Name: Todo-mount Análise imuno-histoquímica para Vascularização embrionárias Limb pele: um sistema modelo para estudar Morfogênese Branching Vascular em Embrião (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-05-20T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 53 s
Description: Aprenda a realizar imuno-histoquímica de montagem total para analisar a vascularização em pele de membro embrionário de camundongo. Este método permite imagens de alta resolução da rede vascular durante o desenvolvimento.

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Agradecemos a K. Gill para a assistência com a criação do mouse e os cuidados e para a gestão de laboratório. Agradeço também aos membros Mukoyama laboratório para assistência técnica. O financiamento foi fornecido pelo Programa de Pesquisa Intramural dos Institutos de Saúde Naitonal.

1. Coleta de rato Pele Limb embrionárias (E13.5 E17.5 ~) <ol><li> Euthanize conectado fêmeas através de um procedimento aprovado. De acordo com nosso protocolo aprovado animais, as fêmeas são sacrificados por exposição ao CO 2 e, em seguida, assegurada por deslocamento cervical. Lay o animal à sua toalha de papel absorvente e deixe-o completamente em 70% EtOH / H 2 O de uma garrafa squeeze. </li><li> Dissecar o útero intacto e coloque-o em um prato 100 15 mm x Petri contendo solução gelada de Hanks salina balanceada (HBSS) para lavar o sangue. </li><li> Separado e dissecar o embrião. Remover o âmnio muito fina a partir do embrião. </li><li> (Opção) Dissecar um único embrião em um 35 10 mm x placa de Petri se cada embrião deve ser genotipados. Dissecados cauda é transferido para um tubo de 0,2 ml PCR para genotipagem. </li><li> Cortar as patas dianteiras do embrião e transferência forelimbs por uma pinça de anel em 24 placa bem contendo 2 ml de gelado paraformaldeído frescos 4% (PFA) em tampão fosfato salino (PBS). </li><li> Corrigir o forelimbs com suave mistura na Mixer Nutator a 4 ° C durante a noite. </li><li> No dia seguinte, retire a PFA e lavar três vezes por 5 min em 2 ml de PBS com leve mistura no Mixer Nutator à temperatura ambiente. </li><li> Transferir os membros anteriores em metanol 100% (MeOH) e armazená-los freezer a -20 ° C enzima (o freezer com controle de temperatura crítica e sem função de descongelação automática). Anticorpos primárias constantes da Tabela 1 trabalho após o tratamento MeOH 100%. </li><li> Peeling off do membro anterior, usando uma pinça fina. Pele dos membros, quando desidratado, deve separar facilmente a partir do membro. Primeiro lugar o membro com o lado ventral (lado da palma) voltado para cima. Em seguida, usando uma pinça fina, cortar a pele, como mostrado no vídeo. Próxima dissecar todo o membro inteiro, descascando a pele suavemente, sem qualquer dano. </li></ol> 2. Toda montagem de coloração imuno-histoquímica de Skins Limb <ol><li> Hidratar as peles de membros em 5ml de polipropileno tubos de fundo redondo, incubando através da série graduada de MeOH / PBT (PBS + 0,2% Triton X-100) (75%, 50%, 25%) por 5 min cada. Note-se que a troca de soluções deve ser cuidadoso para não danificar as peles dos membros. </li><li> Lavar duas vezes por 5 min em PBT com suave mistura na Mixer Nutator à temperatura ambiente. </li><li> Bloquear o membro com peles de cabra ou 10% de soro / PBS 0,2% TX100 tampão de bloqueio por anticorpos de cabra secundário ou 10% Donkey soro / PBS 0,2% TX100 tampão de bloqueio por anticorpos burro secundário por 2 horas com a mistura suave no Mixer Nutator em temperatura ambiente. </li><li> Coloque as cascas dos membros em um prato de 35 10 mm x Petri e transferência por uma pinça anel em microcentrífuga-2ml tubo com 800μl de anticorpos primários (diluição adequada, conforme listado nas tabelas) no tampão de bloqueio (ou 10% de soro de cabra / PBS 0,2 TX100% ou 10% Donkey soro / PBS 0,2% TX100). Incubar as peles membro com suave mistura na Mixer Nutator a 4 ° C durante a noite. Note-se que vários anticorpos primários derivados de espécies diferentes (por exemplo, anticorpo monoclonal de rato + anticorpo policlonal de coelho) podem ser usados ​​simultaneamente. </li><li> No dia seguinte, coloque as peles do membro em um prato de 35 10 mm x Petri e transferência por uma pinça anel em polipropileno 5ml de fundo redondo de tubo com 4ml da solução de lavagem (ou 2% de soro de cabra / PBS 0,2% ou 2 TX100 Donkey% de soro / PBS 0,2% TX100). </li><li> Lavar cinco vezes por 15 minutos com a mistura suave no Mixer Nutator à temperatura ambiente. </li><li> Coloque as cascas dos membros em um prato de 35 10 mm x Petri e transferência por uma pinça anel em microcentrífuga-2ml tubo com 800μl de anticorpos secundária no tampão de bloqueio (ou 10% de soro de cabra / PBS 0,2% ou 10% TX100 Donkey soro / PBS 0,2% TX100). Normalmente usamos anticorpos secundários a partir de Jackson ImmunoResearch (Cy3, Cy5, 1:300 diluições) ou Invitrogen (Alexa Fluor 488, Alexa Fluor 568, Alexa Fluor 633, 1:250 diluição). Filtrar a solução usando anticorpo secundário 0.22μm PVDF filtros de membrana seringa para remover as partículas agregadas dos anticorpos secundários. Incubar as peles dos membros no escuro ou envolto com papel alumínio por 1 hora com a mistura suave na Mixer Nutator à temperatura ambiente. Note-se que diferentes fluorescentes conjugados anticorpos secundários derivados de espécies diferentes podem ser usados ​​simultaneamente. </li><li> Coloque as cascas dos membros em um prato de 35 10 mm x Petri e transferência por uma pinça anel em 5ml de polipropileno tubos de fundo redondo com 4ml da solução de lavagem (ou 2% de soro de cabra / PBS 0,2% ou 2% TX100 Donkey soro / PBS 0,2% TX100). Lavar cinco vezes por 15 min no escuro ou envolto com folha de alumínio com a mistura suave no Mixer Nutator à temperatura ambiente. </li><li> (Opção para contracoloração contra núcleo) Incubar as peles membro com 4ml da solução de lavagem (ou cabra 2% de soro / PBS 0,2% ou 2% TX100 Donkey soro / PBS 0,2% TX100) com To-Pro-3 (Invitrogen T3605 , 1:3000 diluição) no escuro ou envolto com papel alumínio por 10 minutos com a mistura suave no Mixer Nutator na sala de temperature. Então, lave três vezes por 5 min com 4ml da solução de lavagem (ou 2% de soro de cabra / PBS 0,2% ou 2% TX100 Donkey soro / PBS 0,2% TX100) no escuro ou envolto por folhas de alumínio com a mistura suave no o Mixer Nutator à temperatura ambiente. Note-se que a coloração forte e específica para núcleos é observado para To-pro-3 em uma emissão específica (HeNe excitação nm 633). </li></ol> 3. Montagem do Skins Limb no slide <ol><li> Coloque as cascas em um membro 35 10 mm x placa de Petri. Remover poeiras, cristais, fibras da camada interna da pele, usando uma pinça fina sob o estereomicroscópio com iluminação baixa para evitar a foto branqueamento extensivo. </li><li> Transferir os skins membro para lâmina de microscópio adesiva por uma pinça de anel. Coloque as peles com a camada interna deitada para cima no slide (ou seja, para lamela). Achate as peles cuidadosamente usando uma pinça fina e remover carry-over tampão de lavagem por Kimwipe. </li><li> Montagem em anti-fade meios de montagem sem bolhas de ar. Nós usamos 25 "x25" lamela. Cura em uma superfície plana no escuro (por exemplo, as amostras montado usando Prolongar reagente de ouro são colocadas durante a noite no escuro à temperatura ambiente antes de visualizar). Para armazenamento a longo prazo, vedar a lamela para o slide e armazenar a 4 ° C. </li></ol> 4. Microscopia confocal <ol><li> Criar lasers apropriados para fluoróforos. Usamos Leica TCS microscópio confocal SP5 com três fontes de laser de argônio, incluindo 488nm (para Alexa Fluor 488 e GFP), 561nm DPSS (por Alexa Fluor 568 e Cy3) e 633 nm HeNe (por Alexa Fluor 633, Cy5 e Para-Pro-3) . </li><li> Use a ferramenta de busca sequencial para evitar ou reduzir a interferência em que todos os corantes em amostras de dobrar ou triplicar manchada será animado ao mesmo tempo. No modo de varredura seqüencial, as imagens serão gravadas em uma ordem seqüencial. </li><li> Mais informações gerais sobre corantes fluorescentes e lasers para a excitação pode ser fundada em "Microscopia Confocal para biólogos" por Hibbs (2004) </li></ol> 5. Resultados representante Todo-mount microscopia confocal triple-label immnofluorescence em pele de rato forelimb em E15.5 com anticorpos para o marcador de células pan-endotelial PECAM-1 (Figura 1A-C, D azul), o marcador neurofilamento 2H3 (Figura 1A verde), e o marcador de células musculares lisas αSMA (Figura 1A, B vermelho) revelou um padrão característico de ramificação das artérias αSMA +, alinhado com 2H3 + nervos periféricos na pele dos membros. Além de ramificação dos vasos sanguíneos, este membro modelo vascularização da pele é usada para estudar padrões de ramificação de vasos linfáticos utilizando anticorpos para o marcador de células endoteliais linfáticas lyve-1 (Figura 1D, E vermelha) e Neuropilin2 (NRP2) (Figura 1D, F verde ). <img src="/files/ftp_upload/2620/2620fig1.jpg" alt="Figura 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 1"> Figura 1. (AC) Artérias alinhar com os nervos periféricos na pele dos membros embrionárias. Todo-mount-label triple microscopia confocal immnofluorescence com anticorpos para o marcador de células pan-endotelial PECAM-1 (AC, azul), o marcador neurofilamento 2H3 (A, verde), eo marcador de células musculares lisas αSMA (A e B, vermelho ) é mostrado. No E15.5, 2H3 + nervos periféricos (setas abertas) associado com artérias (setas), que são cobertos por αSMA + células musculares lisas. (DF) vasculatura linfática na pele dos membros embrionárias. Label triple-microscopia confocal immnofluorescence com anticorpos para o marcador de células pan-endotelial PECAM-1 (D, azul), o marcador de células endoteliais linfáticas lyve-1 (D e E, vermelho) e Neuropilin2 (NRP2) (D e F, verde ) é mostrado. Vasos linfáticos são visualizados por ambos lyve-1 e NRP2, enquanto lyve-1 também é expressa por um subconjunto de macrófagos (setas abertas). Barra de escala: 100μm.

<ol><li>Mukouyama, Y. S., Shin, D., Britsch, S., Taniguchi, M., Anderson, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sensory+nerves+determine+the+pattern+of+arterial+differentiation+and+blood+vessel+branching+in+the+skin%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Sensory nerves determine the pattern of arterial differentiation and blood vessel branching in the skin.</a> Cell. 109, 693-705 (2002).</li>
<li>Mukouyama, Y. S., Gerber, H. P., Ferrara, N., Gu, C., Anderson, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Peripheral+nerve-derived+VEGF+promotes+arterial+differentiation+via+neuropilin+1-mediated+positive+feedback%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Peripheral nerve-derived VEGF promotes arterial differentiation via neuropilin 1-mediated positive feedback.</a> Development. 132, 941-952 (2005).</li>
<li>Wang, H. U., Chen, Z. F., Anderson, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+distinction+and+angiogenic+interaction+between+embryonic+arteries+and+veins+revealed+by+ephrin-B2+and+its+receptor+Eph-B4%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Molecular distinction and angiogenic interaction between embryonic arteries and veins revealed by ephrin-B2 and its receptor Eph-B4.</a> Cell. 93, 741-753 (1998).</li>
<li>Gerety, S. S., Wang, H. U., Chen, Z. F., Anderson, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Symmetrical+mutant+phenotypes+of+the+receptor+EphB4+and+its+specific+transmembrane+ligand+ephrin-B2+in+cardiovascular+development%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell%22%5BJournal%5D)">Symmetrical mutant phenotypes of the receptor EphB4 and its specific transmembrane ligand ephrin-B2 in cardiovascular development.</a> Mol Cell. 4, 403-414 (1999).</li>
</ol>

Não há conflitos de interesse declarados.

O sistema vascular é fundamental para o desenvolvimento do órgão durante a embriogênese, bem como para a manutenção de órgãos e funções reprodutivas nos adultos, pois fornece oxigênio e nutrientes suficientes para os órgãos. Rede vascular adequada é bem estabelecido com processos complexos e multi-passo a angiogênese em que o pré-existentes da rede capilar é reorganizada com estruturas altamente ramificada e hierarquizada. Apesar de inúmeros trabalhos têm demonstrado que uma variedade de moléculas está envolvida nestes ...

Anticorpos Pan-endotelial marcador de células <table border="1"><tbody><tr><td> Anticorpo </td><td> Espécies </td><td> Companhia </td><td> Catálogo # </td><td> Condição de trabalho </td></tr><tr><td> PECAM-1 </td><td> Hamster Armenian (M) </td><td> Chemicon </td><td> MAB1398Z </td><td> Diluição 1:100 # 1 </td></tr><tr><td> PECAM-1 </td><td> Rat (M) </td><td> BD </td><td> 553369 </td><td> 1:300 diluição </td></tr><tr><td> VEGFR2 </td><td> Rat (M) </td><td> eBioscience </td><td> 14-5821-82 </td><td> Diluição de 1:200 </td></tr><tr><td> CD34 </td><td> Rat (M) </td><td> eBioscience </td><td> 13-0341 </td><td> 1:300 diluição </td></tr><tr><td> Colágeno IV </td><td> Coelho (P) </td><td> AbD Serotec </td><td> 2150-1470 </td><td> 1:300 diluição # 2 </td></tr></tbody></table> Marcador de células endoteliais arteriais <table border="1"><tbody><tr><td> Anticorpo </td><td> Espécies </td><td> Companhia </td><td> Catálogo # </td><td> Condição de trabalho </td></tr><tr><td> Neuropilin1 </td><td> Coelho (P) </td><td> O laboratório Kolodkin Alex # 3 </td><td></td><td> 1:3000 diluição </td></tr><tr><td> Unc5H2 </td><td> Bode (P) </td><td> R &amp; D </td><td> AF1006 </td><td> Diluição de 1:200 </td></tr></tbody></table> Venosa marcador de células endoteliais <table border="1"><tbody><tr><td> Anticorpo </td><td> Espécies </td><td> Companhia </td><td> Catálogo # </td><td> Condição de trabalho </td></tr><tr><td> EphB4 </td><td> Bode (P) </td><td> R &amp; D </td><td> AF446 </td><td> Diluição 1:100 </td></tr></tbody></table> Linfática marcador de células endoteliais <table border="1"><tbody><tr><td> Anticorpo </td><td> Espécies </td><td> Companhia </td><td> Catálogo # </td><td> Condição de trabalho </td></tr><tr><td> Lyve-1 # 4 </td><td> Coelho (P) </td><td> Abcam </td><td> ab14917 </td><td> Diluição de 1:200 </td></tr><tr><td> Lyve-1 # 4 </td><td> Rat (M) </td><td> MBL </td><td> D225-3 </td><td> Diluição de 1:200 </td></tr><tr><td> Prox-1 </td><td> Coelho (P) </td><td> Chemicon </td><td> AB5475 </td><td> 1:1000 diluição </td></tr><tr><td> Prox-1 </td><td> Bode (P) </td><td> R &amp; D </td><td> AF2727 </td><td> 01:50 diluição </td></tr><tr><td> Neuropilin2 </td><td> Coelho (P) </td><td> Sinalização celular </td><td> 3366 </td><td> 1, 100 de diluição </td></tr><tr><td> Podoplanin </td><td> Hamster sírio (M) </td><td> Hibridoma Banco </td><td> 8.1.1 </td><td> Diluição de 1:200 </td></tr></tbody></table> Músculo liso marcador de células / pericyte <table border="1"><tbody><tr><td> Anticorpo </td><td> Espécies </td><td> Companhia </td><td> Catálogo # </td><td> Condição de trabalho </td></tr><tr><td> αSMA-Cy3 </td><td> Mouse (M) # 5 </td><td> Sigma </td><td> c-6198 </td><td> 1:500 diluição # 6 </td></tr><tr><td> NG2 </td><td> Coelho (P) </td><td> Chemicon </td><td> AB5320 </td><td> Diluição de 1:200 </td></tr><tr><td> SM22α </td><td> Coelho (P) </td><td> Abcam </td><td> ab14106 </td><td> Diluição de 1:200 </td></tr></tbody></table> Anticorpos para repórter GFP <table border="1"><tbody><tr><td> Anticorpo </td><td> Espécies </td><td> Companhia </td><td> Catálogo # </td><td> Condição de trabalho </td></tr><tr><td> GFP </td><td> Coelho (P) </td><td> Invitrogen </td><td> A11122 </td><td> 1:300 diluição </td></tr><tr><td> GFP </td><td> Rat (M) </td><td> Nacalai tesque </td><td> 04404-84 </td><td> 1:1000 diluição </td></tr><tr><td> GFP </td><td> Chick (P) </td><td> Chemicon </td><td> P42212 </td><td> 1:300 diluição </td></tr></tbody></table> Anticorpos para repórter LacZ <table border="1"><tbody><tr><td> Anticorpo </td><td> Espécies </td><td> Companhia </td><td> Catálogo # </td><td> Condição de trabalho </td></tr><tr><td> β-gal </td><td> Coelho (P) </td><td> MP Biomédica </td><td> 55976 </td><td> 1:5000 diluição </td></tr><tr><td> β-gal </td><td> Bode (P) </td><td> AbD Serotec </td><td> 4600-1409 </td><td> 1:500 diluição </td></tr><tr><td> β-gal </td><td> Chick (P) </td><td> Abcam </td><td> ab9361 </td><td> Diluição de 1:200 </td></tr></tbody></table> Anticorpos para axônio periférico <table border="1"><tbody><tr><td> Anticorpo </td><td> Espécies </td><td> Companhia </td><td> Catálogo # </td><td> Condição de trabalho </td></tr><tr><td> 2H3 </td><td> Mouse (M) # 7 </td><td> Hibridoma Banco </td><td> 2H3 </td><td> Diluição de 1:200 </td></tr><tr><td> Tuj1 </td><td> Mouse (M) # 8 </td><td> Covance </td><td> MMS-435P </td><td> 1:500 diluição </td></tr><tr><td> Periferina </td><td> Coelho (P) </td><td> Chemicon </td><td> AB1530 </td><td> 1:1000 diluição </td></tr></tbody></table> Anticorpos para as células de Schwann migrando <table border="1"><tbody><tr><td> BFABP </td><td> Coelho (P) </td><td> O laboratório de Thomas Müller # 9 </td><td></td><td> 1:3000 diluição </td></tr></tbody></table> (P): anticorpo policlonal, (M): anticorpo monoclonal # 1: Goat anti-armênio hamster-Cy3 anticorpos (Jackson ImmunoResearch 127-165-160) deve ser usado como um anticorpo secundário. # 2: O Colágeno IV anticorpos podem ser usados ​​para detectar os vasos sanguíneos após a hibridização in situ. # 3: O anticorpo Neuropilin1 é gentilmente cedidas pelo laboratório do Kolodkin Alex na Johns Hopkins University. Ovelhas anti-anticorpo humano Neuropilin1 está disponível em P &amp; D (AF3870), embora não tenha testado ainda. # 4: Os anticorpos lyve-1 também detectar um subconjunto de macrófagos na pele embrionárias. # 5: O anticorpo anti-rato αSMA é anticorpo monoclonal IgG2a. # 6: O Cy3-conjugados de anticorpos αSMA é incubada por 1 hora à temperatura ambiente, juntamente com secanticorpos secundária para outros anticorpos primários. # 7: 2H3 anticorpo é rato anticorpo IgG1 monoclonal contra neurofilamento. # 8: Tuj1 anticorpo é rato de anticorpos monoclonais contra IgG2a Neuron-specific classe III beta-tubulina. # 9: O BFABP anticorpos (cérebro-específica de ácidos graxos binding protein) é gentilmente cedidas pelo laboratório do Thomas Müller em Max-Delbrück-Center de Medicina Molecular.

todo-mount análise imuno-histoquímica para vascularização embrionárias limb pele: um sistema modelo para estudar morfogênese branching vascular em embrião

Whole-mount Immunohistochemical Analysis for Embryonic Limb Skin Vasculature: a Model System to Study Vascular Branching Morphogenesis in Embryo

Todo-mount análise imunohistoquímica para a imagem latente toda a vasculatura é fundamental para a compreensão dos mecanismos celulares de ramificação morfogênese. Nós desenvolvemos o membro modelo vascularização da pele para estudar o desenvolvimento vascular em que um pré-existentes primitiva do plexo capilar é reorganizado em uma rede hierarquicamente ramificada vascular. Todo-mount microscopia confocal com rotulagem múltiplos permite imagem robusta dos vasos sanguíneos intacta, assim como seus componentes celulares, incluindo células endoteliais, pericitos e células musculares lisas, usando marcadores fluorescentes específicos. Avanços neste modelo vasculatura membro pele com estudos genéticos têm melhorado a compreensão dos mecanismos moleculares do desenvolvimento vascular e padronização. O membro modelo vasculatura da pele tem sido usada para estudar como os nervos periféricos fornecer um modelo espacial para a diferenciação e padronização das artérias. Este artigo descreve um protocolo de vídeo simples e robusto para corar vasos sanguíneos vascular intacto com anticorpos específicos e fluorescentes anticorpos secundários, que é aplicável para os órgãos vascularizados embrionárias, onde somos capazes de acompanhar o processo de desenvolvimento vascular.

Nós introduzimos um conjunto de montagem imunohistoquímica e microscopia confocal de varredura a laser com vários rotulagem para analisar a formação de uma intrincada rede vascular em pele de rato membro embrionárias.

Todo-mount Análise imuno-histoquímica para Vascularização embrionárias Limb pele: um sistema modelo para estudar Morfogênese Branching Vascular em Embrião

A análise imuno-histoquímica de mount total (whole-mount) para a imagem de toda a vasculatura é fundamental para a compreensão dos mecanismos celulares da morfogênese de ramificação. Desenvolvemos o modelo de vasculatura da pele do membro para estudar o desenvolvimento vascular, no qual um plexo capilar primitivo pré-existente é reorganizado em uma rede vascular ramificada hierarquicamente. A microscopia confocal de mount total com marcação múltipla permite a imagem robusta de vasos sanguíneos intactos, bem como de seus componentes celulares, incluindo células endoteliais, pericitos e células musculares lisas, utilizando marcadores fluorescentes específicos. Avanços neste modelo de vasculatura da pele do membro, juntamente com estudos genéticos, aprimoraram a compreensão dos mecanismos moleculares do desenvolvimento e do padrão vascular. O modelo de vasculatura da pele do membro tem sido utilizado para estudar como os nervos periféricos fornecem um molde espacial para a diferenciação e o padrão das artérias. Este artigo em vídeo descreve um protocolo simples e robusto para corar vasos sanguíneos intactos com anticorpos vasculares específicos e anticorpos secundários fluorescentes, aplicável a órgãos embrionários vascularizados, nos quais é possível acompanhar o processo de desenvolvimento vascular.

O objetivo geral deste procedimento é realizar uma análise imunohistoquímica em montagem inteira para a obtenção de imagens de toda a vasculatura na pele em desenvolvimento do membro. Isso é realizado primeiramente cortando quatro membros do embrião, fixando os quatro membros em paraformaldeído 4% em PBS e, em seguida, desidratando-os em metanol 100%. O segundo passo consiste em usar pinças finas para remover a pele na base do membro.Siga as linhas tracejadas azuis e retire a pele em um recipiente contendo metanol a 100%. Remova a pele do membro. Em seguida, realize a coloração imunohistoquímica com anticorpos primários específicos para vasos sanguíneos e anticorpos secundários fluorescentes na pele do membro.Por fim, a microscopia confocal em montagem inteira com marcação múltipla permitirá uma imagem robusta de toda a vasculatura da pele do membro, o que representa uma vantagem desta técnica em relação a métodos existentes, como a análise histológica por contagem cruzada. Diferentemente do seccionamento de embriões, a análise imunohistoquímica em montagem inteira da vasculatura da pele do membro permite-nos não apenas imaginar toda a vasculatura, incluindo os componentes celulares, mas também estudar os processos de diferenciação e o padrão de organização das células dos vasos sanguíneos e da ramificação dos vasos linfáticos. Estamos demonstrando o procedimento juntamente com DA Winding, pesquisadora pós-doutoranda do meu laboratório. Peles embrionárias de membros são coletadas de camundongos fêmeas grávidas.Após remover e lavar o útero, trabalhe sob um microscópio estereoscópico para separar e dissecar os embriões. Uma vez que os embriões tenham sido dissecados, o próximo passo é remover os quatro MIPs dos embriões usando pinças finas. Corte os quatro MIPs no ombro, depois use uma pinça em anel para transferir os quatro MIPs para uma placa de 24 poços contendo gelo.Coloque duas patas em cada poço com dois mililitros de paraformaldeído a 4% fresco e frio em PBS. Fixe as patas a 4 °C com agitação suave em um agitador rotativo durante a noite. No dia seguinte, remova o PFA de cada poço e adicione dois mililitros de PBS.Lave as amostras por cinco minutos com mistura suave no agitador rotativo à temperatura ambiente. Repita essa lavagem duas vezes, totalizando três lavagens. Em seguida, transfira os quatro membros para um tubo de polipropileno de fundo redondo de cinco mililitros contendo metanol a 100%, e armazene a menos 20 graus Celsius em um congelador enzimático com controle crítico de temperatura e sem função de descongelamento automático. Após armazenamento durante a noite a menos 20, a pele pode ser destacada do tecido subjacente.Esta é uma das partes mais críticas deste procedimento, pois o sucesso das etapas subsequentes de coloração e imagem depende de não danificar as peles. A pele do membro se separa facilmente do membro quando desidratada desta maneira, permitindo descascar a pele dos quatro membros. Primeiro, posicione o membro com o lado ventral voltado para cima.Em seguida, usando pinças finas, dissecar através da pele próxima à base do membro em direção à pata em linha reta. A seguir, dissecar ao redor de todo o membro, removendo a pele enquanto gira o membro. Uma vez que as peles tenham sido removidas.Os quatro membros iniciam a coloração imunohistoquímica em montagem inteira das peles dos membros. Prepare previamente três tubos de 50 mililitros com metanol a 75%, 50% e 25% em PBT para a reidratação. As peles, as peles dos membros, são reidratadas mediante incubação em uma série gradativa de metanol, das concentrações mais altas para as mais baixas, durante cinco minutos cada.Para começar, transfira a pele do membro para um tubo de polipropileno de fundo redondo de cinco mililitros contendo 75%methanol em PBT. Após cinco minutos no agitador rotativo, aspire cuidadosamente o 75%methanol e reponha com 50%methanol e PBT. Cinco minutos depois.Substitua o metanol 50% por metanol 25% e PBT. No final da incubação final, aspire cuidadosamente a solução de metanol 25% em PBT e reponha com PBT.Lave as peles dos membros por cinco minutos com mistura suave no agitador rotativo à temperatura ambiente. Repita essa lavagem uma vez. Tenha cuidado para evitar danificar as peles dos membros durante a troca das soluções.Uma vez que as peles dos membros tenham sido reidratadas, bloqueie-as com o tampão de bloqueio apropriado. Incube por duas horas com mistura suave no agitador nutator à temperatura ambiente. Após duas horas, coloque as peles dos membros em uma placa de Petri de 35 por 10 milímetros. Em seguida, use pinças de anel para transferir as peles para um tubo fuge de dois mililitros contendo 800 microlitros de anticorpos primários diluídos no tampão de bloqueio apropriado.Aqui, múltiplos anticorpos primários derivados de espécies diferentes podem ser usados simultaneamente. Incube as peles dos membros com mistura suave no agitador rotativo a quatro graus Celsius durante a noite; no dia seguinte, coloque as peles dos membros em uma placa de Petri de 35 por 10 milímetros. Transfira as peles para um tubo de polipropileno de cinco mililitros com fundo redondo contendo quatro litros do tampão de lavagem apropriado.Lave cinco vezes, durante 15 minutos cada, com mistura suave no agitador rotativo à temperatura ambiente. Substitua cuidadosamente o tampão usado por tampão novo a cada lavagem. Prepare os anticorpos secundários para remover partículas agregadas dos anticorpos secundários.Use um filtro de seringa com membrana de PVDF de 0,22 mícron para filtrar a solução de anticorpo secundário em um tubo fuge de 1,5 mililitro. Em seguida, centrifugue a amostra filtrada a 15.000 RPM durante 10 minutos a quatro graus Celsius para remover partículas e bolhas de ar. Colete a solução de anticorpo filtrada em um tubo microfuge de dois mililitros.Após as cinco lavagens, coloque as peles dos membros em uma placa de Petri de 35 por 10 milímetros e transfira-as para um tubo microcêntrifuga de dois litros contendo 800 microlitros de anticorpos secundários no tampão bloqueador. Diferentes anticorpos secundários conjugados com fluoróforos, derivados de espécies distintas, podem ser usados simultaneamente nesta etapa. Incube os membros e peles no escuro por uma hora, com mistura suave no agitador mutador, à temperatura ambiente.Após a incubação de uma hora, coloque as peles dos membros em uma placa de Petri de 35 por 10 milímetros e transfira-as para um tubo cônico de polipropileno de cinco mililitros contendo quatro mililitros do tampão de lavagem apropriado. Lave cinco vezes, durante 15 minutos cada, no escuro, com mistura suave no agitador Tator, à temperatura ambiente, para posterior imagem por microscopia confocal. As peles dos membros devem ser montadas sobre uma lâmina após a coloração imuno-histoquímica.Para iniciar este procedimento, coloque as peles coradas da extremidade em uma placa de Petri de 35 por 10 milímetros, trabalhando sob um microscópio estereoscópico com iluminação baixa. Para evitar a extensa fotodescoloração, use pinças finas para remover cristais de poeira e fibras da camada interna das peles. Transfira as peles da extremidade para uma lâmina de microscopia adesiva.Coloque as peles com a camada interna voltada para cima sobre a lâmina, virada para o coverslip. Em seguida, aplane as peles cuidadosamente usando pinças finas. Remova o tampão de lavagem residual com papel absorvente Kim.Adicione meio de montagem Antifa às peles e coloque uma lamínula de 25 por 25 sobre os espécimes. Tendo o cuidado de não introduzir bolhas de ar, deixe curar sobre uma superfície plana, no escuro e à temperatura ambiente, para armazenamento prolongado dos espécimes. Selle a lamínula ao lâmina com esmalte e armazene a quatro graus Celsius.O padrão de organização dos nervos e vasos sanguíneos em camundongos na pele da pata em E15,5 é demonstrado por esses resultados representativos de microscopia confocal de imunofluorescência tripla em preparação inteira. A marcação para o marcador pan-endoelial de células PCAM-1 é azul. O marcador de neurofilamento 2H3 é verde, e o marcador de células musculares lisas alfa-SMA é vermelho. Essas imagens revelaram um padrão característico de ramificação de artérias positivas para alfa-SMA, indicadas pela seta branca, alinhadas com os nervos periféricos 2H3, indicados por setas abertas, além da ramificação dos vasos sanguíneos.Este modelo de vasculatura da pele do membro também pode revelar o padrão de ramificação dos vasos linfáticos utilizando o marcador de células endoteliais linfáticas LYVE-1, mostrado em vermelho, e o Neuropilina-2, mostrado em verde. Os vasos linfáticos são visualizados por LYVE-1 e NRP-2, enquanto LYVE-1 também é expresso por um subconjunto de macrófagos, indicado pelas cabeças de seta abertas. Esta técnica abre caminho para pesquisadores na área de biologia vascular explorarem os complexos processos de padronização e diferenciação da vasculatura durante o desenvolvimento tecidual, reparo tecidual e em condições patológicas.

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Biologia

Aqui, descrevemos uma metodologia para entregar cabo de sangue humano derivado do endotélio formadoras de colônias de células (ECFCs) e derivadas da medula óssea de células-tronco mesenquimais (CTMs), incorporado em um gel de colágeno / fibronectina, por via subcutânea em ratos imunodeficientes. Esta combinação de células / gel gera uma rede vascular humano que se conecta com a vasculatura mouse.

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A vascularização é essencial para abordagens de engenharia de tecidos bem sucedida. Portanto, tecnologias confiáveis ​​são necessários para avaliar o desenvolvimento de redes vasculares em tecido construções. Aqui apresentamos um método simples e de baixo custo para visualizar e quantificar a vascularização in vivo.

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Um modelo de xenoenxerto derivado do paciente para malformação venosa

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