Armadilha cromossomo associados para Identificar Interações de longo alcance DNA

O objetivo geral do experimento a seguir é descobrir e identificar parceiros de DNA associados de longo alcance. Isso é conseguido por fixação, lise celular e digestão do DNA pela primeira enzima de restrição, seguida de ligação para criar um DNA quimérico composto de segmentos dos dois genes associados. Os próximos ligantes são adicionados ao DNA quimérico após a segunda digestão de restrição Para facilitar sua amplificação, a amplificação por PCR é então realizada usando primers específicos de DNA de ligante e isca para obter quantidades suficientes dos fragmentos de DNA associados Resultados são obtidos que mostram os parceiros de DNA associados de longo alcance com o DNA de isca com base na análise de sequência dos fragmentos de DNA amplificados.

A principal vantagem desta técnica sobre os métodos existentes, como a captura de confirmação cromossômica ou três C, é que o A-C-T-S-A pode ser usado para identificar um parceiro de DNA associado de longo alcance desconhecido de forma eficaz. Considerando que três C surgiram para verificação apenas de interações previamente suspeitas. Para iniciar esta cultura de protocolo, células humanas em uma incubadora forneceram 5% de dióxido de carbono a 37 graus Celsius até que estejam 80 a 90% confluentes.

Células de leucemia ácida de baile de formatura humana são usadas para esta demonstração. Recolha as células despejando-as em um tubo NOC de 50 mililitros e centrifugue a 1200 RPM por 15 minutos. Após centrifugação, remover o meio por aspiração.

Adicione cinco mililitros de meio de cultura para ressuspender os pellets celulares. Depois de contar as células com um hemocitômetro, leve aproximadamente uma vez 10 elevado à sétima célula até um volume de 40 mililitros com RPMI 1640, meio contendo 10% de FBS. Em seguida, adicione 1,7 mililitros de formaldeído a 37% para fixar a cromatina diluída.

Incubar a amostra à temperatura ambiente durante 10 minutos com agitação suave. Após a incubação, extinguir a reação com 2,4 mililitros de glicina de dois molares. Em seguida, centrifugue a amostra por 15 minutos a 1200 RPM e quatro graus Celsius.

Depois de remover o super natin, lave o pellet uma vez com 40 mililitros de PBS gelado, em seguida, centrifugue a amostra para recuperar o pellet de célula lavada, ressuspenda o pellet resultante em 40 mililitros de tampão de lise gelada com inibidores de protease recém-adicionados e PMSF 0,1 milimolar, incube a amostra em uma câmara fria com rotação por 90 minutos. Por fim, centrifugar a amostra a 2 500 RPM durante 15 minutos, retirar o super natin e obter os núcleos isolados. Suspenda novamente os núcleos em 0,5 mililitros de um tampão XNEB três e adicione 15 microlitros de 10% SDS.

Incubar a amostra a 37 graus Celsius por uma hora com agitação. Em seguida, adicione 45 microlitros de 20% Triton X 100 para sequestrar o SDS e incubar novamente a 37 graus Celsius por uma hora com agitação e alíquota de um vezes 10 elevado a sexto. Os núcleos ou cerca de 15 microgramas são usados para a digestão da enzima de restrição a 55 microlitros de solução de núcleos.

Adicione 433 microlitros de um buffer XNEB três e 12 microlitros de BGL dois. Para fazer um volume total de reação de digestão de 500 litros, incube a reação a 37 graus Celsius durante a noite. No dia seguinte, inative a enzima de restrição adicionando 95 microlitros de 10% SDS e desnature a enzima aquecendo a 65 graus Celsius por 20 minutos.

Em banho-maria, adicione sete mililitros de um tampão de ligadura e 360 microlitros de 20% Triton X 100. Incubar a amostra a 37 graus Celsius durante uma hora. Abaixe a temperatura para 16 graus Celsius e adicione 50 microlitros de 400 unidades por microlitro.

T quatro DNA Ligase. Deixe a reação de ligação incubar a 16 graus Celsius por quatro horas e depois à temperatura ambiente por 30 minutos. Após a ligadura estar completa, adicione 300 microgramas de proteinase K e incube a 65 graus Celsius durante a noite.

Em seguida, adicione cinco microgramas de RNAA e incube a 37 graus Celsius por 30 minutos. Purificar o DNA por extração de clorofórmio fenol e precipitar o DNA em isopropanol, dissolver o DNA precipitado em 150 microlitros de água destilada estéril. Para adicionar ligantes ao DNA quimérico, primeiro digerir o DNA incubando dois microgramas de DNA purificado com cinco unidades de msp, uma a 37 graus Celsius por quatro a seis horas após a digestão, inativar MSP um a 65 graus Celsius por 10 minutos.

Em seguida, precipite o DNA em etanol com um microlitro de cinco miligramas por mililitro. O glicogênio dissolve o DNA palato resultante em 50 microlitros de água destilada estéril. Em seguida, misture 50 microlitros de MSP, um DNA tratado com dois microlitros de um oligonucleotídeo ligante 20 micromolar L e um microlitro de um oligonucleotídeo S 20 micromolar, em seguida, adicione um microlitro de água destilada estéril e seis microlitros de tampão 10 XT quatro DNA Ligase.

Cubra a mistura com cera líquida. Desnaturar os oligonucleotídeos a 50 graus Celsius por um minuto e deixar esfriar gradualmente até 10 graus Celsius em um gradiente de 0,5 graus Celsius por minuto. Usando um termociclador, adicione um microlitro de 400 unidades por microlitro T quatro DNA ligase e incube a reação a 15 graus Celsius durante a noite.

No dia seguinte, purifique o DNA ligado ao ligante usando um kit de purificação de PCR rápido kaya e elua em 50 microlitros de água destilada estéril. Eles escolhem um primer para a região específica do DNA a ser investigada para interações de longo alcance. Neste exemplo, Abel será usado como primer ou isca.

Prepare o DNA purificado para a primeira rodada de PCR combinando um microlitro do DNA purificado com um microlitro de 20 micromolares capaz de um primer específico, 46 56, e um microlitro de 20 primer específico para ligantes micromolares 29 63. Em seguida, adicione três microlitros de três x ClinTech, DNA polimerase, um coquetel que foi previamente misturado com 32 P-D-C-T-P de acordo com o protocolo escrito, seguido de três microlitros de água destilada estéril. Realize a amplificação de PCR usando o ciclo térmico de PCR de partida a quente descrito no protocolo escrito após a conclusão do ciclo de PCR.

Purifique os produtos de PCR da primeira rodada usando um kit de purificação de PCR rápido kaya Elute em 30 microlitros de água destilada estéril. Use um microlitro do primeiro produto de PCR diluído 100 vezes para realizar uma segunda rodada de PCR usando primers aninhados, adicionando um microlitro de 20 micromolares capazes de um primer específico, 46 26, e um microlitro de 20 primer específico de ligante micromolar. 29 61.

Novamente, adicione três microlitros de três x ClinTech, DNA polimerase, um coquetel e três microlitros de água destilada estéril. Execute a segunda rodada de PCR usando um cronograma de ciclos térmicos de 25 ciclos de 95 graus Celsius por 20 segundos. 67 graus Celsius por 40 segundos e 72 graus Celsius por um minuto, seguidos por uma extensão a 72 graus Celsius por cinco minutos.

Visualize os produtos de PCR executando um gel de página de 5% de ureia e, em seguida, digitalizando a tela exposta em um gerador de imagens de fosfo. Cada banda de PCR pode ser reciclada do gel dissolvendo as tiras de gel em um tubo einor contendo 60 microlitros de água destilada estéril e incubando a 95 graus Celsius por cinco minutos. Centrifuga. Os produtos de gel dissolvido brevemente a 10.000 RPM por 10 segundos.

Para coletar todas as amostras. Remova um microlitro para usar como molde de DNA para realizar PCR com o reparo primário. 29 61 46 26.

Usando as mesmas condições descritas acima, após a purificação e sequenciamento, a análise pode ser realizada com uma ferramenta online para determinar a localização cromossômica. Uma vez no site de bioinformática do genoma, clique em blatt para gerar uma nova janela e colar a sequência de DNA. Depois de enviar a sequência de DNA, os resultados da pesquisa BLATT aparecerão.

Clique no navegador no hit com 100%identity para revelar a localização da sequência de DNA. A região capaz foi usada como isca para determinar suas interações de DNA de longo alcance. Dois locais BGL dois e um BAM H um local foram escolhidos para o ensaio A CT na segunda rodada do conjunto de primers de PCR, 46 26 29 61 foi usado para amplificar M1 capaz 46,30 29 61 foi usado para capaz M dois e 46, 36 29 61 foi usado para capaz M três.

Um padrão de gel típico revela uma a várias bandas, como é mostrado aqui para a capacidade M1, a capacidade M dois e a capacidade M três aqui. A sequência de DNA do clone M1 é mostrada para demonstrar que cada fragmento de um ensaio de TC A consiste em dois segmentos de DNA combinados. Um segmento é derivado da região do DNA da isca, enquanto o segundo segmento vem do parceiro associado.

Os segmentos são unidos uns aos outros pela primeira sequência de reconhecimento da enzima de restrição. A segunda sequência de reconhecimento enzimático aparecerá no final da sequência do parceiro associado. O fragmento M1 clonado contém DNA da região do ABLE um localizada no cromossomo nove Q 32.4, e o parceiro associado está localizado no cromossomo três P três, que foi identificado como proc dois.

Da mesma forma, o parceiro associado capaz de M dois foi localizado no cromossomo cinco Q 21.1, enquanto o clone capaz de M três foi identificado como uma associação intracromossômica perto do locus ABLE um em contraste com três ensaios C. A metodologia descrita neste vídeo selecionará as interações de longo alcance mais prevalentes. No entanto, ao aumentar o número de ciclos de PCR R, é possível identificar associações adicionais menos frequentes, bem como usando a região de imprinting e controle ou ICR no IGF dois locus H 19 como isca de DNA em células de fibroblastos de camundongo, diferentes programas de ciclagem foram aplicados na primeira e segunda rodadas de PCR no ensaio A CT.

O ensaio A CT também pode ser usado para identificar diferenças na arquitetura nuclear e interações de longo alcance entre células normais e células cancerígenas. O tecido normal do cólon e o tecido do câncer de cólon foram homogeneizados e o ensaio de TC A foi realizado seguindo os procedimentos aqui descritos. Aqui é mostrada a estrutura do DNA da região ICR no IGF dois locus H 19 e no gene IGF dois dpn.

Dois locais para o ensaio A CT são rotulados: os primers usados na segunda rodada de PCR são rotulados por setas e números em cores diferentes. O padrão de gel do ensaio A CT representa os resultados da PCR usando o primer 29 61 com qualquer par de primers 41, 61, 41 63, 51 45 e 51 51. Bandas únicas que aparecem apenas no tecido normal do cólon são rotuladas por setas amarelas, e as bandas que apareceram apenas no tecido do câncer de cólon são rotuladas em setas vermelhas Após seu desenvolvimento.

Essa técnica abre caminho para pesquisadores no campo da biologia de mercado explorarem a arquitetura nuclear e a regulação gênica de maneira tridimensional.