Um Procedimento de 1,5 horas para a Identificação de Enterococcus Espécies Diretamente de hemoculturas
10 de fevereiro de 2011
Um protocolo rápido para a identificação directa de Enterococcus faecalis e Enterococcus outras espécies a partir de uma hemocultura positiva usando um ácido nucléico Peptide fluorescentes em ensaio de hibridização in situ (FISH PNA).
O objetivo geral deste procedimento é identificar rapidamente espécies de Enterococcus a partir de frascos de hemocultura positivos utilizando hibridização fluorescente por ácido peptídico nucleico e C dois. Após a preparação das hemoculturas e a realização do teste de Gram para confirmar a presença de Enterococci na cultura, as amostras são fixadas em lâminas de microscopia PNA FISH. Em seguida, as lâminas são incubadas com sondas PNA específicas para os organismos de interesse.
Após a hibridização das sondas, realiza-se uma lavagem rigorosa para remover o excesso de sonda não hibridizada. Adiciona-se meio de montagem às lâminas, que são então seladas com lamínulas. As espécies de enterococos presentes na amostra podem ser identificadas por microscopia de fluorescência.
Este protocolo de identificação de PNA Fish é único por fornecer um método rápido e específico para a identificação de enterococos provenientes de paralisia. Incube duas garrafas de hemocultura, uma aeróbica e uma anaeróbica, contendo sangue venoso de um paciente suspeito de sepse, em um instrumento automatizado de hemocultura a 35 graus Celsius. Assim que o dispositivo indicar detecção de crescimento microbiano, retire a garrafa e agite suavemente as garrafas de hemocultura para ressuspender uniformemente as bactérias.
Em seguida, utilizando uma seringa e agulha estéreis, transfira assépticamente cerca de cinco mililitros de sangue de cada frasco para um tubo distinto com tampa de rosca. Após distribuir todas as amostras, use uma pipeta estéril para transferir uma gota de sangue de cada tubo para uma lâmina de microscópio de vidro separada. Deixe a lâmina secar ao ar por aproximadamente 15 minutos.
Em seguida, após a lâmina estar completamente seca, imerja-a em metanol para fixar a amostra. Após as lâminas terem sido fixadas, lave-as e realize uma coloração de Gram padrão para determinar a morfologia dos organismos presentes em cada cultura sanguínea. Examine as lâminas coradas utilizando um microscópio com objetivo de imersão em óleo.
Uma espécie de *Coccus* aparecerá como cocos gram-positivos, geralmente organizados em pares ou cadeias curtas. Coloque uma gota da solução de fixação no poço de uma lâmina de microscópio P e um peixe. Misture suavemente o tubo de hemocultura a ser testado.
Em seguida, transfira 10 microlitros de cultura para a gota da solução de fixação e pipete para cima e para baixo para emulsificar a amostra. Coloque as lâminas em uma placa aquecedora a 55 graus Celsius por 20 minutos para fixar os esfregaços em cada teste. Certifique-se de incluir lâminas de controle positivo e negativo para avaliação da qualidade do ensaio.
As lâminas controle de caloso podem ser adquiridas de um Van DX ou preparadas usando culturas de referência. Uma vez que a esfregaço esteja pronto, coloque uma gota de caloso EFI O-E-P-N-A no poço contendo a amostra de hemocultura, bem como nos poços controle positivo e negativo. Para evitar a contaminação da solução estoque da sonda, certifique-se de não permitir que a ponta do frasco com conta-gotas toque o esfregaço sanguíneo.
Coloque uma lamínula sobre a amostra, tomando cuidado para não criar bolhas de ar. Em seguida, incube a lâmina em um bloco de aquecimento a 55 graus Celsius por 30 minutos. Para permitir a hibridização da PNA após a incubação, coloque as lâminas em um porta-lâminas.
Imersa o porta-objetos carregado em um recipiente de coloração contendo Solução de Lavagem pré-aquecida a 55 graus Celsius. Para remover o excesso de PNA da amostra, retire suavemente a lamínula agitando o lâmina no tampão ou utilizando pinça. Incube a lâmina a 55 graus Celsius na solução de lavagem por 30 minutos.
Em seguida, remova a lâmina do recipiente de coloração e deixe secar ao ar. Assim que a lâmina estiver seca, adicione uma gota de meio de montagem à temperatura ambiente sobre a lâmina e coloque cuidadosamente uma lamínula sobre a amostra. Examine as lâminas em um microscópio de fluorescência utilizando um filtro de dupla banda dentro de duas horas após o preparo.
Utilizando este método, seixo, caloso, mostrado em verde à esquerda, pode ser distinguido de eum em vermelho. No painel central, mais à direita, está um resultado negativo. Três aspectos a lembrar para obter resultados bem-sucedidos são: as temperaturas do instrumento devem ser mantidas nas temperaturas definidas.
Você precisa seguir rigorosamente o procedimento de coloração conforme descrito na bula. E, finalmente, é necessário ter um leitor experiente que realize uma análise cuidadosa da lâmina. Este protocolo é útil para tomar decisões terapêuticas no tratamento da sepse causada por enterococo.
Obrigado por assistir e boa sorte com seus experimentos.
Visão Geral
Este artigo apresenta um protocolo rápido para identificar Enterococcus faecalis e outras espécies de Enterococcus a partir de culturas sanguíneas positivas utilizando um ensaio de hibridização in situ fluorescente com ácido peptídico nucleico (PNA FISH). O método permite uma identificação rápida e específica, auxiliando no tratamento da sepse.
Componentes Principais do Estudo
Área da Ciência
- Microbiologia
- Diagnóstico clínico
- Doenças infecciosas
Antecedentes
- As espécies de Enterococcus são patógenos significativos em infecções da corrente sanguínea.
- A identificação rápida a partir de culturas sanguíneas é crucial para um tratamento eficaz.
- A técnica PNA FISH oferece um método específico para identificar esses organismos.
- O protocolo foi projetado para ser eficiente e confiável.
Objetivo do Estudo
- Desenvolver um método de identificação rápida para espécies de Enterococcus.
- Agilizar o diagnóstico em ambientes clínicos.
- Auxiliar na tomada oportuna de decisões terapêuticas para o tratamento da sepse.
Métodos Utilizados
- Preparação de culturas de sangue e coloração de Gram para confirmar a presença de Enterococcus.
- Uso de sondas PNA específicas para espécies de Enterococcus.
- Microscopia de fluorescência para visualização das amostras hibridizadas.
- Inclusão de lâminas controle para avaliação da qualidade.
Resultados Principais
- Identificação bem-sucedida de espécies de Enterococcus utilizando FISH com PNA.
- A microscopia de fluorescência distingue efetivamente entre espécies.
- Resultados rápidos facilitam a tomada de decisões clínicas oportunas.
- O protocolo demonstra alta especificidade e confiabilidade.
Conclusões
- O protocolo FISH com PNA é uma ferramenta valiosa para o diagnóstico microbiológico.
- Ele aumenta a velocidade de identificação de patógenos em culturas sanguíneas.
- Este método pode impactar significativamente o manejo da sepse.
Perguntas Frequentes
Relevância Executiva para a Indústria
A identificação rápida de Enterococcus em nível de espécie a partir de hemoculturas apoia a gestão oportuna de antimicrobianos e a vigilância de resistência no tratamento da sepse. A diferenciação entre E. faecalis e E. faecium orienta decisões terapêuticas precoces, dadas as diferentes características de resistência. Este ensaio PNA FISH de 1,5 hora permite reduzir os riscos nas escolhas terapêuticas empíricas em programas de doenças infecciosas em fase de descoberta.
Aplicações Estratégicas em P&D de Biotecnologia Farmacêutica
Descoberta Inicial e Validação de Alvo
- Valor Científico: Permite testar hipóteses sobre mecanismos de virulência específicos de espécies em modelos de bacteriemia.
- Valor Operacional: Fornece identificação microbiana padronizada para estudos pré-clínicos reprodutíveis de sepse.
- Valor Preditivo: Apoia a confiança no alvo ao associar a identificação da espécie a perfis diferenciais de resposta ao fármaco.
Desenvolvimento de Triagem e Ensaios
- Prontidão do Ensaio: Gera saídas de fluorescência quantificadas para validação de hits em cascatas de triagem antimicrobiana.
- Reprodutibilidade: Inclui controles positivos/negativos embutidos, garantindo a robustez do ensaio entre diferentes operadores.
- Escalabilidade: Compatível com processamento de lâminas em alto rendimento para perfilagem de bibliotecas de compostos.
Pesquisa Translacional e Pré-clínica
- Relevância para a Doença: Modela a fisiopatologia da bacteremia ao permitir a caracterização de modelos de sepse estratificados por espécie.
- Continuidade Tradutiva: Conecta a validação de alvos in vitro a estudos de eficácia in vivo utilizando cepas microbianas clinicamente relevantes.
- Mitigação de Riscos: Reduz a atribuição incorreta de efeitos terapêuticos a alvos microbianos errados em modelos de sepse.
Integração de Pipeline e Fluxo de Trabalho
Posiciona a identificação microbiana como uma etapa crítica entre a validação do alvo e a otimização do composto inicial na descoberta de agentes anti-infecciosos.
- Biologia da Descoberta: Confirma a atividade no alvo ao verificar as espécies causadoras em modelos de infecção antes da elucidação do mecanismo.
- Triagem: Permite a determinação específica da CIM por espécie para avaliação precisa da potência do composto.
- Análises: Fornece resultados binários por espécie que classificam os compostos ativos conforme seu espectro de atividade.
- Pesquisa Translacional: Assegura que os modelos pré-clínicos reflitam a diversidade de isolados clínicos para validade preditiva.
- Reutilização Corporativa: Adaptável a outros patógenos Gram-positivos mediante redesign de sonda para aplicação em toda a plataforma.
Impacto Operacional e Empresarial
- Valor Científico: Reduz a ambiguidade mecanicista na interpretação de modelos de sepse por meio da identificação precisa do patógeno.
- Valor Operacional: Padroniza fluxos de trabalho microbiológicos entre equipes de descoberta e pré-clínicas.
- Valor Estratégico: Melhora as decisões de avançar ou não avançar ao eliminar a identificação incorreta de espécies como um fator de confusão nos dados de eficácia.
- Impacto no Portfólio: Permite o avanço estratificado por risco de candidatos de espectro estreito versus amplo com base na epidemiologia de resistência.
Considerações sobre a Implementação
- Requer experiência em microscopia de fluorescência e técnicas de hibridização de ácidos nucleicos.
- Depende de equipamento de ciclagem térmica capaz de manter 55 °C durante as etapas de fixação, hibridização e lavagem.
- Necessita de protocolos padronizados de preparação de lâminas para garantir fixação consistente da amostra e acessibilidade da sonda.
- Requer validação em diferentes cepas de Enterococcus para confirmar a especificidade da sonda em painéis globais de isolados.
- Limita-se às espécies detectáveis com sondas PNA disponíveis; espécies novas ou raras podem exigir métodos complementares.
