Rejeição de fundo de fluorescência em Ressonância e microspectroscopy Raman espontâneo

O objetivo deste procedimento é construir um gait óptico total que transmita a luz dispersa Raman enquanto rejeita sinais fluorescentes. Isso é realizado primeiramente excitando e polarizando a dispersão Raman. O segundo passo do procedimento é preparar o feixe de bombeamento para operar a comporta.

Em terceiro lugar, a bomba, o sinal de referência (ram) e os pulsos devem ser ajustados de modo que se sobreponham. O passo final do procedimento é adquirir espectros com portão temporal. Em última análise, podem ser obtidos resultados que demonstram quantificação e classificação bioquímicas por meio da análise dos sinais Raman com altas relações sinal-ruído.

A principal vantagem desta técnica em relação aos métodos existentes, como a remoção por software do fundo de fluorescência, é que o ruído de disparo produzido pela fluorescência é significativamente reduzido. Este método pode ajudar a responder perguntas fundamentais nas áreas biológica e biomédica, tais como a caracterização não invasiva da composição química de fluoróforos endógenos em células bacterianas e tecidos, o entendimento de processos celulares e doenças como câncer, vasculares ou neurodegenerativas, por meio do uso de marcadores intrínsecos. Este método também pode auxiliar no desenvolvimento de novas sondas que poderiam ser utilizadas tanto como marcadores fluorescentes quanto como marcadores RAM, bem como em sensores médicos não invasivos para análise sanguínea.

Embora este método possa fornecer informações sobre sistemas biológicos para a engenharia biomédica, ele também pode ser aplicado a outras áreas, como a produção de biocombustíveis, pesquisa ou indústria de telecomunicações. As amostras biológicas são normalmente colocadas em uma lamínula de espessura número um montada em uma câmara de célula ATO Fluor.

Amostras líquidas, particularmente aquelas tóxicas para os seres humanos, são colocadas em um pequeno frasco de vidro com uma lamínula cimentada à abertura por meio de epóxi de silicone, que é então invertido para medição. Coloque as amostras na platina secundária montada sobre a platina do microscópio, a qual possui controle de foco independente, a fim de obter espectros Raman com portão temporal. Primeiro, o feixe de excitação deve ser adequadamente preparado. Comece com a luz proveniente de um laser de safira pulsado e sintonizável de 2,4 watts. Cada pulso na sequência de pulsos de 80 megahertz deve ter 30 nanojoules de energia, uma largura temporal de 140 femtosegundos e um espectro centrado em 808 nanômetros, com uma largura espectral de cerca de seis nanômetros. Para evitar reflexões que possam retornar à cavidade do laser, a luz deve passar por um isolador de Faraday. Coloque uma placa de meia onda antes do isolador de Faraday para permitir o ajuste contínuo da potência total enviada ao sistema.

Como seis nanômetros é uma largura de banda muito ampla para resolver a maioria dos modos Raman, o feixe é enviado através de um filtro de passagem de banda muito estreita. Envie-o a 808 nanômetros. Em seguida, use um duplete aromático para focalizar a luz em um beta borato de bário de cinco milímetros.

Oito cristais para reduzir pela metade o comprimento de onda de 808 nanômetros para 404 nanômetros. Coloque o cristal de beta bariato de boro em um suporte com controles de inclinação e rotação montado em uma plataforma de translação. Para maximizar a eficiência da conversão de comprimento de onda, o cristal deve ser posicionado simetricamente em relação ao foco do duplete e com seu eixo cristalino alinhado à polarização do feixe incidente.

Como a eficiência da conversão de comprimento de onda depende da polarização, pode-se controlar a quantidade de luz enviada à amostra colocando uma segunda placa de meia onda após o isolador de Faraday. Ao girar essa placa de onda, a intensidade da luz enviada à amostra pode ser ajustada independentemente da intensidade enviada ao feixe de bombeamento. A luz com comprimento de onda convertido é então recolimada por um segundo duplete aromático escolhido de modo que o feixe excitador seja grande o suficiente para preencher a abertura traseira do objetivo do microscópio e direcionado a um microscópio invertido por meio de dois espelhos de direcionamento.

O objetivo do microscópio define o eixo óptico para alinhar o feixe de excitação a esse eixo. Coloque um espelho no plano da amostra do microscópio. Os dois espelhos direcionadores são então ajustados iterativamente enquanto se observa o feixe a laser refletido de volta em uma câmera CCD acoplada à porta de imagem do microscópio.

Supondo que a imagem na câmera esteja centralizada no campo de visão do microscópio, o feixe está alinhado com o eixo. Quando o ponto focal está centralizado no chip do microscópio e a translação do objetivo ao longo do eixo Z não muda. O ponto central do espalhamento Raman defocado ocorre quando a amostra é colocada no plano da amostra e irradiada com luz laser.

Um filtro dicróico colocado abaixo da objetiva do microscópio separa a luz dispersa Raman, deslocada em comprimento de onda, do feixe de excitação, direcionando a luz dispersa Raman para a saída lateral do microscópio. O microscópio foi modificado para remover todas as lentes ao longo desse trajeto, de modo que a luz do sinal emerge do microscópio revestida, pois o feixe de sinal que emerge do microscópio é maior que a abertura útil da lente.

Os polarizadores Thompson, um telescópio de 0,47 vezes construído com dois dubletos aromáticos, é usado para reduzir o feixe. A luz do sinal é então polarizada por um polarizador Thompson gland orientado a zero grau em relação à vertical no referencial do laboratório e direcionada a um espelho dicróico, onde é recombinada com o feixe de bombeio. O feixe de bombeio é enviado a uma linha de atraso composta por dois espelhos em ângulos retos um em relação ao outro, ambos colocados em uma plataforma de translação linear que pode ser ajustada para garantir a sobreposição temporal dos pulsos de bombeio e do sinal.

Após a linha de atraso, o feixe é enviado através de uma placa polarizadora posicionada na metade do caminho e orientada a 45 graus em relação à vertical no referencial do laboratório. Isso garante o estado de polarização adequado do feixe de bombeamento quando ele atinge o meio não linear. Em seguida, a luz é refletida por dois espelhos direcionadores, sendo um deles com controle piezoelétrico, que deve ser utilizado para ajustar finalmente a posição do feixe de bombeamento, de modo que ele se sobreponha espacialmente ao feixe sinal.

Para obter essa sobreposição, observe os feixes de bombeamento e sinal em dois locais, um próximo e outro distante do espelho dicróico onde os feixes são combinados, utilizando o primeiro espelho direcional para sobrepor os dois feixes no ponto próximo e o espelho piezoelétrico para sobrepor os feixes no ponto distante, podendo assim tornar o feixe de bombeamento exatamente colinear aos feixes de sinal. Em seguida, o sistema de corrugação e coleta deve ser configurado para maximizar o sinal coletado com porta temporal. Para isso, os feixes de bombeamento e sinal são inicialmente passados por um filtro dicroico que possui uma OD de seis em 404 nanômetros, evitando que qualquer luz residual de excitação excite e espalhe dentro do meio não linear.

Os feixes de bombeamento e sinal são então focalizados por um duplote aromático em uma célula de quartzo com caminho óptico de um centímetro contendo o material não linear; qualquer material não linear, desde que possua um índice não linear suficientemente alto e uma resposta temporal suficientemente curta, pode ser utilizado aqui. Para esses experimentos, utilizamos dissulfeto de carbono. Em seguida, a luz é recolimada por um segundo duplote com distância focal idêntica à do primeiro.

Os feixes são então direcionados através de um analisador gland Thompson montado em uma base rotativa e, em seguida, através de um conjunto de filtros de absorção e interferência que, combinados, apresentam uma DO de 10 em 808 nanômetros. Finalmente, a luz do sinal é focalizada por um duplete aromático em uma fibra óptica multimodo de 50 mícrons, sendo a fibra montada em uma plataforma que permite translação nas direções X, Y e Z. A fibra é então acoplada a um espectrógrafo de imagem comercial com câmera CCD acoplada, para alinhar o sistema de coleta e maximizar o sinal coletado, ajustar o analisador para zero grau e posicionar uma amostra-teste de tolueno no plano da amostra, otimizando o sinal Raman coletado mediante ajuste dos controles X, Y e Z do suporte da fibra, garantindo a sobreposição espacial e temporal adequada dos feixes de bombeamento e de sinal. Posicione um espelho no plano da amostra do microscópio.

Em seguida, remova o filtro de 404 nanômetros do sistema. Gire o analisador para 90 graus, de modo que o feixe de 404 nanômetros retrorefletido seja direcionado ao espectrógrafo com a intensidade ajustada para não saturar a câmera. Agora, com o feixe de bombeamento desligado, gire o analisador para minimizar o sinal de 404 nanômetros transmitido.

Em seguida, religue o feixe de bombeamento e ajuste lentamente a plataforma de atraso até que a transmissão da luz de 404 nanômetros comece a aumentar. A seguir, ajuste iterativamente a plataforma de atraso, o espelho piezoelétrico e os controles X, Y e Z da fibra para maximizar o sinal, pois o feixe retrorefletido de 404 nanômetros e a luz dispersa Raman podem percorrer caminhos ligeiramente diferentes pelo sistema. Faça ajustes finais colocando um dispersor Raman forte, como o tolueno, na platina da amostra, substituindo o filtro Raman e ajustando levemente o alinhamento por meio da alteração da plataforma de atraso, do espelho piezoelétrico e dos controles X, Y e Z da fibra para otimizar o sinal Raman.

Agora o sistema está pronto para coletar espectros. Isso exige inicialmente a aquisição de várias curvas de fundo para corrigir artefatos do sistema. Primeiro, com o analisador ajustado em zero grau, o feixe de excitação ligado e o feixe de bombeamento desligado.

Obtenha um espectro sem filtragem, depois ajuste o analisador em 90 graus e colete um espectro de fundo que represente a luz dispersa que atravessa os polarizadores. Em seguida, mantendo o analisador em 90 graus, desligue o feixe Raman e ligue o feixe de bombeamento. Colete um segundo espectro de fundo que represente a quantidade de luz do bombeamento que atravessa os filtros dicróicos.

Por fim, com todos os lasers desligados, colete um espectro escuro de referência que represente o nível de corrente escura da câmera e da eletrônica. Em seguida, ligue todos os feixes e colete um espectro com porta ativa. Para obter o espectro real apenas da luz que passa pela porta, os dois espectros de fundo e o espectro escuro devem ser subtraídos desse espectro com porta ativa.

Aqui vemos um diagrama esquemático do sistema corrugador. O trajeto do feixe de bombeamento é mostrado como uma linha vermelha contínua, enquanto o trajeto do SHG é mostrado como uma linha azul-marinho contínua. O trajeto onde raman e fluorescência se sobrepõem é mostrado em verde.

Enquanto o caminho onde a fluorescência foi temporariamente filtrada é mostrado em amarelo. Aqui observamos os espectros brutos da cumarina dissolvida em óleo de imersão. A curva vermelha mostra o espectro obtido com o portão mantido aberto, enquanto a curva preta mostra o espectro obtido com o analisador alinhado para transmissão mínima e um feixe de bombeamento aplicado.

A curva azul mostra o espectro obtido com o analisador alinhado para transmissão mínima e sem feixe de bombeamento aplicado, e a curva verde mostra o espectro obtido com apenas o feixe de bombeamento aplicado. Todos os espectros foram suavizados com um filtro KY gole de terceira ordem e 11 pontos. As linhas magenta tracejadas indicam a região espectral mostrada no gráfico seguinte.

Aqui observamos os espectros da cumarina dissolvida em óleo de imersão após a subtração do fundo de fluorescência. A curva vermelha é o espectro com o gate aberto, e a curva azul é o espectro com gate. O espectro com gate mostra claramente o pico característico em alto número de onda, típico dos óleos.

Ao tentar este procedimento, é importante lembrar que o laser deve ter energia de pulso suficiente para acionar o ga, e que o sistema exige uma sobreposição espacial e temporal precisa dos dois pulsos. Após assistir a este vídeo e ler o protocolo anexo, você deverá ter uma boa compreensão de como separar o feixe de laser em um feixe de excitação e um feixe de curva, e de como sobrepor esses dois feixes, tanto espacial quanto temporalmente.

Como registrar um sinal de raman por meio de espectrógrafo e C, c, D, e também como visualizar e analisar o sinal de raman. Não se esqueça de que trabalhar com lasers pode ser extremamente perigoso, e precauções, como o uso de óculos de proteção para laser, devem sempre ser tomadas ao realizar este procedimento. Regras adicionais de segurança se aplicam ao uso do material não linear e ao uso da sua amostra específica.