Células padronização na opticamente transparentes Indium Tin Oxide Eletrodos

Olá, eu sou Isha. Eu sou um estudante de pós-graduação do segundo ano no laboratório do Dr. Zen. Estamos aqui no Departamento de Engenharia Biomédica da Universidade da Califórnia em Davis.

Hoje vou mostrar a vocês o controle de Ian em eletrodos de óxido de índio 10 opticamente transparentes microfabricados em engenharia de tecidos e esforços de regeneração foram feitos para imitar o microambiente do órgão. Para criar esse microambiente in vitro, é essencial isolar espacial e temporalmente as células em um substrato. Estamos interessados em projetar superfícies onde possamos controlar a localização de diferentes tipos de células hepáticas.

No experimento de hoje, usaremos modificação de superfície, microfabricação e eletroquímica para formar uma superfície que pode ser trocada de não adesiva celular para adesivo celular. O primeiro passo é a fotolitografia. Aqui está um diagrama de fluxo de como esse processo será trabalhado.

O azul é a luz de vidro, o verde é o óxido de índio 10 que é revestido em cima da luz de vidro. Primeiro, o que vamos fazer é girar a foto da camada vermelha mostrada aqui em cima da luz de vidro revestida de óxido de índio 10. Em seguida, vamos passar isso por uma máscara fotográfica para a luz ultravioleta e as regiões expostas serão desenvolvidas em uma solução em desenvolvimento.

As regiões ITO que não são protegidas por fotorresistência serão removidas em IT oing. E, finalmente, toda a fotorresistência restante será removida em acetona para formar nossos eletrodos ITO. Aqui está o diagrama de fluxo das três etapas restantes.

Primeiro, vamos modificar toda a superfície com o pino cilíndrico. Isso fará com que a superfície não seja incrustante e nenhuma célula ou proteína se ligará a ela. Em seguida, usaremos a eletroquímica para absorver especificamente a peg cilina dos dois eletrodos I que fizemos anteriormente.

E, finalmente, vamos incubar fibroblastos no topo da superfície e eles se ligarão seletivamente apenas às regiões da faixa. Então, agora estamos prontos para começar nosso experimento. A primeira etapa envolve a fotolitografia, que será realizada em uma sala limpa.

Então, vamos entrar na sala limpa. Então agora aqui estamos em nossa sala limpa. Antes de começarmos nosso experimento, o que vamos fazer é assar nossas amostras revestidas de óxido de índio e estanho ou ITO a 200 ° C em nosso forno.

Dessa forma, podemos desidratar todas as nossas superfícies. E depois de assá-lo a 200 C é quando vamos colocá-lo em nossa tecnologia de rotação e realmente aplicar a fotorresistência. Então, depois de desidratar nosso substrato ITO, vamos pegá-lo e colocá-lo no mandril da tecnologia de rotação.

Este mandril é grande o suficiente para conter um quarto de luz de vidro. Então vamos, vamos aplicar vácuo. Depois disso, aplicamos tom positivo, fotorresistente no substrato.

Após a aplicação da fotorresistência, vamos em frente e começamos. Isso envolve duas etapas. O primeiro é o espalhamento e o segundo é o revestimento giratório na etapa de espalhamento.

O mandril gira a 800 RPM e isso espalha uniformemente a fotorresistência em toda a superfície. No entanto, o próximo é a etapa de rotação, que está a 4.000 RPN e a 4.000 RPM, forma uma camada muito fina. Por fino, quero dizer cerca de um mícron.

Se você quebrar a palavra foto, resista, ela se transforma em foto e resista. É ativado pela luz. Por isso, trabalhamos na sala limpa e usamos luz filtrada para que nossa porta fotográfica resista não seja ativada pela luz e seja resistente a ativos, que usaremos a propriedade que usaremos mais tarde, quando fizermos gravura.

Então, agora terminamos com o revestimento giratório, fotorresistente na superfície, e vamos retirá-lo e passar para a próxima etapa. Então, depois de assar a amostra por um minuto e 45 segundos, vamos retirá-la da chapa quente e movê-la para o forro da máscara de canhão. Aqui pegamos uma máscara de que precisamos e depois colocamos a máscara em cima do nosso substrato para ter uma impressão de contato entre nosso substrato com resistência à porta e a máscara, colocamos com um wafer de vidro de quatro polegadas apenas para adicionar peso a ele.

E quando terminamos com isso, basta colocar o obturador de volta e depois expomos a amostra à luz ultravioleta. Quando a exposição estiver concluída, basta afastar a tampa na ordem inversa. Retiramos nosso wafer de vidro, tiramos nossa máscara e, em seguida, removemos nosso substrato e o levamos para desenvolvimento.

Depois de expor o exemplo, nós o colocamos em uma solução de desenvolvedor. Quando a amostra foi exposta à luz UV, houve forma de íons de hidrogênio, que neutralizaram com a base e a solução reveladora e foram realmente removidos da superfície. Então, agora você quer ter certeza de que, ao fazer a amostra, está constantemente desviando o substrato.

E quando você faz isso, você pode ver em cerca de um minuto ou minuto e meio, as regiões ex expostas são realmente desenvolvidas e removidas da superfície. Mas para que o desenvolvimento completo aconteça, deixamos ele na solução do desenvolvedor por cerca de cinco minutos. Depois que o desenvolvimento estiver concluído, vamos retirá-lo, vamos lavá-lo e di-água e depois secá-lo usando uma pistola de nitrogênio.

Depois de secarmos nossa amostra, vamos pegá-la e visualizá-la em nosso microscópio. Aqui estamos olhando para a amostra ao microscópio. Nós apenas o retiramos depois de revelá-lo por cinco minutos.

Existem duas regiões que você pode ver aqui, uma região mais escura que é coberta por fotorresistência e a região mais clara onde a fotorresistência foi removida. Em relação à máscara que usamos anteriormente, as regiões mais escuras da máscara eram as regiões mais escuras que vemos agora ao microscópio, enquanto as regiões claras que vemos aqui eram transparentes na máscara. Um dos designs mostrados aqui é apenas matrizes de tamanhos diferentes que vão de 500 a 50 mícrons, enquanto o outro design é um círculo de 1000 mícrons que estão apenas interconectados.

Então, aqui temos um design diferente que foi feito usando o mesmo procedimento. Aqui temos eletrodos endereçáveis individualmente. O que quero dizer com isso é que diferentes regiões da ITO estão interconectadas e podem ser ativadas de maneira diferente.

Por exemplo, aqui, as regiões circulares centrais, elas estão conectadas a uma almofada elétrica aqui, enquanto as regiões retangulares mais externas estão conectadas a uma almofada elétrica diferente. Dessa forma, podemos estimular essas duas superfícies diferentes em diferentes momentos. Depois de olhar para nossas amostras, o próximo passo para o qual passamos é gravar a amostra.

Quaisquer regiões que não sejam protegidas pelas fotos serão gravadas em uma gravura ITO. Antes de fazer isso, temos que nos certificar de que vestimos roupas adequadas, pois a corrosão ITO contém ácidos. E agora, depois de vestir meu avental de proteção contra ácido, colocar meu protetor facial, vou derramar um pouco de ITO gravando em um copo de vidro.

A corrosão ITO é composta por 20% de cloreto de hidrogênio, 5% de ácido nítrico e o restante é água DI. E então traga minha amostra e coloque-a na gravura. No início do microscópio, vimos que havia algumas regiões que não eram protegidas por elevações de fotos.

Os ácidos na corrosão da ITO atacaram essas regiões e fizeram com que a ITO dessas regiões fosse gravada. À medida que o ITO se degrada lentamente da superfície, ele muda de cor. Aqui você pode ver que ele mudou de uma mudança azulada que originalmente tinha para essa mudança arroxeada e agora está passando para a troca amarela.

A mudança de cor indica que o ITO está sendo gravado. Então, agora aqui estamos em 15 minutos. Todo o ITO, está completamente gravado.

E o que você vê agora são fotos protegidas por regiões ITO. Então, depois que a gravação é concluída, ainda existem alguns ácidos que permanecem na superfície. Para remover esses ácidos, vamos colocá-los em uma solução de carbonato de sódio, que vai neutralizar todo o ácido.

Depois de neutralizar os ácidos, vamos retirá-lo e limpá-lo com água DI e depois secar com o nitrogênio feito. Então, agora terminamos com a gravação ácida. Chega de ácido, estou sem meu vestido quente.

Vamos retirá-lo, transferi-lo e visualizá-lo sob nosso microscópio. Então agora estamos observando a amostra ao microscópio. Isso foi depois de realizarmos a gravação ITO.

Nesse caso, as regiões mais escuras são regiões de vidro de onde o ITO foi gravado. E as regiões mais claras são ITO que são protegidas por fotorresistência neste caso. Mais uma vez, essas são as matrizes de 500 a 50 mícrons e, no outro caso, temos nossos círculos interconectados de mil mícrons cada.

Então, olhamos ao microscópio e vimos que havia regiões de vidro e regiões ITO, mas as regiões ITO eram protegidas por fotorresistente. Agora precisamos tirar esse fotorresistente. Então, tudo o que vamos fazer é pegar nosso substrato, colocá-lo em acetona e, em seguida, colocá-lo no sonicado e apenas sonicar por 10 minutos.

Isso garante que toda a resistência fotográfica retirada, você pode usar como tons por si só, mas por batida sônica, que usa ondas sonoras para acertar e que garante que a fotorresistência seja removida corretamente. Depois de retirá-lo do ar sônico, ele é lavado em água DI, seco novamente em nitrogênio e agora você pode ver os padrões claramente no substrato de vidro. Esses foram os padrões que foram inicialmente protegidos pela fotorresistência.

Agora que analisamos nossas amostras e encontramos ou fizemos nossos padrões de ITO, vamos começar nossa segunda fase do experimento. Esta fase envolve a modificação da superfície com uma monocamada auto-montada de ciclina PEG. Mas antes de fazer isso, temos que ter certeza de que a superfície é reativa.

Para isso, colocamos em um limpador de plasma. Isso introduz grupos hidroxila na superfície e, portanto, a torna reativa. Para fazer isso, basta colocar nossa amostra no limpador de plasma e, em seguida, ligamos nossa bomba de vácuo.

Ligamos o oxigênio, ligamos a energia principal. Essa energia é usada para converter o gás oxigênio em plasma, que é então introduzido e, assim, forma os sulcos de hidroxila. E assim que ligamos a energia, vamos em frente e clicamos em iniciar.

Então, agora, após a conclusão do processo, retiramos nosso substrato, armazenamos em um prato e seguimos para fora da sala limpa e passamos para a próxima etapa. Então, agora que estamos fora da sala limpa e terminamos nossa padronização ideal, vamos modificar a superfície que acabamos de padronizar com polietilenoglicol, CILINA ou PEG Cylin. É fundamental saber que a clilina é reativa à umidade.

Portanto, tudo o que usamos madeira deve ser livre de umidade. Os copos que usamos aqui, os pratos para animais de estimação, foram assados a cem C durante a noite. E o tun que vamos usar como solvente também é anidro.

Não contém umidade. Então, agora vou derramar tun, tolu anidro em ambos os alto-falantes de vidro, um dos quais contém nossa amostra. Agora temos que usar duas placas de Petri porque uma delas é onde vamos fazer a modificação.

E o outro que usaremos mais tarde, quando a modificação terminar, para realmente lavar nosso substrato. Então, depois de colocar nossos pratos de pizza de vidro, vou pegá-lo e transferi-lo para nossa câmara de câmara de ar aqui no porta-luvas. Depois de fechar a câmara da câmara de descompressão, vamos introduzir nitrogênio na câmara.

Agora, a câmara principal aqui já está cheia de nitrogênio. Portanto, não queremos abrir esta câmara a menos que esteja cheia de nitrogênio. Uma vez que ambas as câmaras sejam de nitrogênio, vamos transferir todas as nossas amostras junto com uma pipeta.

Teremos nosso pino e uma pinça que usaremos mais tarde para transferir as amostras. Então, vamos colocar nossas luvas, abrir a câmara aqui e, lenta e cuidadosamente, retirar tudo o que temos em nossa câmara de ar e colocá-lo na câmara principal. Esta é a placa de Petri com nosso substrato e a placa de Petri apenas com tolueno que vamos usar para lavar.

O pxi presente foi embalado sob nitrogênio e você não deve abrir esta garrafa a menos que esteja em um ambiente de nitrogênio. Portanto, quando você quiser retirar a amostra, coloque-a de volta no saco. Então você tira sua cilina e a concentração que vamos usar é de 2% em tolueno.

Então você tira, coloca no alto, nós misturamos. Bem, também coloque a câmara e certifique-se de que está bem misturado e, em seguida, deixe a amostra incubar em Toin por duas horas. Então, agora que duas horas se passaram, nossa amostra está em Pxi, vamos retirar a amostra e transferi-la para uma solução nova onde vamos lavá-la brevemente, desviá-la e movê-la para nossa câmara de câmara de ar.

Uma vez que esteja em nossa câmara de câmara de descompressão, vamos simplesmente abrir nossa câmara e retirar nossa superfície modificada e podemos dirigir usando a pistola de nitrogênio. Colocamos em uma placa de Petri limpa e seca novamente e colocamos no forno a cem graus C por mais duas horas. Então, agora que as amostras foram cozidas no forno a cem C por duas horas, vamos pegar e prender nossos fios aos eletrodos que preparamos.

Fazemos isso fazendo uma mistura individual de epóxi de prata e um agente de cura. Então, este é o epóxi de prata, e agora adicionamos a mesma quantidade de cura a ele. Queremos misturá-lo bem e, em seguida, vamos pegar isso e usar para conectar nossos fios.

Então, colocamos nosso fio nos eletrodos que queremos usar e depois o codificamos. A soldagem não funciona em ITO, portanto, temos que usar epóxi de prata e o agente de cura. E então assamos para que todo o agente de cura que usamos anteriormente seja removido e endureça e possamos usá-lo como eletrodo.

Então, agora que terminamos duas fases, vamos começar a terceira fase de um experimento, que é realizar a parte eletroquímica. Para fazer isso, vamos pegar uma amostra e colocá-la em nossa célula eletroquímica. Depois de colocá-lo em nossa célula eletroquímica, vamos colocar um O-ring em cima dele.

Isso vai isolar a região onde a eletroquímica vai acontecer, e então vamos apenas selar a célula. Então, coloquei minha amostra com meu fio preso na célula eletroquímica. Agora estou pronto para usar o stat potencial para aplicar a tensão.

Então, o fio branco, vou prendê-lo aqui mesmo ao eletrodo de referência, o vermelho, o contra-eletrodo e, finalmente, o verde que vou conectar ao nosso eletrodo de trabalho. Depois que todos esses eletrodos estiverem conectados, vou adicionar uma solução x de tampão fosfato salino ou PBS ao próprio eletroquímico. Agora, só para esclarecer isso, a maneira como vai funcionar é que toda a superfície a partir de agora é modificada com pxi.

Portanto, todos os eletrodos, incluindo as regiões de vidro circundantes, são modificados com pxi. Depois de aplicar a tensão em todos os lugares, onde o ITO está presente, que são os projetos de eletrodos que fizemos, a ilha de pinos sairá apenas dessas superfícies e nada será afetado nas regiões vizinhas. Portanto, removemos seletivamente a ilha de pinos de nosso substrato.

Então, agora vou apertar o play e isso iniciará e aplicará uma tensão de 1,4 volts negativos ao nosso eletrodo de trabalho. Quando a tensão é aplicada, há uma mudança de cor que você pode ver nos eletrodos. Muda do azul esverdeado transparente que tínhamos para marrom.

Suspeitamos que possa haver uma reação de oxidação que pode estar ocorrendo nos eletrodos que faz com que eles fiquem marrons. Este também é um dos indicadores de que o pxi da superfície foi realmente retirado da superfície. E mais uma vez, onde quer que você veja marrom, é de onde a ilha de pinos foi removida.

E as regiões de vidro ao redor ainda têm o PXI montado nele. Então, aplicamos uma tensão de 1,4 watts negativos por 60 segundos. Isso dá tempo suficiente para remover todo o pxi que estava presente nos eletrodos.

Também podemos usar esse método para remover eletrodos que são endereçados individualmente. Nesse caso, havia três fileiras de círculos que serão despojados. Podemos selecionar o que, quais queremos retirar usando todos os três eletrodos diferentes.

Então, agora terminamos com sucesso nossa terceira parte da eletroquímica, onde removemos o siling PG seletivamente de nossos eletrodos ITO. Lavei brevemente com PBS e água DI, removi o fio e coloquei as amostras em apenas seis placas de poços regulares. Agora vamos seguir em frente e cultivar células nesses eletrodos.

Então, agora aqui estamos na sala de cultura de tecidos. Para a fase final do experimento, vamos usar fibroblastos hoje, três células T, três. A concentração que usamos para semear as células está entre 0,5 a 1,5 milhão de células por mil.

Após a semeadura das células, deixamos as células em nossa amostra por aproximadamente 20 minutos. Isso permitiria tempo suficiente para anexá-lo às regiões despojadas. Então, vamos colocá-lo na incubadora.

Então, agora já se passaram 20 minutos e estamos prontos para olhar para as células que padronizaram as regiões despojadas de ITO, as regiões marrons que vimos anteriormente, e elas só se ligariam especificamente a essas regiões e não se ligariam a nenhum lugar fora dessas regiões. Aqui você pode ver que as regiões marrons eram regiões ITO que foram despojadas de pxi. Usando eletroquímica, as células se ligaram apenas a essas regiões marrons e não às regiões de vidro circundantes.

Neste outro quadro, mais uma vez, vemos seltz se ligando às regiões despojadas. Essas são as regiões marrons, mas acima dessas regiões marrons você mal pode ver e o design ITO PEG não foi retirado desse design ITO, portanto, não há células ligadas a ele. Ok, então é isso.

Terminamos o protocolo e as células têm padrão nos eletrodos ITO e é exatamente isso que queríamos. Acabei de mostrar o controle da adesão celular em eletrodos de óxido de índio 10 opticamente transparentes microfabricados. Hoje eu mostrei a vocês como padronizar TRÊS três fibroblastos nesses eletrodos.

Também usamos o mesmo procedimento para padronizar células Hep G dois, células satélites e células primárias de ratos. As técnicas atuais de padronização de células permitem apenas a montagem de dois tipos de células na superfície. A flexibilidade desta técnica permitirá a montagem de vários tipos de células na superfície que serão espacialmente isoladas no futuro.

Planejamos usar essa técnica para isolar espacialmente três tipos diferentes de células hepáticas no substrato ITO, a fim de imitar o microambiente in vivo. Ao fazer isso, podemos isolar espacialmente células imaturas ou células-tronco junto com células maduras e células de suporte. Isso criará um ambiente instrutivo para as células imaturas crescerem e se diferenciarem.