Name: Um Procedimento de 1,5 horas para a Identificação de Enterococcus Espécies Diretamente de hemoculturas (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-02-10T20:00:00.000+00:00
Duration: 5 min 2 s
Description: Aprenda a identificar rapidamente espécies de Enterococcus em hemoculturas usando o ensaio PNA FISH. Este método específico auxilia no diagnóstico clínico e nas decisões terapêuticas para tratamento de sepse.

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Estudos foram patrocinados pela AdvanDx.

1. Coleta e Preparação <ol><li> Coleta de sangue venoso de pacientes com suspeita de sepse e colocar em duas BACTEC (BD, Sparks, MD) garrafas de cultura de sangue, uma aeróbica e anaeróbica um, juntos, constituído por um conjunto de hemocultura. </li><li> Coloque as garrafas no instrumento BACTEC 9240 a 35 ° C. </li><li> Incubar até que o instrumento é acionado em alarme devido ao crescimento de organismos no frasco de cultura de sangue. </li><li> Remover garrafa do instrumento hemocultura. </li></ol> 2. Preparação de reagentes antes da coloração <ol><li> Prepare a solução de lavagem adicionando 4 mL de solução de lavagem 60x seguido por 240 mL de água deionizada ou destilada fresca diretamente para o prato de coloração. </li><li> Coloque o prato coloração nos 55 ° C banho-maria para aquecer. </li><li> Armazenar os restantes concentrar a 2-8 ° C. </li><li> Remover o meio de montagem do frigorífico e à temperatura ambiente. </li></ol> 3. Coloração Gram <ol><li> Agite suavemente o frasco de hemocultura. </li><li> Usando uma agulha e seringa ou um aparelho de subcultura, remoção de sangue (cerca de 5 mL) da garrafa e coloque em um tubo de rosca estéril tampado. </li><li> Usando uma pipeta estéril, coloque uma gota grande de sangue em uma lâmina de vidro. </li><li> O ar seco do slide e fixar em metanol por 10 segundos. </li><li> Permitir que deslize para o ar seco. </li><li> Fazer a coloração Gram no filme de sangue para determinar a morfologia do organismo em crescimento no frasco de cultura de sangue. </li><li> Usando uma lente de imersão em óleo, slides. Cocos Gram positivos em pares e cadeias curtas observada na coloração de Gram é mais consistente com espécies de Enterococcus. </li><li> Este resultado Gram, em seguida, dirige a seleção do próprio kit sonda FISH PNA a ser usado para identificação bacteriana. Esta cultura de sangue serão coradas pela E. faecalis / OE PNA FISH mancha. </li></ol> 4. FISH PNA Stain <ol><li> Misture o tubo contendo o sangue gentilmente agitando antes da preparação de esfregaço. </li><li> Coloque uma gota de solução de fixação sobre o bem de uma lâmina de microscópio FISH PNA. </li><li> Transfira 10 mL ou uma pequena gota do tubo com a hemocultura positiva para a solução de fixação e misture delicadamente para emulsionar. </li><li> Fixar os esfregaços pelo aquecimento por 20 min. a 55 ° C em uma placa de aquecimento. </li></ol> 5. Material de controlo de qualidade Um positivo e outro negativo lâmina de controlo de qualidade devem ser testados com cada lote de slides para a coloração. <ol><li> Use E. faecalis / OE Controle Slides comprado de AdvanDx para esse fim ou preparar esfregaços de culturas líquidas de cepas de referência de E. faecalis e E. faecium como controle positivo quer em slides separados ou misturados em um slide e Staphylococcus spp ou Streptococcus spp como material de Controlo Negativo. </li></ol> Os resultados QC deve ser capaz de monitorar as condições de ensaio adequadas, particularmente aquelas que afetam rigor hibridação e penetração da parede celular, uma vez que a metodologia PNA é projetado para otimizar a penetração da parede celular 6. Hibridização <ol><li> Adicione uma gota de E. faecalis / OE PNA para o bem na lâmina de microscópio com o esfregaço. </li><li> Adicionar lamela. Evite bolhas de ar. </li><li> Incubar por 30 ± 5 min. a 55 ± 1 ° C na placa de aquecimento </li><li> Após lugar de incubação, as lâminas em porta corrediça </li></ol> 7. Lavar rigorosos <ol><li> Transportadora deslize mergulhar na solução de lavagem pré-aquecido a 55 ° C e remova cuidadosamente a lamínula. Muitas vezes, a lamela desliza suavemente agitando o slide na solução de lavagem. Ocasionalmente, a lamela deve ser delicadamente empurrado para fora com uma pinça. </li><li> Incubar na solução de lavagem para 30 ± 5 min. a 55 ± 1 ° C. </li><li> Remover as lâminas da solução de lavagem </li><li> Permitir que o slide para o ar seco </li></ol> 8. Montagem <ol><li> Adicione uma gota de meio de montagem a cada slide </li><li> Adicionar lamela. Evite bolhas de ar. </li><li> Examine a lâmina em um microscópio de fluorescência dentro de 2 horas. </li><li> Não exponha os slides para direcionar a luz do sol ou outras fontes de luz forte, pois isso pode levar a extinção de fluorescência. </li></ol> 9. Interpretação dos Resultados O microscópio de fluorescência usado para exame de slides deve ser equipada com o Filtro de Banda AdvanDx dupla e um objetivo de petróleo 60x ou 100x. Os slides QC deve ser examinado primeiro a confirmar que a hibridização ocorreu. E. faecalis deve aparecer como verde brilhante cocos fluorescentes em vários campos de vista e os E. faecium aparecerá como vermelho brilhante cocos. Não enterococos lâmina de controlo deve aparecer nonfluorescent. Após a confirmação do sistema nos controles, as lâminas paciente pode ser examinado. No início, o sangue film aparecerá avermelhada, mas o vermelho e verde cocos será bastante aparente. <img src="/files/ftp_upload/2616/2616fig1.jpg" alt="Figura 1" data-altupdatedat="1788238805000" data-alt="Figura 1"> Figura 1. Exemplos representativos de verde-positivo E. faecalis (à esquerda), o vermelho positivo E. faecium (meio) e negativos (direita) de teste. 10. Resultados representante Três instituições foram incluídos em um estudo clínico multicêntrico avaliando este PNA FISH mancha e comparando um protocolo de 2,5 horas com o protocolo encurtado 1,5 hora que acaba de ser revistos. Um total de 152 cocos Gram positivos de rotina em pares e correntes (GPC) garrafas de cultura positiva de sangue foram incluídos nos estudos. Houve 100% (152/152) concordância entre os resultados da modificação e do procedimento do ensaio original de E. faecalis / OE PNA FISH: 41/41 E. faecalis; 33/33 enterococos e outros 78/78 GPC outros (Tabela 1). Este método de coloração tinha extraordinária sensibilidade e especificidade durante este ensaio clínico (Tabela 2). <table border="1"><tbody><tr><td></td><td> Métodos de rotina </td><td> E. faecalis / OE PNA Procedimento Padrão FISH </td><td> E. faecalis / OE Procedimento PNA FISH curto </td></tr><tr><td> E. faecalis </td><td> 41 </td><td> 41 (Verde Positivo) </td><td> 41 (Verde Positivo) </td></tr><tr><td> E. faecium </td><td> 27 </td><td> 27 (Red Positivo) </td><td> 27 (Red Positivo) </td></tr><tr><td> E. casseliflavus </td><td> 2 </td><td> 2 (Red Positivo) </td><td> 2 (Red Positivo) </td></tr><tr><td> E. gallinarum </td><td> 2 </td><td> 2 (Red Positivo) </td><td> 2 (Red Positivo) </td></tr><tr><td> Outros Enterococcus spp. </td><td> 2 </td><td> 2 (Red Positivo) </td><td> 2 (Red Positivo) </td></tr><tr><td> S. pneumoniae </td><td> 17 </td><td> 17 (negativo) </td><td> 17 (negativo) </td></tr><tr><td> S. viridans </td><td> 33 </td><td> 33 (negativo) </td><td> 33 (negativo) </td></tr><tr><td> S. mitis </td><td> 1 </td><td> 1 (negativo) </td><td> 1 (negativo) </td></tr><tr><td> S. pyogenes </td><td> 3 </td><td> 3 (negativo) </td><td> 3 (negativo) </td></tr><tr><td> S. bovis </td><td> 2 </td><td> 2 (negativo) </td><td> 2 (negativo) </td></tr><tr><td> S. salivarius </td><td> 1 </td><td> 1 (negativo) </td><td> 1 (negativo) </td></tr><tr><td> S. sanguinis </td><td> 2 </td><td> 2 (negativo) </td><td> 2 (negativo) </td></tr><tr><td> S. agalagtae </td><td> 7 </td><td> 7 (negativo) </td><td> 7 (negativo) </td></tr><tr><td> Outros Streptococcus spp. </td><td> 7 </td><td> 7 (negativo) </td><td> 7 (negativo) </td></tr><tr><td> Abiotrophia spp. </td><td> 3 </td><td> 3 (negativo) </td><td> 3 (negativo) </td></tr><tr><td> Peptostrepococcus spp. </td><td> 2 </td><td> 2 (negativo) </td><td> 2 (negativo) </td></tr><tr><td> Total </td><td> 152 </td><td> 152/152 100% de concordância </td><td> 152/152 100% de concordância </td></tr></tbody></table> Tabela 1. Listagem de bactérias testados usando tanto o padrão (2.5hr) e rápida protocolo (1,5 h). <table border="1"><tbody><tr><td> E.faecalis sensibilidade </td><td> Outros sensibilidade Enterococcus spp. </td><td> Especificidade </td></tr><tr><td> 100% (41/41) IC 95% (93,0-100) </td><td> 100% (33/33) 33/33 IC 95% (91,3-100) </td><td> 100% (78/78) IC 95% (96,2-100) </td></tr></tbody></table> Tabela 2. Sensibilidade e Especificidade do protocolo de 1,5 horas FISH PNA.

<ol><li>Rapid identification and differentiation of Enterococcus faecalis and other Enterococcus species directly from positive blood cultures by dual color fluorescence in situ hybridization using PNA probes. Oliveira, K., Chapin, K. C., Musgnug, M. C., Haase, G., Weber-Heynemann, J., DeGirolami, P. C., Dakos, J., Stender, H. 42rd Interscience Conference on Antimicrobial Agents and Chemotherapy, 2002, San Diego, , (2002).</li>
<li>Multicenter evaluation of E. faecalis PNA FISH for rapid identification and differentiation of Enterococcus faecalis and other Enterococcus species directly from positive blood cultures. Chapin, K. C., Musgnug, M. C., Oliveira, K., DeGirolami, P. C., Dakos, J., Johansen, J. T., Procop, G. W., Wilson, D., Padilla, E., Gonzalez, V., Stender, H. 103rd Annual Meeting of American Society, 2003, Washington DC, , (2003).</li>
<li>Direct identification of Staphylococcus aureus, Enterococcus faecalis, and Candida albicans from blood cultures using fluorescence in situ hybridization with nucleic acid probes. Rausei, V., Youssef, E., Morgan, M. 104th Annual Meeting of American Society for Microbiology, 2005, New Orleans, LA, , (2005).</li>
<li>Validation of S. aureus PNA FISH, E. faecalis PNA FISH & C. albicans PNA FISH for Rapid Identification of Positive Blood Culture Bottles. Novak-Weekley, S. M., LaForga, M., Carey, L., Frazier, L. 106th Annual Meeting of American Society for Microbiology, 2006, Orlando, FL, , (2006).</li>
<li>Rapid Identification of Enterococcus Species in Positive Blood Cultures with Therapeutic Implications. Johnson, J. K., Roberts, A. A., Forrest, G. N., Lincalis, D. P., Venezia, R. A. 106th Annual Meeting of American Society for Microbiology, 2006, Orlando, FL, , (2006).</li>
</ol>

A produção deste vídeo-artigo foi patrocinado pela AdvanDx. Benjamin Cristal é um empregado de AdvanDx, que faz com que as ferramentas e os reagentes utilizados neste artigo.

O E. faecalis / OE teste FISH PNA para Enterococcus pode fornecer identificação de 2-3 dias mais cedo do que métodos de cultura padrão. O procedimento abreviado para o ensaio (1,5 hourr) fornece a identificação rápida que pode ser usado para uma melhor abordagem terapêutica antimicrobiana e evolução de pacientes. Um estudo para apoiar esta foi realizada por Forrest, et al. (6). Mais de dois anos consecutivos a partir de 2005, o laboratório de microbiologia cocos Gram positivos identificados em pares e cadeias em crescimento em garrafas de cultura de sangue convencionais por métodos microbiológicos e, em 2006, adicionando a E. faecalis / OE FISH PNA. Além disso, um algoritmo de tratamento desenvolvido pela equipe instituições antimicrobianos (AMT) para efetivamente utilizar os dados PNA FISH gerado pelo laboratório em tempo hábil. Desfecho primário avaliado foi o tempo de cultura de sangue sorteio para a implementação da terapêutica antimicrobiana eficaz antes e depois de FISH PNA foi instituído no fluxo de trabalho laboratórios. Gravidade da doença local, paciente e terapia antimicrobiana empírica foram medidos. Um total de 224 pacientes com bacteremia hospitalar adquirida enterococos foram avaliados com 129 no período pré-intervenção e 95 no período FISH PNA. FISH PNA identificados E. faecalis 3 dias mais cedo do que as culturas convencionais (1,1 vs 4,1 dias, p &lt;0,001). FISH PNA identificados E. faecium em média 2,3 dias mais cedo (1,1 vs 3,4 dias, p &lt;0,001) e foi associado à redução estatisticamente significativa no tempo de se iniciar a terapêutica eficaz (1,3 vs 3,1 dias, p &lt;0,001) e diminuição 30 dias mortalidade (26% vs 45%, p = 0,04). Este grupo concluiu que o E. faecalis / OE teste FISH PNA em conjunto com um algoritmo de tratamento AMT resultou em início precoce da terapia empírica antimicrobiano apropriado para pacientes com adquiridas no hospital E. faecium bacteremia. <ol><li> Reagentes não deve ser utilizado após a data de validade impressa nos rótulos e reagentes não devem ser modificados de qualquer forma. Eles devem permanecer na geladeira quando não em uso ou podem perder a potência. </li><li> Garrafas de cultura de sangue precisam ser homogeneizado antes da amostragem. </li><li> É importante para não permitir que a ponta frasco conta-gotas para tocar um esfregaço de sangue, porque isso pode causar a contaminação cruzada de material entre os slides, ou causar contaminação do reagente. </li><li> Verifique se o banho de água eo bloco de aquecimento são mantidos em constante a 55 ° C. </li><li> Não use outros filtros que o filtro Dual Band ou cores não serão claramente discernida. </li><li> Não use lâminas de microscópio diferente do Lâminas de microscopia ou hibridização não irá ocorrer. </li><li> É importante que o microscópio está funcionando corretamente. Verifique se a lâmpada do microscópio é aprovado dentro do número de horas de uso. </li></ol><ul><li> Algumas espécies raras de ocorrência Enterococcus não são detectados pela sonda PNA hibridação de espécies de Enterococcus, tais como E. asinii, E.dispar, haemoperoxidus E., cecorum E., columbae E., saccharolyticus E., E. e E solitarius . sulfurosos. </li><li> Moraviensis E. é identificado como E. faecalis devido a semelhanças seqüência. </li><li> Algumas cepas de Streptococcus anginosus produzir uma fluorescência verde falso positivo devido a semelhanças seqüência. </li><li> Garrafas de cultura VersaTREK sangue não foram avaliados durante os estudos clínicos. O desempenho para detectar E. faecalis e Enterococcus spp outros. com garrafas de cultura VersaTREK sangue é desconhecido. </li><li> Autofluorescência falso positivo verde pode ocorrer se um padrão FITC filtro é usado em vez do filtro Dual Band. </li><li> Resultados falso-negativos podem ocorrer com pouca freqüência devido ao crescimento misto ou por erro na técnica de ensaio. </li><li> O tipo e condição da instrumentação utilizada vai influenciar a aparência visual da imagem obtida. A fluorescência pode varydue com o tipo de microscópio de empregados, a fonte de luz eo nível de rRNA nas células </li><li> Isolamento em meios sólidos é necessária para diferenciar crescimento misturado com outros organismos e identificar hemocultura positiva gerando um resultado negativo. </li><li> O produto não foi validado com outras amostras de hemoculturas. </li></ul>

Reagentes E. faecalis / OE PNA FISH é composto dos componentes do kit seguintes: <ul><li> Solução de fixação Fixação Solução 3 mL tampão fosfato com detergente. </li><li> E. faecalis / OE PNA E. faecalis / OE PNA 1,5 mL PNA sondas de hibridização. solução. Contém formamida 30%. </li><li> Lavar 60x Solution Solução de Lavagem 60x 50 mL Tris-salina tamponada com detergente </li><li> Meio de Montagem Montagem Médio inibidor de 3 mL fotobranqueamento em Glicerol </li><li> Controle de qualidade de slides </li><li> <a href="http://www.advandx.com">AdvanDX</a> </li></ul>

um procedimento de 1,5 horas para a identificação de enterococcus espécies diretamente de hemoculturas

A 1.5 Hour Procedure for Identification of Enterococcus Species Directly from Blood Cultures

Enterococos são uma causa comum de bacteremia com E. faecalis sendo a espécie predominante seguida pela E. faecium. Porque a resistência à ampicilina e vancomicina em E. faecalis ainda é incomum em relação à resistência em E. faecium, o desenvolvimento de testes rápidos permitindo a diferenciação entre as espécies de enterococos é importante para a terapêutica adequada e vigilância da resistência. O E. faecalis OE teste FISH PNA (AdvanDx, Woburn, MA) usa espécie-específica de ácidos nucleicos peptídeo (PNA) sondas de fluorescência em formato de hibridização in situ e oferece um tempo para resultados de 1,5 horas e o potencial de fornecer informações importantes para a espécie-específicos o tratamento. Estudos multicêntricos foram realizados para avaliar o desempenho do E. 1,5 horas faecalis / OE procedimento FISH PNA em comparação com o procedimento de ensaio originais 2,5 horas e aos métodos de bacteriologia padrão para a identificação de enterococos diretamente de uma garrafa de sangue positivo cultura.

Um protocolo rápido para a identificação directa de Enterococcus faecalis e Enterococcus outras espécies a partir de uma hemocultura positiva usando um ácido nucléico Peptide fluorescentes em ensaio de hibridização in situ (FISH PNA).

Um Procedimento de 1,5 horas para a Identificação de Enterococcus Espécies Diretamente de hemoculturas

Os enterococos são uma causa comum de bacteremia, sendo a E. faecalis a espécie predominante, seguida pela E. faecium. Devido à resistência à ampicilina e...

O objetivo geral deste procedimento é identificar rapidamente espécies de Enterococcus a partir de frascos de hemocultura positivos utilizando hibridização fluorescente por ácido peptídico nucleico e C dois. Após a preparação das hemoculturas e a realização do teste de Gram para confirmar a presença de Enterococci na cultura, as amostras são fixadas em lâminas de microscopia PNA FISH. Em seguida, as lâminas são incubadas com sondas PNA específicas para os organismos de interesse.Após a hibridização das sondas, realiza-se uma lavagem rigorosa para remover o excesso de sonda não hibridizada. Adiciona-se meio de montagem às lâminas, que são então seladas com lamínulas. As espécies de enterococos presentes na amostra podem ser identificadas por microscopia de fluorescência.Este protocolo de identificação de PNA Fish é único por fornecer um método rápido e específico para a identificação de enterococos provenientes de paralisia. Incube duas garrafas de hemocultura, uma aeróbica e uma anaeróbica, contendo sangue venoso de um paciente suspeito de sepse, em um instrumento automatizado de hemocultura a 35 graus Celsius. Assim que o dispositivo indicar detecção de crescimento microbiano, retire a garrafa e agite suavemente as garrafas de hemocultura para ressuspender uniformemente as bactérias.Em seguida, utilizando uma seringa e agulha estéreis, transfira assépticamente cerca de cinco mililitros de sangue de cada frasco para um tubo distinto com tampa de rosca. Após distribuir todas as amostras, use uma pipeta estéril para transferir uma gota de sangue de cada tubo para uma lâmina de microscópio de vidro separada. Deixe a lâmina secar ao ar por aproximadamente 15 minutos.Em seguida, após a lâmina estar completamente seca, imerja-a em metanol para fixar a amostra. Após as lâminas terem sido fixadas, lave-as e realize uma coloração de Gram padrão para determinar a morfologia dos organismos presentes em cada cultura sanguínea. Examine as lâminas coradas utilizando um microscópio com objetivo de imersão em óleo.Uma espécie de *Coccus* aparecerá como cocos gram-positivos, geralmente organizados em pares ou cadeias curtas. Coloque uma gota da solução de fixação no poço de uma lâmina de microscópio P e um peixe. Misture suavemente o tubo de hemocultura a ser testado.Em seguida, transfira 10 microlitros de cultura para a gota da solução de fixação e pipete para cima e para baixo para emulsificar a amostra. Coloque as lâminas em uma placa aquecedora a 55 graus Celsius por 20 minutos para fixar os esfregaços em cada teste. Certifique-se de incluir lâminas de controle positivo e negativo para avaliação da qualidade do ensaio.As lâminas controle de caloso podem ser adquiridas de um Van DX ou preparadas usando culturas de referência. Uma vez que a esfregaço esteja pronto, coloque uma gota de caloso EFI O-E-P-N-A no poço contendo a amostra de hemocultura, bem como nos poços controle positivo e negativo. Para evitar a contaminação da solução estoque da sonda, certifique-se de não permitir que a ponta do frasco com conta-gotas toque o esfregaço sanguíneo.Coloque uma lamínula sobre a amostra, tomando cuidado para não criar bolhas de ar. Em seguida, incube a lâmina em um bloco de aquecimento a 55 graus Celsius por 30 minutos. Para permitir a hibridização da PNA após a incubação, coloque as lâminas em um porta-lâminas.Imersa o porta-objetos carregado em um recipiente de coloração contendo Solução de Lavagem pré-aquecida a 55 graus Celsius. Para remover o excesso de PNA da amostra, retire suavemente a lamínula agitando o lâmina no tampão ou utilizando pinça. Incube a lâmina a 55 graus Celsius na solução de lavagem por 30 minutos.Em seguida, remova a lâmina do recipiente de coloração e deixe secar ao ar. Assim que a lâmina estiver seca, adicione uma gota de meio de montagem à temperatura ambiente sobre a lâmina e coloque cuidadosamente uma lamínula sobre a amostra. Examine as lâminas em um microscópio de fluorescência utilizando um filtro de dupla banda dentro de duas horas após o preparo.Utilizando este método, seixo, caloso, mostrado em verde à esquerda, pode ser distinguido de eum em vermelho. No painel central, mais à direita, está um resultado negativo. Três aspectos a lembrar para obter resultados bem-sucedidos são: as temperaturas do instrumento devem ser mantidas nas temperaturas definidas.Você precisa seguir rigorosamente o procedimento de coloração conforme descrito na bula. E, finalmente, é necessário ter um leitor experiente que realize uma análise cuidadosa da lâmina. Este protocolo é útil para tomar decisões terapêuticas no tratamento da sepse causada por enterococo.Obrigado por assistir e boa sorte com seus experimentos.

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Aprenda a identificar rapidamente espécies de Enterococcus em hemoculturas usando o ensaio PNA FISH. Este método específico auxilia no diagnóstico clínico e nas decisões terapêuticas para tratamento de sepse.

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