Name: Examinando o Dynamics Conformacional de Proteínas de Membrana In situ Com Labeling-Site dirigido Fluorescência (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-05-29T14:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 55 s
Description: Aprenda a examinar a dinâmica conformacional de proteínas de membrana in situ usando marcação fluorescente dirigida a sítios em células individuais. Este método correlaciona alterações de fluorescência com cinética de transporte iônico.

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Não há conflitos de interesse declarados.

A abordagem experimental que descrevemos combina site-specific rotulagem fluoróforo e duas de tensão eletrodo grampo para investigar a relação entre estrutura e função de proteínas da membrana. Esta técnica pode ser usada para obter tempo resolvido informações sobre a dinâmica conformacional de proteínas da membrana durante o transporte de íons. Além disso, esta abordagem pode ser adaptada para trabalhar com várias proteínas, tais como bombas de íons, canais iônicos e transportadores. Além de investigar a dinâmica de conformação de um resíduo específico, também é possível utilizar a transferência de energia de ressonância de fluorescência para determinar restrições de distância dentro de uma holoenzima. A determinação de distâncias entre os resíduos, bem como medir o movimento relativo entre subunidades pode ajudar a resolver questões fundamentais que envolvem mecanismos de propagação.

<table border="1"><tbody><tr><th> Reagente / Equipamentos </th><th> Companhia </th><th> Reagente / Equipamentos </th><th> Companhia </th></tr><tr><td> Fonte de Luz 100W Tungsten </td><td> Carl Zeiss microfilmagem </td><td> fluoresceína-5-maleimida </td><td> Invitrogen </td></tr><tr><td> 1B150F-4 </td><td> Precision Instruments mundo </td><td> Alto-Pure Kit de Extração PCR </td><td> Roche </td></tr><tr><td> 3,0-4,0 Ethicon Vicryl </td><td> Johnson &amp; Johnson </td><td> mMessage mMachine Kit </td><td> Ambion </td></tr><tr><td> 475AF40 filtro de excitação </td><td> Omega Optical </td><td> MS-222 </td><td> Sigma-Aldrich </td></tr><tr><td> 505DRLP dichroic espelho </td><td> Omega Optical </td><td> Nucleospin Kit Plasmid </td><td> Macherey-Nagel </td></tr><tr><td> Macherey-Nagel </td><td> Omega Optical </td><td> Nanodrop 2000c Sprectrophotometer </td><td> Thermo Scientific </td></tr><tr><td> 535DF50 filtro de excitação </td><td> Omega Optical </td><td> PC-10 Micropipeta Puller </td><td> Narishige </td></tr><tr><td> 560DRLP dichroic espelho </td><td> Omega Optical </td><td> pCLAMP 10 Software </td><td> Axon Instruments </td></tr><tr><td> 565ALP filtro de emissão </td><td> Omega Optical </td><td> PfuTurbo DNA polimerase </td><td> Strategene </td></tr><tr><td> 565EFLP filtro de emissão </td><td> Omega Optical </td><td> PIN-022A Photodiode </td><td> United Technologies Detector </td></tr><tr><td> 570DRLP dichroic espelho </td><td> Omega Optical </td><td> Filtros polarizados </td><td> Linos Phtonics Inc. </td></tr><tr><td> Linos Phtonics Inc. </td><td> Omega Optical </td><td> QuickChange Site-Directed Mutagenisis Kit </td><td> Stratagene </td></tr><tr><td> Axio Examiner microscópio de fluorescência </td><td> Carl Zeiss microfilmagem GMBH </td><td> RC-10 Câmara de fluorescência </td><td> Warner Instruments </td></tr><tr><td> Warner Instruments </td><td> Life Technologies </td><td> tetrametilrodamina-6-maleimida </td><td> Invitrogen </td></tr><tr><td> Digidata 1440A sistema de aquisição de dados </td><td> Axon Instruments </td><td> TOP10 Células Electrocompetent </td><td> Invitrogen </td></tr><tr><td> Dpn I </td><td> New England Biolabs </td><td> Turbo amplificador Tec-05X </td><td> npi </td></tr></tbody></table>

examinando o dynamics conformacional de proteínas de membrana in situ com labeling-site dirigido fluorescência

Examining the Conformational Dynamics of Membrane Proteins in situ with Site-directed Fluorescence Labeling

Dois eletrodos de voltagem clamp eletrofisiologia (TEVC) é uma ferramenta poderosa para investigar o mecanismo de ion transportes1 para uma grande variedade de proteínas da membrana incluindo canais iônicos 2, bombas de íons 3, 4 e transportadores. Os desenvolvimentos recentes têm combinado site-specific rotulagem fluoróforo ao lado TEVC, em simultâneo, analisar a dinâmica conformacional em resíduos específicos e função dessas proteínas na superfície de células individuais. Vamos descrever um método para estudar a dinâmica conformacional de proteínas da membrana, simultaneamente, o monitoramento de mudanças de fluorescência e de tensão atual usando clamp-fluorometria. Esta abordagem pode ser usada para examinar o movimento molecular de proteínas da membrana do local especificamente substituição cisteína seguinte e-site dirigido fluoróforo rotulagem 5,6. Além disso, este método fornece uma abordagem para determinar restrições de distância entre os resíduos específicos 7,8. Isto é conseguido através seletivamente anexando fluoróforos doador e receptor de dois resíduos de cisteína mutantes de interesse. Em suma, essas experiências são realizadas conforme expressão funcional da proteína desejada na superfície dos oócitos Xenopus Leavis. A grande área de superfície desses oócitos permite medições fáceis funcional e um sinal robusto fluorescência 5. Também é possível facilmente alterar as condições extracelulares como ligante pH, ou cátions / ânions, que podem fornecer informações adicionais sobre o mecanismo de proteínas da membrana 4. Finalmente, os desenvolvimentos recentes têm também permitiu a manipulação de selecionar íons interna após a co-expressão com uma segunda proteína 9. Nosso protocolo é descrito em várias partes. Primeiro, mutagênese cisteína digitalização passou por rotulagem fluoróforo é concluída em resíduos localizados na interface dos domínios transmembrana e extracelular. Experimentos subseqüentes são projetados para identificar resíduos que demonstram grandes mudanças na intensidade de fluorescência (&lt;5%) 3 em cima de uma mudança conformacional da proteína. Em segundo lugar, estas mudanças na intensidade de fluorescência são comparados com os parâmetros cinéticos da proteína de membrana, a fim de correlacionar a dinâmica conformacional para a função da proteína 10. Isto permite uma análise rigorosa biofísicos do movimento molecular da proteína-alvo. Por último, dois resíduos da holoenzima podem ser rotulados com um dador e receptor fluoróforo a fim de determinar restrições de distância usando métodos photodestruction doador. Também é possível monitorar o movimento relativo das subunidades da proteína seguintes rotulagem com um doador e aceitador fluoróforo.

Vamos descrever um método que mede a cinética de transporte de íons de proteínas da membrana juntamente com site-specific análise das mudanças conformacionais usando fluorescência em células individuais. Esta técnica é adaptável a canais iônicos, transportadores e bombas de íons e pode ser utilizado para determinar restrições de distância entre as subunidades da proteína.

Examinando o Dynamics Conformacional de Proteínas de Membrana In situ Com Labeling-Site dirigido Fluorescência

A eletrofisiologia de clampagem de voltagem de dois eletrodos (TEVC) é uma ferramenta poderosa para investigar o mecanismo de transporte iônico para uma ampla variedade de membranas...

O objetivo geral deste procedimento é examinar a dinâmica conformacional de proteínas de membrana utilizando marcação fluorescente direcionada a sítios na superfície de células individuais. Isso é realizado primeiramente mutando individualmente resíduos na interface dos domínios extracelular e transmembrana para cisteína, conforme indicado pela letra C vermelha. Em seguida, é necessário determinar se esse resíduo pode ser marcado com um fluoróforo reativo à cisteína. O segundo passo do procedimento é verificar se a mutagênese da cisteína e/ou a marcação com o fluoróforo afetam a cinética e/ou o estado conformacional da proteína.Isso é realizado utilizando a configuração mostrada. O terceiro passo do procedimento é comparar e contrastar as alterações na intensidade de fluorescência com os parâmetros cinéticos da proteína-alvo. Um traçado típico de fluorescência é mostrado aqui.O passo final do procedimento é rotular pares de cisteínas mutadas com fluoróforos doadores ou com pares doador-aceptor de Fluor quatro, a fim de medir as taxas de fotodestruição em conjunto com medidas de fixação de voltagem para determinar restrições de distância. Esta figura mostra as taxas de fotodestruição do doador na ausência do aceitador em preto; a fotodestruição do doador na presença do aceitador está em vermelho. Em última análise, podem-se obter resultados que demonstram que alterações na intensidade de fluorescência, resultantes de mudanças conformacionais na proteína, podem ser correlacionadas à função de proteínas de membrana por meio da fluorometria com fixação de voltagem.Este método pode ajudar a responder perguntas fundamentais no campo do transporte iônico pela membrana, como a forma pela qual as alterações no estado conformacional da proteína facilitam o transporte de moléculas pequenas e íons através da membrana plasmática. Inicie o procedimento clonando a bomba sódio-potássio em um vetor apropriado para expressão em oócitos de Xenopus. O próximo passo é introduzir mutações de cisteína em resíduos localizados na interface entre os domínios transmembrana e extracelulares, conforme descrito no artigo complementar.Quando finalizado, verifique a inserção da mutação por meio de sequenciamento de DNA após transcrever o DNA plasmidial para mRNA conforme descrito no artigo complementar e quantifique o rendimento de mRNA utilizando um espectrofotômetro antes da cirurgia. O sapo deve ser mantido em jejum por 12 horas para prevenir vômitos durante a operação. Para iniciar a cirurgia no dia seguinte, imerga o sapo na solução anestésica até que ele deixe de responder a um aperto no dedo do pé.Retire o sapo da solução anestésica e coloque-o com o lado dorsal voltado para baixo sobre a parte absorvente de uma fralda descartável. Coloque uma toalha de papel úmida sobre o sapo para mantê-lo úmido. Além disso, se os olhos do sapo estiverem abertos, mantenha-os úmidos com solução salina.Faça uma pequena incisão smic em um dos lados da linha média do sapo. Localize o ovário e traga-o para o exterior do animal. Evite tocar o ovário na pele.Remova o ovário e coloque-o em uma placa de Petri contendo solução de ringer. Verifique o tecido remanescente quanto a sangramento antes de reposicioná-lo dentro da cavidade smic. Se ocorrer sangramento, aplique pressão com um cotonete estéril até que cesse.Finalize a cirurgia suturando a incisão usando um padrão de sutura interrompida. Devolva o sapo ao seu alojamento para se recuperar da anestesia usando tesoura. Divida o lobo ovariano isolado em partes menores.Transfira os agregados para solução de Ringer com cálcio contendo colagenase. Em seguida, agite suavemente a solução de digestão por duas horas a 18 graus Celsius. Quando a maioria dos citos estiver separada, lave os ovócitos com solução de Ringer sem cálcio.Em seguida, incubar os ócitos por 10 minutos em solução de ringer sem cálcio à temperatura ambiente. Neste momento, lavar os ócitos exaustivamente em solução de ringer com cálcio. Em seguida, transferir os ócitos para solução de ringer com cálcio para armazenamento antes da injeção.Para a próxima etapa, retire o mRNA sintetizado do congelador a menos 20 graus Celsius. Adicione 25 nanogramas do mRNA a um volume final de 50 nanolitros. Em seguida, injete o mRNA nos citoplasmas após a injeção.Coloque os ovócitos em solução de Ringer com gentamicina a um miligrama por mililitro e incube-os a 18 graus Celsius, no escuro, por três a sete dias. Isso permite que a bomba de sódio-potássio seja expressa na membrana plasmática do ovócito. No dia do experimento, retire os ovócitos do incubador e coloque-os no tampão de carregamento por 45 minutos, seguidos pelo tampão pós-carregamento por mais 45 minutos.Isso aumenta a concentração intracelular de sódio para facilitar a medição da bomba sódio-potássio. Para medições de fluorescência, incubar os citos em um tampão pós-marcação que contenha cinco micromolares do fluoróforo desejado, como TMRM ou FM, por cinco a 10 minutos no escuro. Após a marcação com flora quatro, lavar os ovócitos exaustivamente com tampão pós-marcação livre de corante.Mantenha os oócitos no escuro para evitar o desbotamento fotossensível. Para se preparar para as medidas com o clamp de tensão por dois eletrodos, comece enchendo os microeletrodos com cloreto de potássio 3 molar e testando a resistência. A resistência deve estar entre 0,5 e 1,5 megaohms.Para experimentos de varredura por cisteína, equipe o microscópio de fluorescência com um filtro de excitação 5 35 DF 50, um filtro de emissão 5 65 EFLP e um espelho dicromático five 70 DRLP. Em seguida, coloque o octo em uma câmara RC 10 sobre a platina do microscópio de fluorescência. Então, insira suavemente ambos os microeletrodos no octo utilizando o amplificador para manter o potencial da membrana em um valor constante.Meça o fluxo iônico através da membrana ativando a proteína usando uma técnica apropriada, como troca de solução ou alteração do potencial da membrana. Para medições simultâneas de fluorescência, use uma fonte de luz de tungstênio de 100 watts para excitar o fluoróforo doador e para fixar 0 2 2, A foto DDE para detectar alterações na intensidade de fluorescência para marcação fluorescente. Após varredura por cisteína.Meça a alteração na intensidade fluorescente em corrente estacionária utilizando degraus de tensão controlados pelo software P clamp 10. Uma segunda parte do protocolo envolve realizar medidas de atropia juntamente com medidas de distância. Para calcular a faixa de valores de kappa quadrado, uma medida de atropia avalia a mobilidade relativa do fluoro quatro devido à rotação.Consulte o artigo acompanhante para obter detalhes sobre os cálculos. Para medir as restrições de distância, utilize uma enzima holo, que possui dois resíduos de cisteína extracelulares acessíveis que podem ser marcados com fluoróforos. Adicione tampão pós-carregamento contendo um micromolar de FM e quatro micromolares de TMRM.Isso é o doador e o aceitador. Adicione quatro fluoro a um lote de ovócitos, adicionando apenas um micromolar de FM. Isso é somente o fluoro doador.Quatro para outro lote de ovócitos, incubar ambos os lotes de ovócitos em gelo por 30 minutos no escuro. Isso permite que sejam realizadas medições de enzimas oco marcadas com e sem um fluoroaceitador quatro. Em seguida, equipar o microscópio com um filtro de excitação 4 75 DF 40, um filtro de emissão 5 30 DF 30 e um espelho dicromático 5 0 5 DRLP.Em seguida, coloque o oócito na câmara sobre a platina do microscópio de fluorescência. Mantendo um fluxo contínuo da solução, meça a dependência temporal do branqueamento do doador na presença e na ausência do aceptor flora. Quatro. Esses resultados podem ser utilizados para calcular a distância entre os dois resíduos na bomba sódio-potássio utilizando o método de Förster.As medições de clampeamento de tensão com dois eletrodos devem ser realizadas simultaneamente para garantir que a proteína seja funcional. Utilizando o recurso X de clampeamento no P clamp 10, calcule a média dos resultados da foto destruição do fluoróforo doador quatro por pelo menos quatro gravações em sítios ô. Para medir o movimento relativo das subunidades proteicas, utilize construtos de cisteína dupla que contenham fluoróforos doador e aceitador quatro.A intensidade de fluorescência nesses resíduos é insensível ao estado conformacional da proteína e será uma função da distância entre os dois grupos. Em seguida, troque o conjunto de filtros no microscópio por um filtro de excitação 4 75 a F 40, um filtro de emissão 5 95 a F 60 e um espelho dicróico 5 0 5 DRLP. Então, coloque o OI na câmara sobre a platina do microscópio de fluorescência.Em seguida, o doador é excitado com uma fonte de luz de tungstênio de 100 watts e a intensidade de fluorescência do aceptor. O fluoro quatro é medido utilizando um método apropriado, como ligante de voltagem ou troca de solução, ativando a proteína de membrana e medindo simultaneamente a alteração na intensidade de fluorescência. Esta figura mostra a correlação entre o transporte de íons através da membrana celular e as alterações na intensidade de fluorescência.O traço superior mostra medições de fixação de corrente na presença de solução-teste de sódio e solução-teste de potássio na presença de ing a 10 micromolar e 10 milimolar. O traço inferior mostra as alterações na intensidade de fluorescência medidas em paralelo com as medições de fixação de corrente. Esta figura mostra dois ovócitos marcados com TMRM, o fluoróforo aceptor.O oócito à esquerda expressa a ATPase sódio-potássio do tipo selvagem, enquanto o oócito à direita expressa ATPases sódio-potássio com um resíduo de cisteína acessível. Os traços superiores desta figura mostram dados de corrente transitória durante um pulso de tensão. Os traços inferiores mostram gravações em tempo real das alterações na intensidade da fluorescência durante um pulso de tensão.Esta figura mostra a dependência temporal do fotobranqueamento: a destruição fotônica do doador é medida na ausência e na presença do fluoro aceptor quatro; o fotobranqueamento ocorre mais rapidamente na ausência de um fluoro aceptor quatro. Cada traço representa a média de quatro gravações no local. Esta figura mostra o movimento relativo das subunidades durante mudanças conformacionais.As alterações na fluorescência são mostradas nos traços vermelhos e o fluxo de corrente é mostrado nos traços pretos. Um aumento na intensidade da fluorescência mostrado à esquerda indica que os pisos da flora estão se aproximando. Nenhuma alteração na intensidade da fluorescência mostrada no centro indica que a distância entre os Fluor quatro permanece estática.Uma diminuição na intensidade da fluorescência mostrada à direita indica que os Fluor fours se afastam durante a realização deste procedimento. É importante lembrar de correlacionar as alterações na intensidade da fluorescência em estado cinético e em estado estacionário às mudanças conformacionais na proteína.

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Biologia

Este artigo detalha o procedimento de vídeo experimental para a obtenção da energia livre de Gibbs da dobradura de proteína de membrana por fluorescência de triptofano.

Termodinâmica de enovelamento de proteínas de membrana Medido por espectroscopia de fluorescência

Descrevem-se os métodos de imagiologia que usamos para investigar a distribuição e a mobilidade das proteínas fluorescentes transfectadas residentes no retículo endoplasmático (ER), por meio da imagem confocal de células vivas. Também analisamos ultraestruturalmente o efeito de sua expressão na arquitetura deste compartimento subcelular.

Visualização do retículo endoplasmático Subdomains em células cultivadas

A distribuição espacial e a dinâmica temporal das proteínas e lipídios da membrana plasmática são um tema quente na biologia. Aqui, esse problema é abordado por uma análise de flutuação de imagem espaço-temporal que fornece conceitualmente as mesmas quantidades físicas de rastreamento de partícula única, mas usa pequenos rótulos moleculares e configurações de microscopia padrão.

De fast imagens de fluorescência com a Lei difusão molecular em membranas de células vivas em um microscópio comercial

Aqui, apresentamos um protocolo para determinar a orientação e topologia de proteínas integrais de membrana em células vivas. Este protocolo simples baseia-se na sensibilidade seletiva da protease das quimeras entre a proteína de interesse e a GFP.

Determinando Membrane Topology Protein Usando Fluorescência Protease Protection (FPP)

Muitas proteínas desempenham sua função quando ligadas às superfícies da membrana. A ligação de proteínas extrínsecas nas membranas dos nanodiscos pode ser indiretamente visualizada por microscopia eletrônica de transmissão. Mostramos que o empilhamento característico (rouleau) de nanodiscos induzido pela coloração negativa fosfotungstato de sódio é impedido pela ligação de proteínas extrínsecas.

Método para visualizar e analisar membrana proteínas que interagem por Microscopia Eletrônica de Transmissão

Este protocolo apresenta um método para medir a ligação de adenina nucleotídica a receptores em tempo real em ambiente celular. A ligação é medida como transferência de energia de ressonância de Förster (FRET) entre derivados de nucleotídeos trinitrofenila e proteínas marcadas com um aminoácido fluorescente não canônico.

Medindo a ligação de nucleotídeos a proteínas de membrana intactas e funcionais em tempo real

Este estudo apresenta um procedimento detalhado para realizar experimentos de transferência de energia de ressonância de fluorescência de molécula única (smFRET) em receptores acoplados à proteína G (GPCRs) usando marcação site-specific via incorporação de aminoácidos não naturais (UAA). O protocolo fornece um guia passo a passo para a preparação de amostras smFET, experimentos e análise de dados.

Visualizando a dinâmica conformacional de receptores de membrana usando FRET de molécula única

Este protocolo descreve como usar a microscopia TIRF para rastrear canais iônicos individuais e determinar sua atividade em membranas lipídicas suportadas, definindo assim a interação entre o movimento da membrana lateral e a função do canal. Ele descreve como preparar as membranas, registrar os dados e analisar os resultados.

Imagem de molécula única da mobilidade lateral e atividade do canal iônico em bicamadas lipídicas usando microscopia de fluorescência por reflexão interna total (TIRF)

Aqui, apresentamos o protocolo para estudar a flexibilidade local e a dinâmica de biomoléculas usando anisotropia de fluorescência resolvida no tempo no nível de molécula única no modo de microscopia confocal.

Anisotropia de fluorescência resolvida no tempo de moléculas únicas para caracterizar a flexibilidade local em biomoléculas

Este artigo fornece uma descrição detalhada de como criar amostras para rastreamento de proteína única em bicamadas lipídicas suportadas por sólidos. Também explica um microscópio de fluorescência simples, com sensibilidade a molécula única e taxa de quadros rápida. Por fim, descrevemos o procedimento para extrair trajetórias de proteína única.

Rastreamento de proteínas individuais em bicamadas lipídicas usando microscopia de fluorescência

Aprenda a examinar a dinâmica conformacional de proteínas de membrana in situ usando marcação fluorescente dirigida a sítios em células individuais. Este método correlaciona alterações de fluorescência com cinética de transporte iônico.

Examinando o Dynamics Conformacional de Proteínas de Membrana In situ Com Labeling-Site dirigido Fluorescência

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