Name: Armadilha cromossomo associados para Identificar Interações de longo alcance DNA (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-04-23T14:00:00.000+00:00
Duration: 14 min 49 s
Description: Aprenda o ensaio ACT para identificar interações de longo alcance do DNA em células de leucemia promielocítica humana. Este método revela parceiros genômicos desconhecidos e a arquitetura nuclear tridimensional.

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Nós graças Adelle Murell e Wolf Reik muito para compartilhar seu protocolo 3C. Este trabalho foi financiado pelo Departamento de Defesa eo Serviço de Pesquisa do Departamento de Assuntos de Veteranos.

1. Fixação em formol de interações de longo alcance cromatina <ol><li> Cultura linha celular humana HL-60 em RPMI1640 média com 15% FBS e 1 x penicilina / estreptomicina a confluência de 80-90% em uma incubadora fornecido com 5% de CO 2 a 37 ° C. </li><li> Coletar as células em um tubo de 50 ml Nunc, centrifugar a 1.200 rpm por 15 minutos e remova o meio por aspiração </li><li> Adicionar 5 ml de meio de cultura para voltar a suspender as pelotas de células, e contar as células usando um hemocitômetro. Demorar cerca de 1 x 10 7 células para um volume de 40 ml com FBS RPMI1640 / 10%, em seguida, adicionar 1,7 ml de formaldeído 37% para corrigir a cromatina diluído. </li><li> Incubar à temperatura ambiente por 10 minutos, agitando suavemente, e depois apagar com 2,4 ml de glicina 2M. Centrifugar por 15 minutos a 1.200 rpm a 4 ° C, e remover o sobrenadante. Lave o pellet uma vez com 40 ml de gelo frio PBS, em seguida, girar o pellet e remover o PBS. </li></ol> 2. Lise celular para isolar núcleos <ol><li> Ressuspender as células em 40 ml de gelo tampão de lise gelada (10 mM Tris-HCl, pH8.0, 10 mM NaCl, 0,2% NP-40) com inibidores da protease recém adicionado (1:500 diluição) e 0,1 mM PMSF. Incubar em uma sala fria, com rotação de 90 minutos, centrifugar a 2.500 rpm por 15 minutos, e remover o sobrenadante. </li></ol> 3. Digestão com enzima de restrição Bgl II <ol><li> Ressuspender os núcleos em 0,5 ml de tampão NEB 1 x 3, e adicionar 15 μlof SDS 10%. Incubar a 37 ° C por 1 hora com agitação, em seguida, adicione 45 mL de 20% Triton X-100 para seqüestrar o SDS. Incubar a 37 ° C por 1 hora com agitação. </li><li> Use uma alíquota de 1 x 10 6 núcleos (cerca de 15 mg, 1 / 10 das células original) para a digestão enzima de restrição. Retire 55 ml de solução núcleos da Etapa 3.1 e completar a 500 mL com 433 mL de um tampão NEB x 3 e 12 mL de Bgl II (50U/ul). Incubar a 37 ° C durante a noite. </li></ol> 4. Ligadura de segmentos de DNA interagindo <ol><li> Inativar a enzima de restrição, adicionando 95 mL de SDS 10%, e desnaturados por aquecimento a 65 ° C por 20 minutos em banho-maria. </li><li> Adicionar 7 ml de um tampão ligadura x (30 mM Tris-HCl, pH 8,0, 10 mM MgCl 2, 10 mM DTT, 1 mM ATP) e 360 de mL Triton 20% X-100 e incubar a 37 ° C por 1 hora . </li><li> Abaixe a temperatura para 16 ° C e adicionar 50 ul de 400 U / mL DNA ligase T4. Incubar a amostra a 16 ° C por 4 horas e, em seguida, em temperatura ambiente por 30 minutos. </li></ol> 5. Purificação de DNA <ol><li> Adicionar 300 mg de proteinase K, e incubar a 65 ° C durante a noite. </li><li> Adicionar 5 mg de RNase A e incubar a 37 ° C por 30 minutos </li><li> Purificar DNA por extração de fenol / clorofórmio, eo DNA precipitado em isopropanol. Dissolver o DNA em 150 mL de água destilada estéril. </li></ol> 6. Digestão com Msp I e ligadura com linkers oligonucleotídeo <ol><li> Incubar 2μg de DNA purificado com 5 unidades de Msp I, a 37 ° C por 4-6 horas. Inativar Msp I a 65 ° C por 10 minutos, em seguida, precipitar o DNA em etanol com 1 ml de glicogênio 5 mg / ml. Dissolver o sedimento de DNA em 50 ul de água destilada estéril. </li><li> Mix 50 ul de DNA Msp I-tratados com 2 l de um oligonucleotídeo 20 L M linker (5'-gctgaccctgaattcgcacgtgcctgtcgttagcggacacagggcgattcac-3 '), 1 ml de um 20 mM oligonucleotídeo S (5'-cggtgaatc-3'), 1 ml de água destilada estéril e 6 mL de tampão ligase 10 x T4 DNA. Cubra a mistura com cera líquida. </li><li> Oligonucleotides desnaturar a 50 ° C por 1 minuto e deixe arrefecer gradualmente para 10 ° C em um gradiente de 0,5 ° C / minuto em um termociclador. </li><li> Adicionar 1 ml de 400 U / mL DNA ligase T4 e incubar a 15 ° C durante a noite. Purificar o DNA linker-ligado com um kit de purificação QIAquick PCR, e eluir em 50 l de água destilada estéril. </li></ol> 7. PCR amplificação e análise de seqüência de <ol><li> Escolha um primer para a região específica do DNA que você deseja examinar para interações de longo alcance (isto é, a 'isca'). Neste exemplo, usamos ABL-1. </li><li> Tomar 1 ml do DNA purificado para realizar a primeira rodada PCR utilizando 1 ml de 20 mM de primer -1 ABL específica # 4656 (5'-gttcaagcgattctcctgcctcga-3 '), 1 ml de 20 mM de primer específico linker # 2963 (5'- gctgaccctgaattcgcacgtgcct-3 '), 3μl de 3 x Klen Taq DNA polimerase I cocktail e 3 l de água destilada estéril. Dois mL de 32 P-dCTP é adicionado 100 ul de 3 x DNA polimerase Taq I Klen cocktail antes da amplificação PCR. O ciclo térmico de um hot start PCR é de 72 ° C por 2 min, 95 ° Cpara 2 minutos, 18 ciclos de 95 ° C por 20 segundos, 65 ° C por 40 segundos e 72 ° C por 1 minuto; extensão da final é realizada a 72 ° Cpor 5 minutos. </li><li> Purificar os primeiros produtos rodada PCR usando um kit de purificação QIAquick PCR e DNA eluída em 30 mL de água destilada estéril. </li><li> Tomar 1 ml de 100 x diluída produto PCR primeiro a realizar uma segunda rodada de PCR usando primers nested adicionando 1 ml de 20 mM ABL-1 primer específico # 4626 (5'-ggagaatttttatctgcctctgtga-3 ') (Figura 1a), 1 ml de 20 mM de primer específico linker # 2961 (5'-gtcgttagcggacacagggcgattc-3 '), 3 mL de 3 x Klen Taq DNA polimerase I cocktail e 3 l de água destilada estéril. A programação de ciclos térmicos é de 25 ciclos de 95 ° C por 20 segundos, 67 ° C por 40 segundos e 72 ° C por 1 minuto, seguido por extensão a 72 ° C por 5 minutos. </li><li> Visualize os produtos de PCR, executando a 5% gel uréia-PAGE e digitalização a tela exposta em um PhosphoImager (Figura 1b). Cada banda PCR pode ser reciclado a partir do gel, dissolvendo as tiras de gel em um tubo Eppendorf contendo 60 mL de água destilada estéril e incubar a 95 ° C por 5 minutos. Centrifugar brevemente a 10.000 rpm por 10 segundos para recolher todas as amostras. Retire 1 ml para usar como molde de DNA para realizar PCR com o par de iniciadores 2961/4626 usando as mesmas condições, como descrito acima. Análise da seqüência pode ser realizada depois da purificação usando um kit de purificação QIAquick PCR. </li><li> Seqüências de DNA são analisadas utilizando uma ferramenta online para determinar a sua localização cromossômica no site: http://genome.ucsc.edu (Figura 1c). Clique em 'BLAT' para introduzir uma nova janela que permite colar uma seqüência de DNA, uma nova janela aparece após clicar em 'Enviar', e mostra o 'Resultados da Pesquisa BLAT. Clique em "browser" da batida com 100% de identidade para entrar numa janela ao lado mostra a localização da seqüência de DNA. </li></ol> 8. Resultados representante 1. ACT ensaio usando ABL-1 região como isca para determinar suas interações DNA de longo alcance Como ilustrado na Figura 1a, dois sites Bgl II e um site que eu BAMH foram escolhidos para o ensaio ACT. Na segunda rodada de PCR, primer set 4626/2961 foi usado para amplificar ABL-M1, 4630/2961 foi usado para ABL-M2, e 4636/2961 foi usado para ABL-M3. Um padrão típico mostra um gel de várias bandas (Figura 1b). Cada fragmento de um ensaio ACT consiste em dois segmentos de DNA combinado: um segmento é derivada da região do DNA isca, enquanto o segundo segmento vem do parceiro associado, que se juntou ao segmento região isca pela primeira seqüência de reconhecimento enzima de restrição. A seqüência de reconhecimento segunda enzima irá aparecer no final da seqüência de parceiro associado (Figura 1c). O fragmento clonado ABL-M1 contém DNA da região de ABL1 localizado no cromossomo 9q32.4 de +133,592,306-133,592,399, e os parceiros associados está localizado no cromossomo 3p13 de +71,869,882-71,870,107. As identidades dos parceiros associados são descobertos por jateamento suas seqüências usando o browser genoma UCSC (GRCh7/hg19 lançado em fevereiro de 2009). PROK2 foi identificado como o parceiro associado no locus chr3p13. Da mesma forma, a ABL-M2 parceiro associado foi localizada chr5q21.1, enquanto clone ABL-M3 foi identificado como uma associação intra-cromossômicas perto do lugar-1 ABL. 2. Determinar menos prevalente interações de longo alcance usando ensaio ACT Outros ensaios com base em 3C relataram muitos mais parceiros do que a interação que temos mostrado na Figura 1 e na IGF2 / H19 lugar 12. A metodologia que temos delineado irá selecionar as mais prevalentes interações de longo alcance. No entanto, ao aumentar o número de ciclos de PCR, é possível identificar adicional, associações menos freqüentes, bem como (Figura 2). 3. Diferenças nas interações de longo alcance em células de câncer quando comparados com os tecidos normais. O ensaio ACT também pode ser usado para identificar diferenças na arquitetura nuclear e interações de longo alcance entre células normais e células cancerosas (Figura 3). Estas diferenças podem refletir mudanças arquitetura nuclear que ocorrem durante a transformação celular, e, portanto, este ensaio pode vir a ser aplicáveis ​​para fins de diagnóstico. Os padrões de gel semelhantes que ocorrem em ambos os normais e os tecidos de câncer indicou que o ensaio ACT é confiável e repetível. Enquanto o ensaio ACT pode identificar parceiros de longo alcance DNA, análises adicionais, tais como FISH e ensaios ChIP, são obrigados a verificar a presença das associações identificadas entre loci distantes. Estudos genéticos, fisiológicos e bioquímicos podem então ser realizados para elucidar as implicações biológicas dessas associações DNA de longo alcance. <img src="/files/ftp_upload/2621/2621fig1.jpg" alt="Figura 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 1"> Figura 1 usando ensaio ACT ABL-1 DNA região como isca em células HL-60. a. Struct DNAure na ABL-1 região. A enzima de restrição usada pela primeira vez no ACT ensaio foi Bgl II. Os primers para a segunda rodada de PCR também estão marcados por setas e números primário correspondente. b. Gel padrão do ensaio ACT em 5% de uréia-PAGE. O par de iniciadores 4626/2961 foi usado para amplificar clone ABL-M1 na PCR nested, 4630/2961 foi usada para clonar ABL-M2, e 4636/2961 foi usada para clonar ABL-M3. c. Seqüência de DNA do clone ABL-M1. Fragmento de DNA a partir de ABL-1 DNA isca é marcado em vermelho, eo parceiro de DNA associado é rotulado em ciano. Bgl II site (AGACTC) foi marcado em verde, e Msp site que eu (CCGG) é marcado em roxo. <img src="/files/ftp_upload/2621/2621fig2.jpg" alt="Figura 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 2"> Figura 2 ciclos de PCR afetar os resultados do ensaio ACT. Usando a região de controle imprinting (ICR) no locus Igf2/H19 como isca DNA em células de fibroblastos de rato, os programas de ciclismo diferentes foram aplicadas no primeiro e segundo turnos da PCR no ensaio ACT. 18-20 ciclos no primeiro turno da PCR não amplificar o sinal suficiente para ser visualizado. Vinte e cinco ciclos nos resultados da segunda PCR em bandas claras, enquanto aumenta o número de ciclos para a segunda rodada de PCR induziu um padrão de manchas, além de bandas mais. <img src="/files/ftp_upload/2621/2621fig3.jpg" alt="Figura 3" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 3"> Figura 3 detecção de diferenças na arquitetura nuclear entre o tecido normal e tecido do cólon câncer de cólon em ensaio ACT. A. Estrutura do DNA da região ICR em IGF2/H19 locus e gene IGF2. Locais DPN II para o ensaio ACT são rotulados. Primers utilizados na PCR segunda rodada estão marcados por setas e números em cores diferentes que correspondem a cada pista no painel b da figura. b. Gel padrão do ensaio ACT em 5% de uréia-PAGE. Tecido do cólon normal, MAD03-1423 e tecido de câncer de cólon MAD04-149 foi obtida a partir da Rede Cooperativa de Tecidos Humanos (CHTN) Divisão Ocidental. Depois de cada tecido do cólon foi homogeneizado, ensaio ACT foi realizada seguindo os procedimentos aqui descritos. Faixa 1 representa os resultados da PCR usando primers # # 2961and 4161 (5'-tctgcgccatcagggcagtgagac-3 ') marcado em rosa em um painel; lane 2 representa os resultados da PCR usando primers # 2961 e # 4163 (5'-gccgcgcggccacttccgattcc-3 ') marcado em laranja no painel a; faixa 3 representa os resultados da PCR usando primers # 2961 e # 5145 (5'-gccatgcaggtaggatttgagctg-3') marcada em azul no painel a; lane 4 representa os resultados da PCR usando primers # 2961 e # 5151 (5'-gtctcaaataggggccagctagcttgg-3 ') marcado em verde no painel de a. Bandas originais que só aparecem no tecido do cólon normal são marcados por setas amarelas, e as bandas que apareceu somente no tecido de câncer de cólon são rotulados de setas vermelhas. ICR, região de controle imprinting; DMR, região metilado diferentes.

<ol><li>Dekker, J., Rippe, K., Dekker, M., Kleckner, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Capturing+chromosome+conformation%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Capturing chromosome conformation.</a> Science. 295, 1306-1311 (2002).</li>
<li>Apostolou, E., Thanos, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Virus+Infection+Induces+NF-kappaB-dependent+interchromosomal+associations+mediating+monoallelic+IFN-beta+gene+expression%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Virus Infection Induces NF-kappaB-dependent interchromosomal associations mediating monoallelic IFN-beta gene expression.</a> Cell. 134, 85-96 (2008).</li>
<li>Duan, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+three-dimensional+model+of+the+yeast+genome%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">A three-dimensional model of the yeast genome.</a> Nature. 465, 363-367 (2010).</li>
<li>Lomvardas, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interchromosomal+interactions+and+olfactory+receptor+choice%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Interchromosomal interactions and olfactory receptor choice.</a> Cell. 126, 403-413 (2006).</li>
<li>Murrell, A., Heeson, S., Reik, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interaction+between+differentially+methylated+regions+partitions+the+imprinted+genes+Igf2+and+H19+into+parent-specific+chromatin+loops%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Genet%22%5BJournal%5D)">Interaction between differentially methylated regions partitions the imprinted genes Igf2 and H19 into parent-specific chromatin loops.</a> Nat Genet. 36, 889-893 (2004).</li>
<li>Schoenfelder, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preferential+associations+between+co-regulated+genes+reveal+a+transcriptional+interactome+in+erythroid+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Genet%22%5BJournal%5D)">Preferential associations between co-regulated genes reveal a transcriptional interactome in erythroid cells.</a> Nat Genet. 42, 53-61 (2010).</li>
<li>Spilianakis, C. G., Lalioti, M. D., Town, T., Lee, G. R., Flavell, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interchromosomal+associations+between+alternatively+expressed+loci%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Interchromosomal associations between alternatively expressed loci.</a> Nature. 435, 637-645 (2005).</li>
<li>Vakoc, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Proximity+among+distant+regulatory+elements+at+the+beta-globin+locus+requires+GATA-1+and+FOG-1%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell%22%5BJournal%5D)">Proximity among distant regulatory elements at the beta-globin locus requires GATA-1 and FOG-1.</a> Mol Cell. 17, 453-462 (2005).</li>
<li>Xu, N., Tsai, C. L., Lee, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transient+homologous+chromosome+pairing+marks+the+onset+of+X+inactivation%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Transient homologous chromosome pairing marks the onset of X inactivation.</a> Science. 311, 1149-1152 (2006).</li>
<li>Lieberman-Aiden, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comprehensive+mapping+of+long-range+interactions+reveals+folding+principles+of+the+human+genome%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Comprehensive mapping of long-range interactions reveals folding principles of the human genome.</a> Science. 326, 289-293 (2009).</li>
<li>Berkum, N. L. van <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hi-C%3A+a+method+to+study+the+three-dimensional+architecture+of+genomes%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Hi-C: a method to study the three-dimensional architecture of genomes.</a> J Vis Exp. , (2010).</li>
<li>Ling, J. Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CTCF+mediates+interchromosomal+colocalization+between+Igf2%2FH19+and+Wsb1%2FNf1%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">CTCF mediates interchromosomal colocalization between Igf2/H19 and Wsb1/Nf1.</a> Science. 312, 269-272 (2006).</li>
<li>Dekker, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+three+%27C%27s+of+chromosome+conformation+capture%3A+controls%2C+controls%2C+controls%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">The three 'C's of chromosome conformation capture: controls, controls, controls.</a> Nat Methods. 3, 17-21 (2006).</li>
</ol>

Não há conflitos de interesse declarados.

Dekker et al. Desenvolveu o cromossomo conformação capturar abordagem (3C) para detectar a freqüência de interação entre dois loci genômicos 1 e 3C tem sido amplamente utilizado para investigar associações cromossômicas intra-e inter-cromossômicas entre duas regiões do DNA em células de mamíferos conhecidos dois -9. Embora recém-desenvolvida metodologia de Hi-C pode ser aplicado para o estudo do genoma de DNA associação, ensaio ACT ainda é uma técnica eficaz para o estudo do locus específico de interação DNA 10-11. Nós modificamos essa abordagem para identificar regiões do DNA desconhecidos que estão associados a uma região do DNA conhecido no rato cultivadas e células humanas (Figura 1). Chamamos este método na armadilha cromossomo associado ensaio (ACT), uma vez que nos forneceu um método confiável e reprodutível para identificar novos parceiros DNA desconhecidos que se associam a uma região conhecida de DNA alvo 12. Um ensaio bem sucedido 3C com controles adequados é feita antes de executar os aspectos novos do ensaio ACT 13. A fim tofind tantas regiões do DNA associado quanto possível, é necessário o uso de várias combinações de enzimas de restrição primeiro e segundo. É especialmente importante o uso de enzimas de restrição que são insensíveis a metilação CpG para realizar a etapa ligadura primeiro 3C. A ligação às proteínas e metilação do DNA também podem influenciar a eficiência restrição de digestão enzimática e pode levar à insuficiência de ligadura das regiões DNA associado para digestões certas enzimas de restrição. A ocorrência de ligadura intra ou inter-cromossômicas depende de proteínas DNA-cross-linking e apropriado mapas físicos de ambos das regiões DNA associado. Assim, alguns experimentos preliminares são essenciais para estabelecer uma possível concentração de formaldeído eficaz e tempo de tratamento no ensaio ACT. A gama de concentrações finais de formaldeído (from1.5% para 2%) têm sido utilizados em diversos laboratórios durante a parte 3C do ensaio 7,9. Alternativamente, os oligonucleotídeos utilizados como linkers pode ser projetado para combinar com o final coesa cortado pela enzima de restrição segundo. Embora descobrimos que 18-20 ciclos na primeira rodada de PCR e 20-25 ciclos no segundo turno da PCR poderia fornecer bandas claras, é necessário estabelecer as melhores condições de PCR para cada experimento (Figura 2). Intra-molécula annealing entre seqüência adaptador 5&#39;-end e 3&#39;-end complementares de uma cadeia de DNA pode ocorrer em PCR, inibe específicas do adaptador primário de recozimento com a molécula de DNA, e resultou em eficiência de amplificação muito mais baixo nos primeiros ciclos diversos. Após o DNA alvo foi ampliado para os ciclos, o montante pode ser muito maior do que estas reações inespecíficas, e pode facilitar a competição de primer annealing para as moléculas de DNA alvo. É também por isso nós podemos ver a amplificação de fundo, e porque o primeiro produto da PCR rodada tem que ser diluído para diminuir amplification.It fundo é importante para remover excesso de primers a partir da reação de PCR, a fim de diminuir a fundo na segunda rodada de PCR. Como em todos os experimentos baseados em PCR, é essencial para projetar primers que não estão localizados em regiões de repetição de seqüência, que constituem a maioria do DNA humano e do rato. Embora recém-desenvolvida metodologia de Hi-C pode ser aplicado para o estudo do genoma de DNA associação, ensaio ACT ainda é uma técnica eficaz para o estudo do locus específico de interação DNA.

<table><tbody><tr><td>Meio RPMI1640</td><td>Invitrogen</td><td>22400-105</td><td></td></tr><tr><td>acrilamida</td><td>Invitrogen</td><td>15512-023</td><td></td></tr><tr><td>Solução de ATP, 10 mM</td><td>Invitrogen</td><td>AM8110G</td><td></td></tr><tr><td>soro bovino fetal</td><td>Invitrogen</td><td>16000-044</td><td></td></tr><tr><td>penicilina-estreptomicina</td><td>Invitrogen</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>Tris 1 M, pH 8,0</td><td>Invitrogen</td><td>AM9856</td><td></td></tr><tr><td>RNase A</td><td>Invitrogen</td><td>12091-039</td><td></td></tr><tr><td>SDS</td><td>Invitrogen</td><td>15525-017</td><td></td></tr><tr><td>ureia</td><td>Invitrogen</td><td>15505-035</td><td></td></tr><tr><td>&lt;em&gt;BamH&lt;/em&gt; I</td><td>New England Biolabs</td><td>R0136T</td><td></td></tr><tr><td>&lt;em&gt;Bgl&lt;/em&gt; II</td><td>New England Biolabs</td><td>R0144M</td><td></td></tr><tr><td>&lt;em&gt;Dpn&lt;/em&gt; II</td><td>New England Biolabs</td><td>R0543T</td><td></td></tr><tr><td>&lt;em&gt;Msp&lt;/em&gt; I</td><td>New England Biolabs</td><td>R0106S</td><td></td></tr><tr><td>dNTPs</td><td>New England Biolabs</td><td>N0447L</td><td></td></tr><tr><td>proteinase K</td><td>New England Biolabs</td><td>P8102S</td><td></td></tr><tr><td>ligase de DNA T4</td><td>New England Biolabs</td><td>M0202T</td><td></td></tr><tr><td>formaldeído 37%</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F8775</td><td></td></tr><tr><td>Bis-acrilamida</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>146072</td><td></td></tr><tr><td>ditiotreitol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>43815</td><td></td></tr><tr><td>glicina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>50046</td><td></td></tr><tr><td>PMSF</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>93482</td><td></td></tr><tr><td>inibidor de proteinase</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S8830</td><td></td></tr><tr><td>Nonidet P-40</td><td>Roche Group</td><td>11754599001</td><td></td></tr><tr><td>KlenTaq1</td><td>Ab peptides</td><td>1001</td><td></td></tr><tr><td>dCTP alfa P32</td><td>PerkinElmer, Inc.</td><td>BLU513H250UC</td><td></td></tr><tr><td>Ciclador Térmico PTC-100</td><td>MJ Research</td><td>mjptc100</td><td></td></tr><tr><td>Fonte de Alimentação</td><td>Bio-Rad</td><td>164-5056</td><td></td></tr><tr><td>OmniPAGE Maxi</td><td>Aurogene Life Science</td><td>VS20D</td><td></td></tr><tr><td>Typhoon 9400</td><td>GE Healthcare</td><td>63-0055-78</td><td></td></tr></tbody></table>

armadilha cromossomo associados para identificar interações de longo alcance dna

Associated Chromosome Trap for Identifying Long-range DNA Interactions

Informação genética codificada pelo DNA é organizado em uma estrutura complexa e altamente regulamentado cromatina. Cada cromossomo ocupa um território específico, que pode mudar de acordo com o estágio de desenvolvimento ou do ciclo celular. Expressão gênica pode ocorrer em fábricas especializadas em segmentos transcricional da cromatina podem loop out cromossomo a partir de territórios diversos, levando a co-localização de segmentos de DNA que podem existir em cromossomos diferentes ou distantes no mesmo cromossomo. A Associated cromossomo Armadilha ensaio (ACT) fornece uma metodologia eficaz para identificar essas associações de longo alcance DNA de uma maneira imparcial, estendendo e modificando o cromossomo técnica de captura de conformação. O ensaio ACT torna possível para nós para investigar os mecanismos de regulação da transcrição em trans, e podem ajudar a explicar a relação da arquitetura nuclear para a expressão do gene na fisiologia normal e durante estados de doença.

O associado armadilha cromossomo ensaio (ACT) é um novo método imparcial para identificar as interações de longo alcance DNA. A caracterização das interações DNA de longo alcance nos permitirá determinar a relação da arquitetura nuclear para a expressão do gene em ambos os fisiologia normal e em estados doente.

Armadilha cromossomo associados para Identificar Interações de longo alcance DNA

A informação genética codificada pelo DNA está organizada em uma estrutura de cromatina complexa e altamente regulada. Cada cromossomo ocupa um território específico, ...

O objetivo geral do experimento a seguir é descobrir e identificar parceiros de DNA associados em longa distância. Isso é alcançado por meio da fixação, lise celular e digestão do DNA pela primeira enzima de restrição, seguida pela ligação para criar um DNA quimérico composto por segmentos dos dois genes associados. Em seguida, ligantes são adicionados ao DNA quimérico após a segunda digestão de restrição para facilitar sua amplificação. A amplificação por PCR é então realizada usando primers específicos para os ligantes e para o DNA isca, a fim de obter quantidades suficientes dos fragmentos de DNA associados. Os resultados obtidos mostram os parceiros de DNA associados em longa distância com o DNA isca, com base na análise de sequência dos fragmentos de DNA amplificados.A principal vantagem desta técnica em relação a métodos existentes, como a captura de conformação de cromossomos ou o três C, é que o A-C-T-S-A pode ser usado para identificar efetivamente um parceiro de DNA associado em longo alcance desconhecido. Enquanto o três C surgiu para verificação apenas de interações previamente suspeitadas. Para iniciar este protocolo, cultive células humanas em um incubador suprido com 5% de dióxido de carbono a 37 graus Celsius até que atinjam 80 a 90% de confluência.Células de leucemia promielocítica aguda humana são utilizadas para esta demonstração. Colete as células despejando-as em um tubo NOC de 50 mililitros e centrifugue a 1200 RPM por 15 minutos. Após a centrifugação, remova o meio por aspiração.Adicione cinco mililitros de meio de cultura para ressuspender os pellets celulares. Após a contagem das células com um hemocitômetro, transfira aproximadamente um vezes 10 à sétima células para um volume de 40 mililitros com RPMI 1640, meio contendo 10% de FBS. Em seguida, adicione 1,7 mililitro de formaldeído a 37% para fixar a cromatina diluída.Incube a amostra à temperatura ambiente por 10 minutos com agitação suave. Após a incubação, interrompa a reação com 2,4 mililitros de glicina 2 molar. Em seguida, centrifugue a amostra por 15 minutos a 1200 RPM e 4 graus Celsius.Após remover o sobrenadante, lave o pellet uma vez com 40 mililitros de PBS gelado, em seguida centrifugue a amostra para recuperar o pellet celular lavado. Ressuspenda o pellet resultante em 40 mililitros de tampão de lise gelado contendo inibidores de protease recém-adicionados e PMSF 0,1 milimolar. Incube a amostra em câmara fria com rotação durante 90 minutos. Por fim, centrifugue a amostra a 2.500 RPM por 15 minutos, remova o sobrenadante e obtenha os núcleos isolados. Ressuspenda os núcleos em 0,5 mililitros de tampão NEB 1X e adicione 15 microlitros de SDS 10%.Incube a amostra a 37 graus Celsius por uma hora com agitação. Em seguida, adicione 45 microlitros de Triton X-100 a 20% para sequestrar o SDS e incube novamente a 37 graus Celsius por uma hora com agitação e alíquota de um vezes 10 à sexta. Os núcleos ou cerca de 15 microgramas são usados para digestão com enzima de restrição em 55 microlitros de solução de núcleos.Adicione 433 microlitros de um tampão XNEB três e 12 microlitros de BGL dois. Para obter um volume total de reação de digestão de 500 litros, incube a reação a 37 graus Celsius durante a noite. No dia seguinte, inative a enzima de restrição adicionando 95 microlitros de SDS a 10% e desnature a enzima aquecendo a 65 graus Celsius por 20 minutos.Em um banho-maria, adicione sete mililitros de tampão de ligação 1x e 360 microlitros de Triton X-100 a 20%. Incube a amostra a 37 graus Celsius por uma hora. Reduza a temperatura para 16 graus Celsius e adicione 50 microlitros de 400 unidades por microlitro.T quatro DNA ligase. Incube a reação de ligação a 16 graus Celsius por quatro horas e, em seguida, à temperatura ambiente por 30 minutos. Após a conclusão da ligação, adicione 300 microgramas de proteinase K e incube a 65 graus Celsius durante a noite.Em seguida, adicione cinco microgramas de RNAA e incube a 37 graus Celsius por 30 minutos. Purifique o DNA por extração com fenol-clorofórmio e precipite o DNA em isopropanol; dissolva o DNA precipitado em 150 microlitros de água destilada estéril. Para adicionar ligantes ao DNA quimérico, primeiro digira o DNA incubando dois microgramas de DNA purificado com cinco unidades de msp um, a 37 graus Celsius por quatro a seis horas. Após a digestão, inative o MSP um a 65 graus Celsius por 10 minutos.Em seguida, precipite o DNA em etanol com um microlitro de cinco miligramas por mililitro. Glicogênio, dissolva o pellet de DNA resultante em 50 microlitros de água destilada estéril. Em seguida, misture 50 microlitros de DNA tratado com MSP1 com dois microlitros de um oligonucleotídeo ligante de 20 micromolar (L) e um microlitro de um oligonucleotídeo S de 20 micromolar; então adicione um microlitro de água destilada estéril e seis microlitros de tampão 10 XT4 DNA Ligase.Cubra a mistura com cera líquida. Desnature os oligonucleotídeos a 50 graus Celsius por um minuto e deixe esfriar gradualmente até 10 graus Celsius em um gradiente de 0,5 graus Celsius por minuto. Usando um ciclador térmico, adicione um microlitro de ligase de DNA T4 a 400 unidades por microlitro e incube a reação a 15 graus Celsius durante a noite.No dia seguinte, purifique o DNA ligado ao ligante utilizando um kit de purificação rápida de PCR Kaya e elua em 50 microlitros de água destilada estéril. Em seguida, escolha um iniciador para a região específica de DNA a ser investigada quanto a interações de longo alcance. Neste exemplo, Abel será usado como o iniciador ou isca.Prepare o DNA purificado para a primeira rodada de PCR combinando um microlitro do DNA purificado com um microlitro de um iniciador específico do oligonucleotídeo um com concentração de 20 micromolar, 46 56, e um microlitro de um iniciador específico do ligador com concentração de 20 micromolar, 29 63. Em seguida, adicione três microlitros de três x ClinTech, uma mistura de DNA polimerase previamente preparada com 32 P-D-C-T-P de acordo com o protocolo escrito, seguido por três microlitros de água destilada estéril. Realize a amplificação por PCR utilizando o ciclo térmico de PCR com início quente descrito no protocolo escrito após a conclusão do ciclo de PCR.Limpe os produtos da primeira rodada de PCR utilizando um kit de purificação PCR rápido kaya. Eluir em 30 microlitros de água destilada estéril. Utilize um microlitro do produto da primeira PCR diluído 100 vezes para realizar uma segunda rodada de PCR usando primers aninhados, adicionando um microlitro de primer específico de 20 micromolar para o gene abel1, 46 26, e um microlitro de primer específico para o linker de 20 micromolar, 29 61.Novamente, adicione três microlitros de três x ClinTech, DNA polimerase, um coquetel e três microlitros de água destilada estéril. Realize a segunda rodada de PCR utilizando um programa térmico de 25 ciclos de 95 graus Celsius por 20 segundos, 67 graus Celsius por 40 segundos e 72 graus Celsius por um minuto, seguido por uma etapa de alongamento a 72 graus Celsius por cinco minutos.Visualize os produtos da PCR realizando um gel de página com ureia a 5% e, em seguida, escaneie a tela exposta em um imageador de fósforo. Cada banda de PCR pode ser recuperada do gel dissolvendo as tiras de gel em um tubo eppendorf contendo 60 microlitros de água destilada estéril e incubando a 95 graus Celsius por cinco minutos. Centrifugue os produtos de gel dissolvidos brevemente a 10.000 RPM por 10 segundos.Para coletar todas as amostras. Remova um microlitro para usar como modelo de DNA para realizar a PCR com o reparo do iniciador. 29 61 46 26.Usando as mesmas condições descritas acima, após a purificação, a análise de sequenciamento pode ser realizada com uma ferramenta online para determinar a localização cromossômica. Uma vez no site de bioinformática genômica, clique em blatt para gerar uma nova janela e cole a sequência de DNA. Após o envio da sequência de DNA, os resultados da busca BLATT serão exibidos.Clique no navegador no resultado com 100% de identidade para revelar a localização da sequência de DNA. A região do gene able foi usada como isca para determinar suas interações de DNA de longo alcance. Dois sítios BGL e um sítio BAM H foram escolhidos para o ensaio A CT na segunda rodada do conjunto de primers de PCR; o primer 46 26 29 61 foi usado para amplificar o alelo M1, o 46 30 29 61 foi usado para o alelo M2 e o 46 36 29 61 foi usado para o alelo M3.Um padrão típico de gel revela uma a várias bandas, como mostrado aqui para o clone M1 capaz, M2 capaz e M3 capaz. A sequência de DNA do clone M1 capaz é mostrada para demonstrar que cada fragmento proveniente de um ensaio A CT consiste em dois segmentos de DNA combinados. Um segmento é derivado da região de DNA isca, enquanto o segundo segmento provém do parceiro associado.Os segmentos são ligados uns aos outros pela primeira sequência de reconhecimento da enzima de restrição. A segunda sequência de reconhecimento da enzima aparecerá ao final da sequência parceira associada. O fragmento M1 clonável contém DNA da região do ABLE um localizada no cromossomo nove Q 32,4, e o parceiro associado está localizado no cromossomo três P três, que foi identificado como proc dois.Da mesma forma, o parceiro associado ABLE M2 foi localizado no cromossomo 5q21.1, enquanto o clone ABLE M3 foi identificado como uma associação intracromossômica próxima ao locus ABLE1, em contraste com os ensaios 3C. A metodologia descrita neste vídeo selecionará as interações de longo alcance mais prevalentes. No entanto, aumentando o número de ciclos de PCR, é possível identificar também associações adicionais menos frequentes, utilizando a região de impressão e controle ou ICR no locus IGF2-H19 como DNA isca em células de fibroblastos de camundongo, aplicando diferentes programas de ciclagem na primeira e segunda rodada de PCR no ensaio A CT.O ensaio A CT também pode ser utilizado para identificar diferenças na arquitetura nuclear e interações de longo alcance entre células normais e células cancerosas. O tecido normal do cólon e o tecido de câncer de cólon foram homogeneizados e o ensaio A CT foi realizado seguindo os procedimentos descritos aqui. É mostrada aqui a estrutura do DNA da região ICR no locus IGF dois H 19 e do gene IGF dois dpn.Dois sítios para o ensaio A CT são marcados; os iniciadores utilizados na PCR da segunda rodada são indicados por setas e números em diferentes cores. O padrão do gel no ensaio A CT representa os resultados da PCR utilizando o iniciador 29 61 com os pares de iniciadores 41, 61, 41 63, 51 45 e 51 51. As bandas únicas que aparecem apenas no tecido normal do cólon são indicadas por setas amarelas, e aquelas bandas que surgiram apenas no tecido de câncer de cólon são indicadas por setas vermelhas após seu desenvolvimento.Esta técnica abre caminho para pesquisadores na área de biologia do mercado explorarem a arquitetura nuclear e a regulação gênica de maneira tridimensional.

associated-chromosome-trap-for-identifying-long-range-dna-interactions

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

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