Em função Assay Canine Muscle Vivo

O objetivo geral deste procedimento é medir e caracterizar as propriedades mecânicas dos músculos da pata traseira no cão vivo utilizando métodos não invasivos. Isso é realizado primeiramente posicionando corretamente o cão no equipamento de fisiologia. O segundo passo do procedimento é medir e registrar o torque isométrico do tremor e o torque tibiotársico de flexão titânica.

O terceiro passo do procedimento é realizar contrações excêntricas. O passo final do procedimento é medir e registrar o tremor isométrico, o torque e o torque tétano durante a extensão tibiotarsal. Em última análise, podem ser obtidos resultados que demonstram a força muscular da pata traseira e a resposta a contrações excêntricas repetidas por meio de um método fisiológico não invasivo.

A principal vantagem desta técnica em relação a métodos existentes, como ensaios musculares isolados ex vivo, que são estudos terminais, é que o método utilizado aqui pode ser repetido ao longo do tempo, pois é não invasivo e bem tolerado. Este método pode ajudar a responder perguntas fundamentais na área da fisiologia muscular, como a resposta do músculo a lesões induzidas por contração ou à fadiga. As implicações desta técnica estendem-se para a terapia ou diagnóstico de distrofias musculares, porque o método mensura a função muscular em cães ou outros mamíferos de grande porte.

Animais tão grandes são necessários em estudos pré-clínicos de muitas novas terapias antes dos ensaios clínicos e pacientes. Embora este método possa fornecer informações sobre modelos caninos, ele também pode ser aplicado a outros sistemas de modelos animais, como primatas não humanos. Geralmente, indivíduos novos neste método terão dificuldades devido ao cuidado necessário ao posicionar os eletrodos de estimulação e ao conhecimento do que esperar dos traçados de torque. A demonstração visual deste método é essencial, pois as etapas de posicionamento dos eletrodos são difíceis de aprender devido à precisão exigida para obter a resposta máxima de torque dos músculos.

Em estudo, dois protocolos escritos no software de controle muscular dinâmico ou DMC são utilizados para definir os parâmetros de estimulação e registro de dados. O primeiro protocolo, o protocolo de contração isométrica, é usado tanto para as contrações de contração rápida quanto para as contrações tetânicas. O segundo protocolo, chamado protocolo de lesão por alongamento excêntrico, é usado para as contrações excêntricas. As configurações do estimulador e as sequências de software utilizadas para cada protocolo estão indicadas na tabela mostrada aqui; as contrações de contração rápida são provocadas com estimulação de um hertz.

As contrações titânicas e excêntricas são provocadas com estimulação de 50 hertz. No caso da contração excêntrica, um alongamento é sobreposto ao músculo em contração. Esses experimentos envolvem provocar vários tipos de contrações musculares, estimulando o nervo fibular para obter contrações de titã, ou excêntricas, de um músculo flexor, e estimulando o nervo tibial para provocar contrações de titã ou titânicas de um músculo extensor.

Após anestesiar o cão, verifique o reflexo palpebral para garantir que o animal está profundamente anestesiado. Monitore atentamente o dióxido de carbono, a oximetria de pulso e a temperatura. Durante o procedimento, retire o pêlo na região lateral do joelho, onde os eletrodos estimuladores serão colocados.

Em seguida, posicione o cão sobre a mesa de fisiologia. Coloque a pata pélvica em posição recumbente dorsal de modo que o fêmur e a tíbia formem um ângulo reto, e a tíbia esteja paralela à superfície da mesa. Verifique se o pedal de força pode girar com segurança. Ele deve apresentar rigidez quando movido manualmente.

Em seguida, ligue o equipamento de fisiologia e ative o pedal. O movimento do pedal é controlado pelo motor servo, que por sua vez é controlado pelo computador. Agora, apoie suavemente a pata do cão sobre o medidor do pedal e registre o comprimento da pata do cão, do eixo central de rotação até a extremidade do dedo lateral.

Em seguida, fixe a pata do cão no pedal com uma fita elástica autoadesiva. O transdutor no pedal registra a força das contrações musculares das pernas. Configure os eletrodos de estimulação conectando os eletrodos monopolar revestidos de 24 gauge à unidade de isolamento de estímulo.

Com as mãos enluvadas, limpe a pele do cão com álcool e palpe o nervo fibular comum logo abaixo da fíbula proximal lateral, usando um dedo para marcar a região do nervo. Insira cuidadosamente o eletrodo catódico preto sob a pele e logo externo ao periósteo; posicione o eletrodo anódico vermelho sob a pele paralelamente ao catódico, mas ligeiramente mais distal. Ambos os eletrodos devem agora estar posicionados internamente ao nervo fibular comum, logo abaixo da cabeça da fíbula. Em seguida, ative o estimulador em um hertz e observe a resposta de contração muscular no monitor.

Faça pequenos ajustes nas posições dos eletrodos conforme necessário para obter a maior amplitude possível do espasmo muscular. Uma vez que os eletrodos estejam bem posicionados, ative o software DMC para registrar uma resposta de contração muscular. O próximo passo é provocar uma contração tética sem mover os eletrodos.

Configure o estimulador conforme especificado na tabela para uma contração titânica. Em seguida, ative o protocolo de contração isotônica no software para gerar uma contração titânica isotônica do músculo. O próximo experimento, o protocolo de lesão por alongamento excêntrico, também é realizado sem mover os eletrodos.

Configure o estimulador para uma contração excêntrica e inicie a estimulação. Neste protocolo, o nervo é estimulado 10 vezes a 50 hertz durante um segundo. Durante esse segundo, os músculos flexores contraem-se isometricamente nos primeiros 800 milissegundos e, em seguida, o músculo é alongado nos últimos 200 milissegundos.

Após um conjunto de 10 contrações excêntricas, permita que o músculo descanse por quatro minutos. Em seguida, repita o protocolo de lesão por alongamento excêntrico mais duas vezes, com um intervalo de quatro minutos entre cada conjunto para estimular o músculo extensor. Mova os eletrodos para o nervo tibial inserindo-os perpendicularmente à pele e proximalmente ao posicionamento original dos eletrodos usado para a flexão. O ponto aproximado de colocação está ao longo de uma linha que divide ao meio o ângulo de 90 graus formado pelo joelho.

O nervo tibial está mais profundo e próximo ao nervo peronial comum. Mova os eletrodos conforme necessário para provocar potenciais de contração ideal. Uma vez que os eletrodos estejam posicionados, provoque uma contração máxima utilizando o protocolo isométrico sem mover os eletrodos.

Altere as configurações do estimulador conforme especificado para contrações téticas. Em seguida, ative e registre uma contração tética do músculo extensor tibiotarsal. O programa de análise dinâmica muscular ou DMA é utilizado para analisar o torque e as informações temporais das contrações musculares.

Nesta figura, a estimulação do nervo tibial a um hertz ativou contrações únicas dos músculos extensores tibiotarsianos para análise de dados; as posições dos três cursores são definidas da seguinte forma. O cursor azul é colocado no ponto em que o torque aumenta a partir do torque de repouso. O cursor amarelo é posicionado onde o torque retorna ao torque de repouso.

Após a fase de relaxamento, o cursor branco não é mais necessário e, portanto, é posicionado à direita do cursor amarelo. Esta figura mostra a estimulação isométrica de torque titânico do nervo tibial com uma série de 1,5 segundo de pulsos de 50 hertz, resultando em uma contração tetânica do músculo extensor tibial do tarso. Para análise dos dados, os cursores azul e amarelo são posicionados.

No que diz respeito à análise do tremor nesta figura, contrações excêntricas foram induzidas nos flexores tibiotarsianos. A estimulação percutânea do nervo peroneal ativou uma contração isométrica inicial durante 800 milissegundos, momento em que um alongamento forçado foi imposto à perna. Para esta análise dos dados, o cursor azul é posicionado no ponto em que o torque isométrico começa a aumentar a partir do torque de repouso.

O cursor amarelo é colocado no ponto em que o torque do alongamento excêntrico começa a aumentar a partir da plataforma isométrica. O cursor branco é colocado onde o torque retorna ao torque de repouso. Uma vez dominada, esta técnica pode ser realizada em cerca de uma hora, se for executada corretamente. Ao tentar este procedimento, é importante lembrar-se de seguir um protocolo impresso com pontos de verificação passo a passo seguindo este procedimento.

Outros métodos, como biópsias musculares, podem ser realizados para responder perguntas adicionais, como o tipo de fibra muscular ou a expressão do transgene após seu desenvolvimento. Esta técnica abriu caminho para pesquisadores na área da fisiologia muscular explorarem as respostas ao exercício em cães com distrofia muscular. Após assistir a este vídeo, você deverá ter uma boa compreensão de como realizar um ensaio não invasivo de fisiologia muscular em cães.