Todo-mount Análise imuno-histoquímica para Vascularização embrionárias Limb pele: um sistema modelo para estudar Morfogênese Branching Vascular em Embrião

Nós introduzimos um conjunto de montagem imunohistoquímica e microscopia confocal de varredura a laser com vários rotulagem para analisar a formação de uma intrincada rede vascular em pele de rato membro embrionárias.

O objetivo geral deste procedimento é realizar análises imuno-histoquímicas de montagem total para imagens de toda a vasculatura na pele do membro em desenvolvimento. Isso é feito primeiro cortando quatro membros do embrião, fixando os quatro membros em aldeído paraforme a 4% em PBS e, em seguida, desidratando-os em 100% de metanol. O segundo passo é usar uma pinça fina para descascar a pele na base do membro.

Siga as linhas tracejadas azuis e retire a pele em um prato contendo 100% de metanol. Remova a pele do membro. Em seguida, a coloração imuno-histoquímica com anticorpos primários vasculares específicos e anticorpos secundários fluorescentes é realizada na pele do membro.

Finalmente, a microscopia confocal de montagem total com marcação múltipla permitirá imagens robustas de toda a vasculatura da pele do membro Isso pode beneficiar dessa técnica em relação aos métodos existentes, como a análise histológica de contagem cruzada. O uso do seccionamento de embriões é que a análise imuno-histoquímica de toda a vasculatura da pele dos membros nos permite não apenas obter imagens de toda a vasculatura, incluindo os componentes celulares, mas também estudar processos de diferenciação e padronização das células dos vasos sanguíneos e da ramificação dos vasos linfáticos. Estamos demonstrando o procedimento junto com o pós-doutorado DA do meu laboratório, peles de membros embrionários são coletadas de camundongos fêmeas grávidas.

Depois de remover e lavar o útero, trabalhe sob um microscópio de dissecação para separar e dissecar os embriões. Uma vez que os embriões tenham sido dissecados, o próximo passo é remover os quatro LIMS dos embriões usando uma pinça fina. Corte os quatro lim no ombro e, em seguida, use uma pinça de anel para transferir os quatro lim para uma placa de 24 poços contendo gelo.

Frio, fresco 4%Paraform Hyde em PBS coloca dois quatro LIMS por poço em dois mililitros de 4%PFA. Fixe os quatro galhos com uma mistura suave em um misturador mutador a quatro graus Celsius durante a noite no dia seguinte. Remova o PFA de cada poço e adicione dois mililitros de PBS.

Lave as amostras por cinco minutos com uma mistura suave no misturador mutador à temperatura ambiente. Repita esta lavagem duas vezes para um total de três lavagens. Em seguida, transfira os quatro membros para um tubo inferior redondo de polipropileno de cinco mililitros contendo 100% de metanol armazenado a menos 20 graus Celsius em um freezer de enzimas com controle crítico de temperatura e sem função de degelo automático Após o armazenamento noturno e menos 20, a pele pode ser removida da queda.

Este é um dos aspectos mais críticos deste procedimento, pois o sucesso da coloração e imagem subsequentes depende de não danificar as peles. A pele do membro se separa facilmente do membro quando desidratada dessa maneira para descascar a pele dos quatro membros. Primeiro coloque o membro com o lado ventral voltado para cima.

Em seguida, usando uma pinça fina, disseque através da pele perto da base do membro em direção à pata em linha reta. Em seguida, disseque ao redor de todo o membro, descascando a pele ao girar o membro. Uma vez que as cascas tenham sido retiradas.

Os quatro membros começam a coloração imuno-histoquímica de montagem inteira das peles dos membros Prepare-se com antecedência. Três tubos de 50 mililitros com 75%50% e 25%metanol em PBT para reidratação. As peles, as peles dos membros são reidratadas por incubação através de uma série ralada de metanol da maior para a menor concentração de metanol por cinco minutos cada.

Para começar, transfira a pele do membro para um tubo de fundo redondo de polipropileno de cinco mililitros contendo 75% de metanol em PBT. Após cinco minutos no misturador mutador, aspire cuidadosamente o 75% de metanol e reabasteça com 50% de metanol e PBT. Cinco minutos depois.

Substitua o 50% de metanol por 25% de metanol e PBT. No final da incubação final. Aspire cuidadosamente o PBT de 25% de metanol e reabasteça com PBT.

Lave as peles dos membros por cinco minutos com uma mistura suave no misturador mutador em temperatura ambiente. Repita esta lavagem uma vez. Ter cuidado para não danificar as peles dos membros durante a troca de soluções.

Uma vez que as peles dos membros tenham sido reidratadas, bloqueie-as com o tampão de bloqueio apropriado. Incube por duas horas com uma mistura suave na batedeira de nozes em temperatura ambiente Após duas horas, coloque as peles dos membros em uma placa de Petri de 35 por 10 milímetros. Em seguida, use uma pinça de anel para transferir as peles para um tubo de fuga de dois mililitros contendo 800 microlitros de anticorpos primários diluídos no tampão de bloqueio apropriado.

Aqui, vários anticorpos primários derivados de diferentes espécies podem ser usados simultaneamente. Incube as peles dos membros com uma mistura suave no misturador mutador a quatro graus Celsius durante a noite no dia seguinte, coloque as peles dos membros em uma placa de Petri de 35 por 10 milímetros. Transfira as películas para um tubo inferior redondo de polipropileno de cinco mililitros contendo quatro litros do tampão de lavagem apropriado.

Lave cinco vezes por 15 minutos cada com uma mistura suave no misturador mutador em temperatura ambiente. Substitua cuidadosamente o tampão usado por um novo tampão para cada lavagem durante as lavagens. Prepare os anticorpos secundários para remover as partículas agregadas dos anticorpos secundários.

Use um filtro de seringa de membrana PVDF de 0,22 mícron para filtrar a solução de anticorpo secundário em um tubo de fuga de 1,5 mililitro. Em seguida, centrifugue a amostra filtrada a 15.000 RPM por 10 minutos a quatro graus Celsius para remover partículas e bolhas de ar. Colete a solução de anticorpos filtrada em um tubo de micro fuge de dois mililitros.

Quando as cinco lavagens estiverem concluídas, coloque as peles dos membros em uma placa de Petri de 35 por 10 milímetros e transfira-as para um tubo de microfuga de dois litros contendo 800 microlitros de anticorpos secundários no tampão de bloqueio. Diferentes anticorpos secundários conjugados fluorescentes derivados de diferentes espécies podem ser usados simultaneamente nesta etapa. Incube os membros e as peles no escuro por uma hora com uma mistura suave no misturador mutador à temperatura ambiente.

Após uma hora de incubação, coloque as peles dos membros em uma placa de Petri de 35 por 10 milímetros e transfira-as para um tubo de fundo redondo de polipropileno de cinco mililitros contendo quatro mililitros do tampão de lavagem apropriado. Lave cinco vezes por 15 minutos cada no escuro com uma mistura suave no misturador Tator em temperatura ambiente para obter imagens por microscopia confocal. As peles dos membros devem ser montadas em uma lâmina após a coloração imuno-histoquímica.

Para iniciar este procedimento, coloque as peles dos membros manchadas em uma placa de Petri de 35 por 10 milímetros, trabalhando sob um microscópio estéreo com baixa iluminação. Para evitar o branqueamento extenso de fotos, use uma pinça fina para remover cristais de poeira e fibras da camada interna das peles. Transfira as peles dos membros para uma lâmina de microscopia adesiva.

Coloque as películas com a camada interna voltada para cima na corrediça voltada para a lamínula. Em seguida, alise as cascas cuidadosamente usando uma pinça fina. Remova o tampão de lavagem de transporte com um lenço umedecido Kim.

Adicione a mídia de montagem Antifa às capas e coloque uma lamínula de 25 por 25 em cima das amostras. Tomando cuidado para não introduzir bolhas de ar, cure em uma superfície plana no escuro à temperatura ambiente para armazenamento a longo prazo das amostras. Sele a lamínula na lâmina com esmalte e guarde a quatro graus Celsius.

A padronização de nervos e vasos sanguíneos em camundongos para a pele dos membros em E 15.5 é mostrada por esses resultados representativos de microscopia de imunofluorescência confocal de marcação tripla de montagem inteira imunofluorescência do marcador de células pan-endoteliais pcam one é azul. O marcador de neurofilamento dois H três é verde e o marcador de células musculares lisas alfa SMA é vermelho. Essas imagens revelaram um padrão de ramificação característico das artérias alfa SMA positivas, indicado por ponta de seta branca alinhada com dois H, três nervos periféricos indicados por setas abertas, além de ramificação dos vasos sanguíneos.

Este modelo de vasculatura da pele do membro também pode revelar a padronização da ramificação dos vasos linfáticos usando o marcador de células endoteliais linfáticas LYVE um mostrado em vermelho e neuro pílula em dois mostrados em vasos linfáticos verdes são visualizados por LYV um e NRP dois, enquanto LYV um também é expresso por um subconjunto de macrófagos indicados pelas pontas de seta abertas. Essa técnica abre caminho para pesquisadores no campo da biologia vascular explorarem a padronização complexa e os processos de diferenciação da vasculatura durante o desenvolvimento tecidual, reparos teciduais e em condições de doença.