Rejeição de fundo de fluorescência em Ressonância e microspectroscopy Raman espontâneo

Discutimos a construção e operação de um sistema não-linear complexa óptico que utiliza comutação totalmente óptica ultra-rápida para isolar Raman a partir de sinais de fluorescência. Usando este sistema, somos capazes de separar com sucesso sinais Raman e fluorescência utilizando energias de pulso e poderes média que permanecem biologicamente seguro.

O objetivo deste procedimento é construir uma marcha totalmente óptica que passe pela luz espalhada Raman enquanto rejeita sinais fluorescentes. Isso é feito primeiro excitando e polarizando o espalhamento Raman. A segunda etapa do procedimento é preparar o feixe da bomba para operar o portão.

Em terceiro lugar, a bomba, o aríete e os pulsos devem ser ajustados para que se sobreponham. A etapa final do procedimento é adquirir espectros dependentes de tempo. Em última análise, podem ser obtidos resultados que mostram quantificação e classificação bioquímica por meio da análise de sinais de ramen com altas relações sinal-ruído.

A principal vantagem dessa técnica sobre os métodos existentes, como a remoção de software do fundo de fluorescência, é que o ruído de disparo produzido pela fluorescência é significativamente reduzido. Este método pode ajudar a responder a questões-chave nos campos biológico e biomédico, como a caracterização não invasiva da composição química do flúor endógeno em células e tecidos bacterianos, a compreensão de processos celulares e doenças como câncer, doenças vasculares ou neurodegenerativas usando marcadores intrínsecos. Este método também pode ajudar no desenvolvimento de novas sondas que podem ser usadas como rótulos de fluorescência e RAM, bem como para sensores médicos não invasivos para análise de sangue.

Embora este método possa fornecer informações sobre sistemas biológicos para engenharia biomédica. Também pode ser aplicado a outros campos, como biocombustíveis, pesquisa ou indústria de telecomunicações. As amostras biológicas são normalmente colocadas em uma lamínula de espessura número um montada em uma câmara de células ATO Fluor.

Amostras líquidas, particularmente aquelas tóxicas para humanos, são colocadas em um pequeno frasco de vidro com uma lamínula cimentada na abertura por meio de epóxi de silicone, que é então invertido para medição coloque as amostras no estágio secundário montado no topo do estágio do microscópio que tem seu próprio controle de foco independente para obter espectros de ramen com controle de tempo, Primeiro, o feixe de excitação deve ser preparado adequadamente. Comece com a luz emergindo de um laser de safira GI pulsado ajustável de 2,4 watts. Cada pulso no trem de pulso de 80 megahertz deve ter 30 nano joules de energia, uma largura temporal de 140 femtossegundos e um espectro centrado em 808 nanômetros com uma largura de banda espectral de cerca de seis nanômetros para evitar que os reflexos traseiros entrem novamente na cavidade do laser, a luz deve ser passada através de um local isolador de Faraday, uma placa de meia onda antes do isolador de Faraday para permitir o ajuste contínuo da potência total enviada para o sistema.

Como seis nanômetros é uma largura de banda muito ampla para resolver a maioria dos modos ramen, o feixe é enviado através de um filtro passa-banda muito estreito. Envie-o em 808 nanômetros. Em seguida, use um gibão aromático para focar a luz em um orifício de bário beta de cinco milímetros.

Oito cristais a metade do comprimento de onda de 808 nanômetros a 404 nanômetros. Coloque o cristal de beta bário em um suporte com controles de ponta e inclinação montados em um estágio de translação. Para maximizar a eficiência da conversão de comprimento de onda, o cristal deve ser colocado precisamente simétrico em relação ao foco do dupleto e com seu eixo cristalino alinhado à polarização do feixe de entrada.

Como a eficiência da conversão de comprimento de onda depende da polarização, o controle sobre a quantidade de luz enviada à amostra pode ser obtido colocando uma segunda placa de meia onda após o isolador de Faraday. Ao girar esta placa de onda, a intensidade da luz enviada à amostra pode ser ajustada independentemente da intensidade enviada no feixe da bomba. A luz convertida no comprimento de onda é então colimada novamente por um segundo gibão aromático escolhido de modo que o feixe excitante seja grande o suficiente para preencher a abertura traseira da objetiva do microscópio e direcionado para um microscópio invertido por meio de dois espelhos de direção.

A objetiva do microscópio define o eixo óptico para alinhar o feixe de excitação a esse eixo. Coloque um espelho no plano de amostra do microscópio. Os dois espelhos de direção são então ajustados iterativamente enquanto observam o feixe de laser refletido na parte traseira em uma câmera CCD conectada à porta de imagem do microscópio.

Supondo que a imagem na câmera esteja centralizada no campo de visão do microscópio, o feixe está no eixo. Quando o ponto focal está centrado no chip do microscópio e a translação da objetiva ao longo do eixo Z não muda. O ponto central do espalhamento de ramen de feixe desfocado ocorre quando a amostra é colocada no plano de amostra e é irradiada com luz laser.

Um filtro dicróico colocado abaixo da objetiva do microscópio separa a onda deslocada. Ramen espalhou a luz do feixe de excitação direcionando a luz espalhada ramen para a porta lateral do microscópio. O microscópio foi modificado para remover quaisquer lentes dentro desse caminho, de modo que a luz de sinalização emerge do microscópio revestido porque o feixe de sinal que emerge do microscópio é maior que a abertura clara da glândula.

Polarizadores Thompson, um telescópio de 0,47 vezes construído com dois dupletos aromáticos é usado para encolher o feixe. A luz de sinalização é então polarizada por um polarizador Thompson orientado a zero graus em relação à vertical na estrutura do laboratório e direcionado para um espelho dicróico onde é recombinado com o feixe da bomba. O feixe da bomba é enviado para uma linha de atraso composta por dois espelhos perpendiculares entre si, ambos colocados em um estágio de translação linear que pode ser ajustado para garantir a sobreposição temporal da bomba e dos pulsos de sinal.

Após a linha de atraso, o feixe é enviado através de uma placa intermediária e polarizador orientado a 45 graus em relação à vertical na estrutura do laboratório. Isso garante o estado de polarização adequado do feixe da bomba quando ele atinge o meio não linear. A luz é então refletida por dois espelhos de direção, um com controles piezoelétricos, que devem ser usados para finalmente ajustar a posição do feixe da bomba de modo que ele se sobreponha espacialmente ao feixe de sinal.

Para obter essa sobreposição, observe a bomba e os feixes de sinal em dois locais, um próximo e outro distante do espelho dicróico onde os feixes são combinados usando o primeiro espelho de direção para sobrepor os dois feixes no ponto próximo e o espelho pizo para sobrepor os feixes no ponto distante, o feixe da bomba pode ser feito exatamente colina com os feixes de sinal. Em seguida, o sistema de papelão ondulado e coleta deve ser configurado para maximizar o sinal de tempo coletado. Para fazer isso, a bomba e os feixes de sinal são primeiro passados por um filtro diic que tem um diâmetro externo de seis a 404 nanômetros para evitar que qualquer luz de excitação residual se excite e se espalhe dentro do meio não linear.

A bomba e os feixes de sinal são então focados por um gibão aromático em um trajeto de um centímetro de comprimento de quartzo contendo o material não linear, qualquer material não linear, com um índice não linear adequadamente alto e uma resposta temporal adequadamente curta pode ser utilizado. Aqui. Para esses experimentos, usamos dissulfeto de carbono. A luz é então colimada novamente por um segundo gibão com uma distância focal idêntica à primeira.

Os feixes são então passados por um analisador Thompson em uma montagem rotativa e, em seguida, por um conjunto de filtros de absorção e interferência que, combinados, têm um diâmetro externo de 10 a 808 nanômetros. Finalmente, a luz de sinal é focalizada por um gibão aromático em uma fibra óptica multimodo de 50 mícrons, onde a fibra é montada em um estágio que permite a tradução em X, Y e Z. A fibra é então acoplada a um espectrógrafo de imagem comercial com câmera CCD anexada para alinhar o sistema de coleta para maximizar o sinal coletado, defina o analisador para zero graus e coloque uma amostra de teste de tolueno no plano da amostra, otimize o sinal Raman coletado ajustando os controles X, Y e Z da montagem de fibra para garantir a sobreposição espacial e temporal adequada da bomba e dos feixes de sinal. Coloque um espelho no plano de amostra do microscópio.

Em seguida, remova o filtro de 404 nanômetros do sistema. Gire o analisador para 90 graus para que o feixe retrorefletido de 404 nanômetros seja enviado ao espectrógrafo com a intensidade ajustada de forma que não sature a câmera. Agora, com o feixe da bomba desligado, gire o analisador para minimizar o sinal transmitido de 404 nanômetros.

Em seguida, ligue o feixe da bomba novamente e ajuste lentamente o estágio de atraso até que a transmissão da luz de 404 nanômetros comece a aumentar. Em seguida, gire iterativamente, o estágio de atraso, o espelho piezoelétrico e os controles X, y e Z da fibra para maximizar o sinal, porque o feixe retrorefletido de 404 nanômetros e a luz espalhada Raman podem seguir caminhos ligeiramente diferentes através do sistema. Faça os ajustes finais colocando um forte dispersor Raman, como o tolueno, no estágio de amostra, substituindo o filtro Raman e ajustando levemente o alinhamento alterando o atraso stage pizo elétrico

Agora o sistema está pronto para coletar espectros. Isso primeiro requer a aquisição de várias curvas de fundo para corrigir os artefatos do sistema. Primeiro, com o analisador ajustado para zero grau, o feixe de excitação ligado e o feixe da bomba desligado.

Obtenha um espectro não fechado, ajuste o analisador para 90 graus e colete um espectro de fundo representando a luz difusa vazando através dos polarizadores. Em seguida, com o analisador permanecendo a 90 graus, desligue o feixe de ramen e ligue o feixe de bombeamento. Colete um segundo espectro de fundo representando a quantidade de luz da bomba que vaza através dos filtros dicróicos.

Finalmente, com todos os lasers desligados, colete um espectro escuro de linha de base representando o nível de corrente escura da câmera e dos componentes eletrônicos. Por fim, ligue todos os feixes e colete um espectro fechado. Para obter o verdadeiro espectro apenas da luz através do portão, os dois espectros de fundo e o espectro escuro devem ser subtraídos desse espectro fechado.

Aqui vemos um diagrama esquemático do sistema de papelão ondulado. O caminho do feixe da bomba é mostrado como uma linha vermelha sólida, enquanto o caminho SHG é mostrado como uma linha azul marinho sólida. O caminho onde o ramen e a fluorescência são sobrepostos é mostrado em verde.

Enquanto o caminho onde a fluorescência foi temporariamente filtrada é mostrado em amarelo. Aqui vemos os espectros brutos da cumarina dissolvida em óleo de imersão. A curva vermelha mostra o espectro obtido com a porta aberta e a curva preta mostra o espectro obtido com o analisador alinhado para transmissão mínima e um feixe de bomba aplicado.

A curva azul mostra o espectro obtido com o analisador alinhado para transmissão mínima e nenhum feixe de bomba aplicado, e a curva verde mostra o espectro obtido apenas com o feixe de bomba aplicado. Todos os espectros foram suaves com um filtro KY gole de terceira ordem de 11 pontos. As linhas magenta tracejadas indicam a região espectral mostrada no gráfico a seguir.

Aqui vemos espectros de cumarina dissolvida em óleo de imersão após a subtração do fundo de fluorescência. A curva vermelha é o espectro com a porta mantida aberta e a curva azul é o espectro fechado. O espectro fechado mostra claramente o número de ondas alto complicado, característica de pico dos óleos.

Ao tentar este procedimento, é importante lembrar que o laser deve primeiro ter energia de pulso suficiente para acionar o ga e que o sistema requer sobreposição espacial e temporal requintada dos dois pulsos. Depois de assistir a este vídeo e ler o protocolo anexo, você deve ter uma boa compreensão de como separar o feixe de laser em um feixe de excitação e curva. Como sobrepor esses dois feixes, tanto espacial quanto temporalmente.

Como registrar um sinal de ramen via espectrógrafo e C, c, D, e também como visualizar e analisar o sinal de ramen. Não se esqueça de que trabalhar com lasers pode ser extremamente perigoso, e precauções como usar óculos de laser devem sempre ser tomadas ao tentar este procedimento. Regras de segurança adicionais se aplicam ao uso do material não linear e ao uso de sua amostra específica.