Name: Competitiva Ensaios Homing para Estudar Gut trópico-Migração de Células T (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-03-01T17:45:00.000+00:00
Duration: 10 min 25 s
Description: Aprenda a realizar ensaios de homing competitivo para estudar a migração de células T com tropismo intestinal em camundongos. Este método permite comparar habilidades migratórias tecido-específicas de diferentes subtipos celulares simultaneamente.

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EJV é apoiado por uma bolsa da s &amp; Colite de Crohn Foundation of America (CCFA). JRM é suportado por concessões do CCFA, Cancer Research Institute (CRI), H. Howard Goodman (MGH), Life Science Center Massachusetts (MLSC) e Prêmio NIH Director s New Innovator.

1. Geração ex vivo de células T gut-homing e controle (ver Figura 1) <ol><li> Isolar esplenócitos por mashing um baço de camundongos de tipo selvagem. Volte a suspender as células em suspensão PBS e centrifugar por 5 'a 400 x g. Remover o sobrenadante e lise das células vermelhas do sangue pela ressuspensão do pellet celular em 4 ml de tampão de lise ACK por 2-3 minutos. Depois disso, adicione 5 ml de PBS. Centrifugar por 5 'a 400 xg e remover o sobrenadante. </li><li> Ressuspender esplenócitos total em 1 x 10 6 / mL em IMDM + 10% FBS + 50 mM 2-mercaptoetanol + penicilina / estreptomicina (IMDM completa). Separar as células em dois grupos, um dos quais são complementados com RA (ou sintético RAR-agonistas, tais como Am80 ou Am580) para uma concentração final de 100-200 nM 3. Células T ativadas na presença de RA ou RAR-agonistas vai upregulate a4b7and CCR9 e vai se tornar células do intestino trópico-T, enquanto que as células T ativadas sem RA vai se tornar as células T de controle. </li><li> Adicionar 1,5-2,0 mL da suspensão de células em cada poço de uma placa de 24 poços previamente revestidas com anti-CD3 (10 mg / ml) e anti-CD28 (10 mg / ml) e incubar a 37 ° C em 5% de CO 2 (para o revestimento da placa de adicionar 500 ml / poço de anti-CD3-CD28, mais anti em PBS e incubar por 2 horas a 37 ˚ C e depois lave duas vezes com 2 ml PBS). </li><li> A fim de evitar a superestimulação das células T, após 2-3 dias de transferência das suspensões de células em um novo sem revestimento placa de 24 cavidades. Incubar por mais de 2-3 dias. Dependendo da densidade e proliferação celular a mídia pode tornar-se ácido (amarelo), caso em que pode ser necessário para substituir a metade da mídia com IMDM completa fresco. Colheita das células após 4-5 dias (contando do dia 0). </li><li> Típico rendimentos finais são 1-2 x 10 6 células T efectoras / poço. Portanto, um mínimo de 12/09 poços de cada células do intestino trópico-T e células T de controle deve ser banhado, a fim de acabar com 10-20 x 10 6 células T por condição. </li></ol> 2. Análise de gut-homing receptores nas células T ativadas Após 4-5 dias de cultura, devemos observar uma alta expressão de receptores gut-homing a4b7and CCR9 em células T ativadas na presença de agonistas RA ou RAR, enquanto que as células T de controle deve expressar níveis muito baixos destas quatro receptores. Citometria de fluxo análise (FACS). <ol><li> Coletar entre 0,2-0,5 x10 6 células e centrifugar por 5 min a 300 g a 4 ° C. </li><li> Incube com anti-CD4-FITC, anti-a4b7-PE (BD Biosciences), anti-CCR9-APC (eBiosciences) e anti-CD8-PerCP por 15 min a 4 ° C no escuro. </li><li> Após a incubação, centrifugar por 5 min a 300 g 4 ° C. Lavar e ressuspender as células em tampão de coloração e análise por FACS. </li></ol> 3. T rotulagem celular com células trackers CFSE e CMTMR <ol><li> Manter todas as soluções a 37 ° C antes de começar. Lavar as células do intestino-trópico T (a4b7 alta CCR9 Alta) e células controle T (a4b7 Baixo / Neg CCR9 Baixo / Neg) duas vezes com PBS para remover o soro. Ajuste a concentração de células T para 10-15 x 10 6 / mL em PBS. </li><li> Adicionar CFSE (carboxifluoresceína succinimidyl éster) ou CMTMR (clorometil-benzoil-amino-tetrametilrodamina) fluoróforos para qualquer gut-trópico T e células T de controle para uma concentração final de 5 mm e 10 mm, respectivamente, gentilmente vortex e incubar por 20 min em 37 ° C. Recomenda-se trocar o bulas no mesmo ou em um experimento separado, a fim de excluir potenciais efeitos intrínsecos de fluoróforos em T migração celular. </li><li> Após a incubação, saciar com um volume de FBS e incubar por 1-5 min à temperatura ambiente. Diluir 10 vezes com PBS quente e centrifugar por 5 min a 300 g. Lave duas vezes com PBS e ressuspender em IMDM completa. </li><li> Idealmente, 10-20 x 10 6 células de cada população T deve ser misturado na proporção de 1:1 e, em seguida, centrifugado a 300 xg por 5 min. Finalmente, voltar a suspender as células em 200-250 mL de PBS quente e injetar através da veia da cauda. </li><li> Para calcular a taxa de entrada exata (de preferência perto de 1) salvar 5-10 ml da suspensão de células injetadas e diluir com 300 mL de PBS e analisar por FACS. </li></ol> 4. Análise de células T homing Embora os ratos podem ser analisados ​​em vários pontos do tempo (entre 1 h e vários dias após a injeção de células T), homing das células do intestino trópico-T é o melhor documentado entre 12-24 h após a injecção. Pontos mais tempo, aumentar os potenciais efeitos de outras variáveis ​​que afetam a célula final números / índices, como a apoptose de células T e saída de células T do tecido. Depois de os ratos são sacrificados, suspensões de células de vários tecidos devem ser isolados, sem demora, a fim de diminuir a morte celular, que pode afetar o rendimento final e resultados. Tecidos de interesse são o intestino delgado, cólon, baço, linfonodos, placas de Peyer, fígado, pulmões e sangue. Se oinjetaram células T são bona fide células do intestino trópico-T, devem casa, em média 5-10 vezes melhor (ou superior) para a mucosa do intestino delgado em relação ao controle de células T. No entanto, outros tecidos, como sangue e do baço, não deve apresentar uma migração de células T preferencial. Isolamento de linfócitos da lâmina própria intestinal eo compartimento intra-epitelial tem sido descrito anteriormente 5. <ol><li> Coloração FACS: As amostras são ressuspenso dependendo do número de células coletadas, com uma densidade não superior a 3,0 x 10 6 células / ml. Se congênitas CD45.1 + ou + Thy1.1 ratos foram usados ​​como receptores, as células são corados com o marcador correspondente congênitas (por exemplo, ou CD45.2 Thy1.2) combinado com algum marcador de linhagem (por exemplo, TCRbchain, CD4, CD8 , CD45.1 + / CD45.2 +). </li><li> Durante a análise do FACS, as células são fechadas no marcador congênitas (por exemplo, CD45.1) e, em seguida, os marcadores de linhagem específica (por exemplo, CD4/CD8) e analisadas para as relações entre CMTMR e células CFSE positivo. </li><li> Os dados é geralmente expressa como o Índice de Homing (HI), que é calculado como a relação CFSE / CMTMR (ou CMTMR / CFSE) em cada tecido dividido pela relação de entrada correspondente (veja abaixo). Se a relação de entrada é muito próximo de 1, então as razões de tecido será equivalente à HI. </li></ol> HI = CFSE tecido tecido / CMTMR: Entrada CFSE input / CMTMR De sangue também devem ser analisados ​​a fim de determinar se as duas populações de células T são igualmente representados na circulação ou se uma população de células T está diminuído relação ao outro (por exemplo, prendendo preferencial nos pulmões / fígado ou por viabilidade diminuída). Isso pode acontecer quando se comparam as células de memória T naïve ou descansando contra recentemente activado células T efetoras, já que este último pode ser preso em maior medida nos pulmões. Se o HI no sangue é significativamente diferente de 1, pode-se normalizar HI nos tecidos pelo HI no sangue. Sangue pode ser obtido através de punção cardíaca de ratos anestesiados (com Avertin ou isofluorano eutanásia antes) e devem ser lisadas por duas vezes com tampão ACK antes de o utilizar para a coloração FACS. Normalização de sangue = HI Sangue tecido / HI 5. Resultados representante Camundongos destinatário (Thy1.1 +) foram euthanized18h injeção de células post. Suspensões de células foram gerados a partir do baço, linfonodos periféricos (PLN), linfonodos mesentéricos (MLN) e lâmina própria do intestino delgado (LP). Depois que as células foram coradas para Thy1.2 e CD8 e depois analisados ​​por FACS pela passagem de células viáveis ​​Thy1.2 + CD8 +, que finalmente foram analisadas para a relação entre as células CMTMR + (células T gut-trópico) e CFSE + (células de controlo T) dividido pela relação de entrada. Os resultados podem ser exibidos como mostrado na Figura 2, em que pode ser apreciado que as células do intestino trópico e controle T homed igualmente para o baço (HI perto para 1, indicada por uma linha vermelha). Em contraste, as células do intestino trópico-T migraram cerca de 10 vezes mais eficiente para o LP em relação ao controle de células T. <img src="/files/ftp_upload/2619/2619fig1.jpg" alt="Figura 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 1"> Figura 1:. Diagrama mostrando a geração e rotulagem de gut-tropical e não-gut células T trópico células T são isolados de camundongos do tipo selvagem e activado com anti-CD3/anti-CD28 e na presença ou ausência de 100-200 nM todos - trans ácido retinóico (AR). Depois de 4-5 dias RA-tratados células T adquirir a expressão de receptores do intestino homing CCR9 e a4b7. Então, as células do intestino trópico e controle T são diferencialmente marcada com CFSE ou CMTMR, lavado, misturado na proporção de 1:1 e injetado em um rato destinatário através da veia da cauda. Algumas células marcadas são usadas para determinar a relação de entrada CFSE / CMTMR (deve ser próximo a 1). <img src="/files/ftp_upload/2619/2619fig2.jpg" alt="Figura 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 2"> Figura 2:. Mice Exemplo de análise homing analisados ​​12-18 h pós-injeção de células T e suspensões única célula são obtidos a partir dos órgãos de interesse. As células são corados com anti-Thy1.2 (marcador congênitas) mais anti-CD8 + e depois Thy1.2 células T CD8 + são analisados ​​para a relação entre CMTMR + e + CFSE células em cada tecido por FACS. O tecido CMTMR / CFSE índices são normalizados pela entrada relação CMTMR / CFSE para obter os índices de homing (HI). Neste + CMTMR exemplo e CFSE células são + gut-tropical e as células T efetoras controle, respectivamente.

<ol><li>Butcher, E. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Leukocyte-endothelial+cell+recognition%3A+Three+%28or+more%29+steps+to+specificity+and+diversity%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Leukocyte-endothelial cell recognition: Three (or more) steps to specificity and diversity.</a> Cell. 67, 1033-1036 (1991).</li>
<li>Springer, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Traffic+signals+for+lymphocyte+recirculation+and+leukocyte+emigration%3A+the+multistep+paradigm%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Traffic signals for lymphocyte recirculation and leukocyte emigration: the multistep paradigm.</a> Cell. 76, 301-314 (1994).</li>
<li>Iwata, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Retinoic+acid+imprints+gut-homing+specificity+on+T+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">Retinoic acid imprints gut-homing specificity on T cells.</a> Immunity. 21, 527-538 (2004).</li>
<li>Mora, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reciprocal+and+dynamic+control+of+CD8+T+cell+homing+by+dendritic+cells+from+skin-+and+gut-associated+lymphoid+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22J+Exp+Med%22%5BJournal%5D)">Reciprocal and dynamic control of CD8 T cell homing by dendritic cells from skin- and gut-associated lymphoid tissues.</a> J Exp Med. 201, 303-316 (2005).</li>
<li>Mora, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Selective+imprinting+of+gut-homing+T+cells+by+Peyer%27s+patch+dendritic+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Selective imprinting of gut-homing T cells by Peyer's patch dendritic cells.</a> Nature. 424, 88-93 (2003).</li>
<li>Mempel, T. R., Scimone, M. L., Mora, J. R., von Andrian, U. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+imaging+of+leukocyte+trafficking+in+blood+vessels+and+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Immunol%22%5BJournal%5D)">In vivo imaging of leukocyte trafficking in blood vessels and tissues.</a> Curr Opin Immunol. 16, 406-417 (2004).</li>
</ol>

Não há conflitos de interesse declarados.

Apesar de experimentos homing fornecer informações valiosas sobre a migração de populações de células totais em qualquer dado tecido, ele deve ser mantido em mente que estes ensaios não analisam diretamente adesão endotelial e, portanto, não discriminar em qual etapa (s) da adesão de várias etapas cascata (tethering / rolamento, ativação ou furar) um determinado receptor homing está agindo. O padrão ouro para definir o papel específico dos receptores de homing na cascata de adesão é de microscopia intravital (IVM), na q...

Animais: camundongos C57BL / 6 são comumente usados ​​para o isolamento de células T. Além disso, CD45.1 e Thy1.1 linhagens congênitas estão disponíveis através de Jackson Laboratories (Bar Harbor, ME). Cultura da mídia: IMDM (Medium Modificado Iscove de Dulbecco + L-Glutamina + Hepes) acrescido de 10% inativado pelo calor FBS (fetal bovino endotoxina, Serum baixa, Gibco ®, Invitrogen, Carlsbad, CA) suplementado com 100 U / penicilina ml, 100 mg / ml de estreptomicina (antibióticos HyClone, Waltham, MA), 0,5 mg / ml Fungizone / anfotericina B (Gibco) e 50 mM b-mercaptoetanol. ACK Red Blood tampão de lise celular (RBC, 10 mM KHCO 3, 150 mM NH 4 Cl, 0,1 mM EDTA, pH 8,0), ajustado a pH 7,2-7,4 e armazenar em temperatura ambiente). PBS (Phosphate Buffered Saline, Hyclone, Waltham, MA). Citometria de fluxo (FACS) media (PBS ou IMDM + 2 + 5% FBS mM EDTA). Quando coloração com Selectina-Fc quimeras, media com 2 mM Ca + + deve ser usado em todas as etapas (incluindo a aquisição FACS). IMDM é recomendado neste caso. T rotulagem celular e transferência adotiva: CFSE (carboxifluoresceína diacetato, succinimidyl éster), CMTMR ((5 - (e-6 )-((( 4-clorometil) benzoil) amino) tetrametilrodamina) de Molecular Probes ®, Invitrogen, Carlsbad, CA ). 1.000 ações x deve ser feita em DMSO (5 CFSE mM, 20 mM CMTMR) e armazenadas a -20 ° C. Ativação de células T policlonais: 24 bem ou placas de 96 poços (cultura de tecidos tratados, poliestireno, de fundo plano com tampa, BD Falcon, Franklin Lakes, NJ) são incubados por 2 horas a 37 ° C com 50 ml de PBS, respectivamente , contendo anti-CD3, mais anti-CD28 anticorpos (10 mg / mL cada). Então, placas de cultura são lavados duas vezes com PBS e imediatamente utilizado para cultura de células T. Alternativamente, Dynabeads revestido com anti-CD3/anti-CD28 (Dynal, Invitrogen, Carlsbad, CA) pode ser usada para ativação das células T, em vez de placa-bound anticorpos. Citometria de fluxo coloração (FACS): ativação policlonal: CD3 (1452C11), CD28 (37,51). Lineage mAb: CD4 (L3T4), CD8a (Ly-2), Thy1.2 (CD90.2/53-1.2), CD45.2 (104). Gut-homing receptores: purificada CCR9 (CD199/eBioCW-1.2, eBioscience, San Diego, CA), a4b7 (LPAM-1/DATK3), isotipo controle (IgG2a, k). Pele-homing receptores: P-selectina-Fc (Purified rato P-Selectina - IgG proteína de fusão, BD PharMingen, San Jose, CA), E-selectina-Fc (E-Selectin/Fc rato recombinante Chimera, R &amp; D Systems, Minneapolis, MN), mais de cabra F correspondente secundário reagente (ab &#39;) 2 anti-humano IgG R-PE (Invitrogen, Carlsbad, CA). All-trans ácido retinóico (Sigma, St. Louis, MO) é ressuspenso em etanol absoluto ou DMSO usando uma lâmpada amarela ou uma fonte indireta de luz durante a preparação. Alíquotas armazenar em frascos de vidro a -80 ° C e protegida da luz em todos os momentos. Sintéticos RAR-agonistas: Am80 (Wako Chemicals, Richmond, VA).

competitiva ensaios homing para estudar gut trópico-migração de células t

Competitive Homing Assays to Study Gut-tropic T Cell Migration

A fim de exercer sua função linfócitos necessidade de deixar o sangue e migram para diferentes tecidos no organismo. Adesão dos linfócitos às células endoteliais e extravasamento de tecido é um processo de várias etapas controladas por diferentes moléculas de adesão (receptores homing) expressa em linfócitos e seus ligantes respectivos (addressins) exibidos em células endoteliais 1 2. Mesmo que a função desses receptores de adesão pode ser parcialmente estudou ex vivo, o teste final para sua relevância fisiológica é avaliar o seu papel durante na adesão de linfócitos vivo e migração. Duas estratégias complementares têm sido utilizados para esse fim: microscopia intravital (IVM) e experimentos homing. Embora IVM tem sido essencial para definir a contribuição precisa de receptores de adesão específicos durante a cascata de adesão em tempo real e em diferentes tecidos, IVM é demorado e trabalhoso, que muitas vezes requer o desenvolvimento de sofisticadas técnicas cirúrgicas, que necessita de isolamento antes de homogêneo populações de células e permite a análise de apenas um órgão, tecido / a qualquer momento. Pelo contrário, competitiva experimentos homing permitir a comparação direta e simultânea na migração de duas (ou mais) em subpopulações de células com o mouse mesmo e eles também permitem a análise de muitos tecidos e de um elevado número de células no mesmo experimento. Aqui nós descrevemos o protocolo competitivo clássica homing usado para determinar a vantagem / desvantagem de um tipo de célula dado a casa para tecidos específicos, em comparação com uma população de células controle. Escolhemos para ilustrar as propriedades migratórias do intestino trópico-versus células não gut trópico-T, porque a mucosa intestinal é a superfície maior corpo em contato com o ambiente externo e também é o tecido extra-linfóides com os requisitos definidos pelo melhor migratórias . Além disso, trabalhos recentes determinou que a vitamina A, ácido all-trans retinóico metabólito (RA) é o principal mecanismo molecular responsável pela indução de receptores específicos gut-adesão (integrinas receptor de quimiocina a4b7and CCR9) em linfócitos. Assim, podemos facilmente gerar um grande número de gut-tropical e não gut trópico de linfócitos ex vivo pela ativação de células T na presença ou ausência de RA, respectivamente, o que pode ser finalmente utilizado nos experimentos competitivos homing descrito aqui.

Competitiva homing experimentos permitem avaliar diretamente as propriedades migratória de duas populações celulares diferentes em um único rato. Aqui nós ilustrar este procedimento através da comparação da migração de ex-vivo gerado gut trópico-versus non-gut células T trópico.

Competitiva Ensaios Homing para Estudar Gut trópico-Migração de Células T

Para exercerem a sua função, os linfócitos precisam de deixar o sangue e migrar para diferentes tecidos do corpo. A adesão dos linfócitos ao endotélio...

O objetivo geral deste procedimento é comparar as capacidades migratórias específicas de tecido de dois ou mais subconjuntos celulares no mesmo camundongo receptor, permitindo a análise de diversos tecidos e células em um único experimento. Aqui, demonstramos um método para comparar as capacidades migratórias de linfócitos T com tropismo intestinal e linfócitos T controle gerados in vitro em um camundongo receptor selvagem. O método pode ser utilizado, por exemplo, para determinar a capacidade dos linfócitos T com tropismo intestinal de migrar para os linfonodos mesentéricos intestinais, linfonodos periféricos e baço.Em comparação com linfócitos T controle, primeiramente os linfócitos T efetores com tropismo intestinal e os linfócitos T controle devem ser gerados in vitro. Em seguida, os linfócitos T experimentais e controle devem ser marcados com corantes diferenciais e misturados em uma proporção de um para um. Então, a mistura celular, exceto uma pequena alíquota utilizada para confirmar a proporção de entrada, é injetada no camundongo receptor.Por fim, o camundongo é sacrificado 18 horas após a transferência adotiva e os órgãos de interesse são analisados quanto à presença de linfócitos T guttrópicos e controle por citometria de fluxo. A principal vantagem desta técnica em relação aos métodos existentes, como a transferência adotiva de uma única população celular, é que uma combinação de diferentes subtipos é injetada nos mesmos camundongos receptores, reduzindo significativamente a variabilidade associada à injeção intravenosa ou ao uso de diferentes camundongos receptores. As implicações desta técnica estendem-se ao tratamento de doenças associadas à intensa infiltração de leucócitos, como a doença inflamatória intestinal.Por exemplo, isso nos permite determinar quantas moléculas são necessárias durante a migração normal, bem como durante a migração anormal de linfócitos para o intestino. Além disso, este procedimento nos permite avaliar a eficácia de medicamentos projetados para bloquear o tráfego de leucócitos. Identifique cada poço de uma placa de 24 poços com 500 microlitros de PBS contendo 10 miligramas por mililitro de anticorpos anti-CD3 e anti-CD28. Incube a placa por duas horas a 37 graus Celsius em 5% de dióxido de carbono enquanto os poços estão sendo revestidos.Sacrifique um camundongo selvagem e dissecione o baço, colocando-o em um tubo de 50 mililitros com meio. Isole os linfócitos esplênicos (PLE) colocando o baço entre duas lâminas de microscópio e esmagando-o sobre uma placa de Petri. Re-suspenda as células em PBS, transfira a suspensão celular com pipeta para um novo tubo cônico de 50 mililitros e centrifugue durante cinco minutos.A 400 Gs à temperatura ambiente, remova o sobrenadante e lise as células vermelhas do sangue ressuspendendo o pellet celular em quatro mililitros de tampão de lise ativo por dois a três minutos. Pare a lise com cinco mililitros de PBS, centrifugue novamente a suspensão celular por cinco minutos a 400 Gs à temperatura ambiente e descarte o sobrenadante. Ressuspenda o pellet resultante em uma vez 10 das seis células por mililitro em gelo completo.Divida igualmente o meio modificado Coves Delcos ou IMDM, distribuindo a suspensão celular resultante entre dois tubos separados, suplementando um dos tubos com ácido retinóico todo-trans ou RA até uma concentração final de 100 a 200 nanomolar cúbicos. Proteja o tubo da luz direta para evitar a degradação do ácido retinóico todo-trans. Retire a placa de 24 poços do incubador e lave cada poço duas vezes com dois mililitros de PBS.Adicione de 1,5 a dois mililitros da suspensão celular suplementada com RA à metade da placa de 24 poços. Em seguida, adicione a mesma quantidade de células controle a cada poço da segunda metade da placa de 24 poços e retorne a placa ao incubador. Após dois a três dias, transfira as suspensões celulares para uma nova placa de 24 poços não revestida.Para evitar a superestimulação dos linfócitos T, incubar as células por mais dois a três dias. Se a coloração do meio ficar amarela devido à densidade celular e/ou proliferação, adicionar 500 microlitros de IMDM fresco a cada poço, atingindo um volume final de um mililitro por poço. Para colher as células, coletar o sobrenadante no quarto ou quinto dia, considerando como dia zero o dia em que as células foram semeadas.Os rendimentos finais típicos são de uma a duas vezes 10 elevado às seis células T efetoras por poço. Portanto, um mínimo de nove a 12 poços de cada uma das células T tropicativas intestinais e células T controladas deve ser semeado para gerar de 10 a 20 vezes 10 elevado às seis células T por grupo. Para verificar os níveis de expressão de alfa quatro, beta sete e CCR nove em ra.Células T ativadas e controladas são coletadas, entre 0,2 e 0,5 vezes 10 à sexta das células experimentais e controle recém-colhidas, em tubos de fuga de quatro mililitros e centrifugadas por cinco minutos a 300 Gs a quatro graus Celsius. Descarte o sobrenadante e re-suspenda as células em 100 microlitros de tampão de marcação, incubando com anti-CD4 FSE, anti-CD4 beta 7 PE, anti-CCR9 APC e anti-CD8 PerP por 15 minutos a quatro graus Celsius no escuro.Após a incubação, lave as células com PBS por cinco minutos a 300 ×g e 4 °C, descarte o sobrenadante e re-suspenda as células no tampão de marcação. Analise por citometria de fluxo no início desta etapa. Pré-aqueça um frasco de IMDM e um frasco de PBS a 37 °C para uso posterior no protocolo de marcação.Após confirmar os fenótipos de homing de linfócitos T das duas culturas celulares por citometria de fluxo conforme descrito no passo anterior, centrifugue as populações recém-colhidas de linfócitos T alfa quatro, beta sete, CCR nove alto, com tropismo intestinal e alfa quatro, beta sete, CCR nove baixo ou negativo, controle baixo ou negativo, a 300 × g durante cinco minutos à temperatura ambiente. Em seguida, lave as células mais duas vezes com PBS para remover o soro e, então, ajuste a concentração de linfócitos T de cada grupo para 10 a 15 vezes 10 à sexta células por mililitro. Em PBS, adicione os corantes CFSE ou C-M-T-M-R aos linfócitos T com tropismo intestinal ou aos linfócitos T controle.Aqui, o CFSE está sendo adicionado à população de células controle e o C-M-T-M-R está sendo adicionado ao intestino. Células T trópicas até uma concentração final de cinco milimolar e 10 milimolar, respectivamente; vortexar suavemente as células por cinco segundos e incubá-las por 20 minutos a 37 graus Celsius no banho-maria após o período de incubação. Interromper a coloração com a adição de cinco mililitros de FPS e incubá-las por um a cinco minutos à temperatura ambiente.Dilua 10 vezes com PBS morno e centrifugue por cinco minutos a 300 Gs em temperatura ambiente. Descarte o sobrenadante e lave mais duas vezes com PBS, ressuspendendo as células em IMDM completo. Idealmente, de 10 a 20 vezes 10ª parte das seis células de cada população de linfócitos T devem ser misturadas em tubos de falcão de quatro mililitros numa proporção de um para um.Para calcular a proporção exata de entrada, guarde de cinco a dez microlitros da suspensão celular injetada, denominada entrada, e mantenha-a a quatro graus Celsius. Centrifugue a mistura celular a ser injetada a 300 Gs durante cinco minutos à temperatura ambiente. Re-suspenda as células a serem injetadas em 250 a 300 microlitros de PBS morno. Carregue uma seringa de insulina de um CC com agulha de 28 graus com as células para injeção.Injete 250 microlitros da mistura celular pela veia da cauda. Por fim, analise as células de entrada por citometria de fluxo para obter a porcentagem de células positivas para CFSE e C-M-T-M-R que foram previamente injetadas. Essa será a proporção de entrada utilizada.No cálculo final do índice de homing. Suspenderemos as amostras celulares dos tecidos para análise do homing de linfócitos T numa densidade não superior a três vezes 10 elevado às seis células por mililitro. Se forem utilizados camundongos congênicos como receptores neste vídeo, células positivas para CD45.1 foram marcadas com o marcador congênico apropriado combinado com algum marcador de linhagem durante a análise citométrica; selecionar as células com base no marcador congênico escolhido e, em seguida, no marcador de linhagem específico CD8, e analisar as proporções entre células CMTMR e células positivas para CFSE.Os dados são então expressos como o índice de homing ou hi, que é calculado como a razão entre os dois corantes diferentes em cada tecido dividida pela razão de entrada correspondente. A razão de entrada é a proporção entre as células positivas para CFSE e as células positivas para CMTM TMR na seringa antes da injeção, calculada a partir da alíquota de cinco a 10 microlitros de suspensão celular que foi reservada e analisada por citometria de fluxo para essa finalidade. Se a razão de entrada for muito próxima de um, então as razões nos tecidos serão equivalentes ao hi.Se o IH e o sangue forem significativamente diferentes de um, o IH nos tecidos analisados pode ser normalizado pelo IH no sangue, calculando-se a razão entre o IH nos tecidos dividido pelo IH nas suspensões celulares obtidas do baço, linfonodos periféricos ou linfonodos linfáticos mesentéricos (MLN) e lâmina própria do intestino delgado (LP) 18 horas após a injeção. Foram analisadas a expressão de C-M-T-M-R e CFSE em células CD8 positivas e CD45.1 positivas ativadas com alfa4, beta7 e CCR9. Células T positivas para C-M-T-M-R com tropismo intestinal migraram para o baço em números iguais às células controle positivas para CFSE, mas exibiram um aumento acentuado na homing para o intestino e tecidos linfáticos associados ao intestino. O cálculo do IH para cada tecido confirmou ainda que as células T com tropismo intestinal e as células T controle migraram igualmente para o baço, mas, em contraste, as células T com tropismo intestinal migraram aproximadamente 10 vezes mais eficientemente para a LP em comparação com as células T controle após domínio do procedimento.O uso de camundongos congênicos em vez da marcação com corante pode ser realizado para avaliar a capacidade migratória de outros tipos celulares, como células dendríticas ou macrófagos. Como esses tipos celulares tendem a perder o corante após a injeção nos camundongos receptores, o uso de animais congênicos permite um rastreamento celular mais eficaz e por períodos muito mais longos após a transferência adotiva.

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Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Imunologia e Infecção

Migração de linfócitos T ocorre durante homing para órgãos linfóides, saia do vasculatura, e entrando em tecidos periféricos. Aqui, nós descrevemos um protocolo que pode ser usado para analisar migração de linfócitos...

Isolamento T de linfócitos humanos, Cultura e Análise da Migração In Vitro</em

Este vídeo descreve a imagem de células T CD8 infiltrantes de tumor residentes marcadas com anticorpos acoplados fluorescentemente em fatias de tumor de pulmão humano. Essa técnica permite análises em tempo real da migração de células T CD8 por meio de microscopia confocal.

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Apresenta-se um ensaio de migração de células ex vivo que permite a quantificação precisa do potencial de migração de células de crista neural entérico na presença de vários factores de crescimento.

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Os mecanismos que regulam a motilidade intersticial de células T efectoras CD4 em locais de inflamação são relativamente desconhecidos. Apresenta-se uma abordagem não invasiva para visualizar e manipular em células T CD4 + in vitro -primed na derme da orelha inflamado, permitindo o estudo do comportamento dinâmico destas células in situ.

Migração intersticial imagens de células CD4 T na derme inflamadas

Protocolos para avaliação quantitativa da quimiotaxia de linfócitos e migração são ferramentas importantes para pesquisa de Imunologia. Aqui, um protocolo em vitro é descrito que permite em tempo real, multiplexados avaliação da migração celular, bem como um complementares na vivo técnica permitindo rastreamento de células nativas para o baço.

Quantificar o humano Monocyte Chemotaxis In Vitro e linfócitos murino tráfico Vivo

O protocolo introduzido aqui permite a caracterização da capacidade pulmonar localizador de linfócitos humanos primários sob condições inflamatórias em vivo. Infiltração pulmonar de enviaram transferidas células imunes humanas em um modelo do rato da inflamação alérgica pode ser fotografada e quantificada por microscopia de fluorescência de luz-folha de tecido pulmonar quimicamente limpo.

Avançado de imagem do pulmão Homing linfócitos humanos em um Experimental em modelo Vivo de inflamação alérgica baseada em microscopia de luz-folha

Neste protocolo, os linfócitos são colocados na câmara superior de um sistema de transmigração, separados da câmara inferior por uma membrana porosa. A quimiocina é adicionada à câmara inferior, o que induz a migração ativa ao longo de um gradiente de quimiocina. Após 48 h, os linfócitos são contados em ambas as câmaras para quantificar o transmigration.

Avaliação da migração do linfócito em um sistema de transmigração ex vivo

Aqui apresentamos um protocolo para o aumento in vivo da ininvitro-homing indução de células T regulamentares. Neste protocolo, as células dendríticas são projetadas para produzir localmente altas concentrações da vitamina D ativa (1,25-dihidroxivitamina D ou 1,25[OH]2D) e a vitamina A ativa (ácido retinoico ou AR) de novo.

In Vivo Aumento da Indução de CélulaS T Reguladoras de Gut-Homing

Este protocolo fornece um método de isolamento primário de células T murinas e microscopia de lapso de tempo da migração de células T sob condições ambientais específicas com análise quantitativa.

Ensaio de migração in vitro em tempo real para células T CD8+ murinas primárias

Apresentamos protocolos aprimorados para transdução retroviral de receptores de tráfego e homing competitivo para estudar o posicionamento de linfócitos específicos de órgãos e microambientes mediados por receptores. Este método oferece informações valiosas sobre os mecanismos de tráfego de células imunes e tem aplicações potenciais em futuras pesquisas básicas e terapêuticas.

Transdução retroviral eficiente e homing competitivo para investigar a localização de células T mediadas por GPCR em diversos microambientes teciduais

Aprenda a realizar ensaios de homing competitivo para estudar a migração de células T com tropismo intestinal em camundongos. Este método permite comparar habilidades migratórias tecido-específicas de diferentes subtipos celulares simultaneamente.

Competitiva Ensaios Homing para Estudar Gut trópico-Migração de Células T

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