lavá-lo com água desionizada e depois secá-lo usando uma pistola de nitrogênio.

Depois de secar nossa amostra, vamos levá-la para visualizá-la ao microscópio. Aqui estamos observando a amostra ao microscópio. Acabamos de retirá-la após desenvolvê-la por cinco minutos.

Existem duas regiões que você pode observar aqui: uma região mais escura coberta por resistência fotográfica e uma região mais clara onde a resistência fotográfica foi removida. Em relação à máscara que usamos anteriormente, as regiões escuras na máscara correspondem às regiões escuras que vemos agora sob o microscópio, enquanto as regiões claras que vemos aqui eram transparentes na máscara. Um dos desenhos mostrados aqui consiste em arranjos de diferentes tamanhos, variando de 500 a 50 mícrons, enquanto o outro desenho é composto por círculos de 1000 mícrons interconectados.

Aqui temos um design diferente que foi criado usando o mesmo procedimento. Aqui temos eletrodos individualmente endereçáveis. Com isso quero dizer que diferentes regiões do ITO são interconectadas e podem ser ativadas de maneira distinta.

Por exemplo, aqui, as regiões circulares centrais estão conectadas a um contato elétrico neste ponto, enquanto as regiões retangulares mais externas estão conectadas a um contato elétrico diferente. Dessa forma, podemos estimular essas duas superfícies distintas em momentos diferentes. Após examinar nossas amostras, o próximo passo a ser realizado é a gravação da amostra.

Quaisquer regiões que não estejam protegidas pelas fotos serão removidas por meio de gravação com ITO. Antes de fazer isso, precisamos garantir que vestimos roupas apropriadas, pois a gravação com ITO contém ácidos. Agora, após colocar meu avental de proteção contra ácidos e meu protetor facial, vou despejar um pouco da solução de gravação com ITO em um béquer de vidro.

A gravação de ITO é composta por 20% de ácido clorídrico, 5% de ácido nítrico e o restante é água desionizada. Em seguida, traga a minha amostra e coloque-a na solução de gravação. Anteriormente, ao microscópio, observamos que havia algumas regiões que não estavam protegidas pelos relevos fotolitográficos.

Os ácidos na gravação de ITO atacaram essas regiões e provocaram a remoção do ITO dessas áreas. À medida que o ITO degrada lentamente a partir da superfície, ele muda de cor. Aqui é possível observar que ele mudou de uma tonalidade azulada, que tinha originalmente, para uma tonalidade arroxeada, e agora está passando para a tonalidade amarelada.

A mudança na cor indica que o ITO está sendo corroído. Então, agora estamos aqui aos 15 minutos. Todo o ITO foi completamente removido por corrosão.

E o que você vê agora são fotos de regiões de ITO protegidas. Após a conclusão da gravação, ainda há alguns ácidos residuais na superfície. Para remover esses ácidos, vamos colocar o material em uma solução de carbonato de sódio, que irá neutralizar todo o ácido.

Após neutralizar os ácidos, vamos retirar e limpar com água desionizada e, em seguida, secar com nitrogênio. Agora concluímos a gravação com ácido. Sem mais ácido, já tirei minha capa térmica.

Vamos removê-lo e transferi-lo para visualização em nosso microscópio. Agora estamos observando a amostra ao microscópio. Isso é após realizarmos a gravação do ITO.

Neste caso, as regiões mais escuras são áreas de vidro das quais o ITO foi removido por ataque químico. E as regiões mais claras são o ITO que foram protegidas pela resistência fotográfica neste caso. Mais uma vez, estas são as matrizes de 500 a 50 mícrons e, no outro caso, temos nossos círculos interconectados de mil mícrons cada.

Então, acabamos de observar ao microscópio e vimos que havia regiões de vidro e regiões de ITO, mas as regiões de ITO estavam protegidas por fotoresiste. Agora precisamos remover esse fotoresiste. Então, tudo o que vamos fazer é pegar nosso substrato, colocá-lo em acetona e, em seguida, colocar isso no banho ultrassônico, sonificando por 10 minutos.

Isso garante que toda a resistência fotográfica seja removida; você poderia usá-la como tons por si só, mas mediante ataque sônico, que utiliza ondas sonoras para impactar, o que assegura que a resistência fotográfica seja removida corretamente. Após retirá-la do ar sônico, é lavada em água DI, secada novamente em nitrogênio, e agora é possível ver claramente os padrões no substrato de vidro. Esses foram os padrões que inicialmente estavam protegidos pela resistência fotográfica.

Agora que examinamos nossas amostras e encontramos ou criamos nossos padrões de ITO, vamos iniciar a segunda fase do experimento. Esta fase envolve a modificação da superfície com uma camada auto-organizada de ciclina PEG. Mas antes de fazer isso, precisamos garantir que a superfície seja reativa.

Para fazer isso, colocamos o material em um limpador de plasma. Isso introduz grupos hidroxila na superfície e, consequentemente, torna-a reativa. Para tanto, basta colocar a amostra no limpador de plasma e, em seguida, ligar a bomba de vácuo.

Ligamos o oxigênio, ligamos a energia principal. Essa energia é usada para converter o gás oxigênio em plasma, que é então introduzido e, assim, forma os sulcos hidroxila. E, uma vez que ligamos a energia, prosseguimos e apertamos iniciar.

Então, agora que o processo está completo, retiramos nosso substrato, armazenamo-lo em uma placa e saímos da sala limpa, retiramos as vestimentas de proteção e passamos para a próxima etapa. Agora que estamos fora da sala limpa e concluímos nossa padronização ideal, vamos modificar a superfície que acabamos de padronizar com polietilenoglicol, CYLIN ou PEG Cylin. É fundamental saber que o peg cylin é reativo à umidade.

Portanto, tudo o que usamos feito de madeira precisa estar isento de umidade. O material de vidro que utilizamos aqui, as placas de Petri, foi aquecido a cem °C durante a noite. E o solvente que vamos usar também é anidro.

Não contém umidade. Agora vou despejar tolueno anidro em ambos os copos de vidro, um dos quais contém a nossa amostra. Precisamos usar dois recipientes de Petri porque um deles será o local onde realizaremos a modificação.

E o outro vamos usar mais tarde, quando a modificação terminar, para lavar de fato nosso substrato. Então, após colocar em nossos pratos de vidro, vou apenas levá-lo e transferi-lo para a câmara de antecâmara aqui na caixa de luvas. Após fechar a câmara de antecâmara, vamos introduzir nitrogênio na câmara.

Agora, a câmara principal já está preenchida com nitrogênio. Portanto, não queremos abrir esta câmara a menos que ela esteja cheia de nitrogênio. Uma vez que ambas as câmaras estejam com nitrogênio, vamos transferir todas as nossas amostras junto com uma pipeta.

Vamos utilizar um pino e uma pinça que serão usados posteriormente para transferir as amostras. Vamos colocar as luvas, abrir a câmara aqui e retirar lentamente e com cuidado tudo o que está em nossa câmara de segurança, colocando-o na câmara principal. Este é o recipiente de Petri com nosso substrato e o recipiente de Petri apenas com tolueno que usaremos para lavagem.

O pxi que está presente foi embalado sob nitrogênio e você não deve abrir este frasco a menos que esteja em um ambiente de nitrogênio. Portanto, assim que quiser retirar a amostra, você deve devolvê-la ao saco. Então, você retira o seu cylin e a concentração que vamos usar é 2% em tolueno.

Então você retira, coloca no recipiente alto, misturamos. Também na câmara, certifique-se de que esteja bem misturado e, em seguida, deixe a amostra incubando em Toin por duas horas. Agora que se passaram duas horas, nossa amostra esteve em Pxi, vamos retirar a amostra e transferi-la para uma solução fresca de toin, onde a lavaremos brevemente, movimentaremos em círculos e a levaremos para a câmara de airlock.

Uma vez que esteja em nossa câmara de eclusa, simplesmente abriremos a câmara e retiraremos nossa superfície modificada, podendo movê-la usando a pistola de nitrogênio. Colocamo-la novamente em uma placa de Petri limpa e seca e a levamos para ser colocada em uma estufa a cem graus C por mais duas horas. Agora que as amostras foram aquecidas na estufa a cem °C por duas horas, vamos pegá-las e conectar nossos fios aos eletrodos que preparamos.

Fazemos isso preparando uma mistura um para um de epóxi prateado e um agente de cura. Este é o epóxi prateado, e agora adicionamos a mesma quantidade do agente de cura. Desejamos misturá-lo bem, e então vamos pegar esta mistura e usá-la para fixar nossos fios.

Então colocamos nosso fio nos eletrodos que desejamos utilizar e, em seguida, o conectamos. A soldagem não funciona no ITO, portanto, precisamos usar epóxi de prata e o agente de cura. Depois, levamos ao forno para que todo o agente de cura utilizado anteriormente seja removido, endureça e possamos utilizá-lo como eletrodo.

Agora que concluímos duas fases, vamos iniciar a terceira fase de um experimento, que consiste em realizar a parte de eletroquímica. Para isso, vamos coletar uma amostra e colocá-la em nossa célula eletroquímica. Após colocar a amostra em nossa célula eletroquímica, vamos simplesmente posicionar uma junta de vedação (O-ring) em sua parte superior.

Isso vai isolar a região onde a eletroquímica irá ocorrer, e então vou selar a célula. Portanto, coloquei minha amostra com o fio conectado dentro da célula eletroquímica. Agora estou pronto para usar o potenciostato para aplicar a tensão.

Então, o fio branco, vou conectá-lo bem aqui ao eletrodo de referência, o vermelho, ao eletrodo auxiliar, e finalmente o verde, que vou conectar ao nosso eletrodo de trabalho. Uma vez que todos esses eletrodos estiverem conectados, vou apenas adicionar uma solução 1 x de tampão salino de fosfato ou PBS ao sistema eletroquímico propriamente dito. Agora, para esclarecer, o funcionamento será da seguinte forma: toda a superfície, no momento, está modificada com pxi.

Assim, todos os eletrodos, incluindo as regiões de vidro ao redor, são modificados com pxi. Quando aplico a voltagem em todos os locais onde o ITO está presente, ou seja, nos desenhos dos eletrodos que criamos, a ilha de peg será removida apenas dessas superfícies, e nenhuma alteração ocorrerá nas regiões adjacentes. Dessa forma, removemos seletivamente a ilha de peg do nosso substrato.

Agora vou pressionar reproduzir, o que iniciará e aplicará uma tensão de -1,4 volts ao nosso eletrodo de trabalho. Quando a tensão é aplicada, ocorre uma mudança de cor que você pode observar nos eletrodos. Ele muda do tom verde-azulado transparente que tínhamos para marrom.

Suspeitamos que possa haver uma reação de oxidação ocorrendo nos eletrodos, o que faz com que eles fiquem marrons. Este é também um dos indicadores de que o pxi da superfície foi realmente removido da superfície. E novamente, onde quer que você veja marrom, é aí que a ilha de peg foi removida.

E as regiões de vidro ao redor ainda têm PXI montado sobre elas. Então, aplicamos uma tensão de menos 1,4 watts durante 60 segundos. Isso fornece tempo suficiente para remover todo o PXI presente nos eletrodos.

Também podemos usar este método para destacar eletrodos que são endereçados individualmente. Neste caso, havia três fileiras de círculos que serão destacadas. Podemos selecionar quais desejamos destacar utilizando os três eletrodos diferentes.

Agora concluímos com sucesso a nossa terceira etapa de eletroquímica, na qual removemos seletivamente o silano PG dos nossos eletrodos de ITO. Lavei brevemente com PBS e água DI, removi o fio e coloquei as amostras em placas de seis poços comuns. Agora vamos prosseguir e cultivar células sobre esses eletrodos.

Agora estamos aqui na sala de cultura de tecidos. Para a fase final do experimento, vamos utilizar hoje fibroblastos, células T três T. A concentração que usamos para semear as células varia entre 0,5 a 1,5 milhão de células por mililitro.

Após semear as células, deixamos as células sobre a nossa amostra por aproximadamente 20 minutos. Isso lhes proporcionará tempo suficiente para aderirem às regiões despolidas. Assim, colocaremos a amostra no incubador.

Agora passaram-se 20 minutos e estamos prontos para observar as células que se organizaram nas regiões desprotegidas do ITO, as regiões marrons que vimos anteriormente, as quais se ligarão especificamente apenas a essas áreas e não aderirão a nenhum local fora delas. Aqui é possível observar as regiões marrons, que correspondem às áreas do ITO das quais o pxi foi removido. Por meio da eletroquímica, as células aderiram exclusivamente a essas regiões marrons e não às regiões circundantes de vidro.

Neste outro quadro, mais uma vez, observamos seltz se ligando às regiões descobertas. Essas são as regiões marrons, mas acima dessas regiões marrons é possível ver dificilmente um desenho de ITO com PEG que não foi removido deste desenho de ITO, portanto nenhuma célula aderiu a ele. Ok, é isso.

Terminamos o protocolo e as células apresentam um padrão nos eletrodos de ITO, e é exatamente isso que queríamos. Acabei de mostrar o controle da adesão celular em eletrodos de óxido de índio estanho microfabricados e opticamente transparentes. Hoje, demonstrei como padronizar fibroblastos THREET três nesses eletrodos.

Também utilizamos o mesmo procedimento para padronizar células Hep G dois, células satélite e células primárias de rato. As técnicas atuais de padronização celular permitem apenas a montagem de dois tipos celulares na superfície. A flexibilidade dessa técnica permitirá no futuro a montagem de múltiplos tipos celulares na superfície, isolados espacialmente.

Planejamos utilizar esta técnica para isolar espacialmente três tipos diferentes de células hepáticas no substrato de ITO, a fim de imitar o microambiente in vivo. Ao fazer isso, podemos isolar espacialmente células imaturas ou células-tronco juntamente com células maduras e células de suporte. Isso criará um ambiente instrutivo para que as células imaturas cresçam e se diferenciem.