Examinando o Dynamics Conformacional de Proteínas de Membrana In situ Com Labeling-Site dirigido Fluorescência

Vamos descrever um método que mede a cinética de transporte de íons de proteínas da membrana juntamente com site-specific análise das mudanças conformacionais usando fluorescência em células individuais. Esta técnica é adaptável a canais iônicos, transportadores e bombas de íons e pode ser utilizado para determinar restrições de distância entre as subunidades da proteína.

O objetivo geral deste procedimento é examinar a dinâmica de confirmação de proteínas de membrana utilizando marcação de fluorescência dirigida ao local na superfície de células individuais. Isso é feito primeiro mutando resíduos individualmente na interface dos domínios extracelular e transmembrana para cistina, conforme mostrado pelo vermelho, C.It é então necessário para determinar se esse resíduo pode ser marcado com uma cistina reagindo com fluoro quatro. A segunda etapa do procedimento é examinar se a marcação de cistina, mutagênese e/ou fluoro quatro afeta a cinética e/ou o estado de confirmação da proteína.

Isso é feito usando a configuração mostrada. A terceira etapa do procedimento é comparar e contrastar as mudanças na intensidade de fluorescência com os parâmetros cinéticos da proteína alvo. Um traço de fluorescência típico é mostrado aqui.

A etapa final do procedimento é rotular pares de cisteína mutada com quatro de flúor do doador ou quatro de flúor aceitador do doador para medir as taxas de fotodestruição em conjunto com as medições de grampo de tensão para determinar as restrições de distância. Esta figura mostra as taxas de destruição da foto do doador na ausência do aceitador em preto a destruição da foto do doador na presença do aceitador está em vermelho. Em última análise, podem ser obtidos resultados que mostram que as mudanças na intensidade da fluorescência, que são o resultado de mudanças na confirmação da proteína, podem ser correlacionadas à função da proteína da membrana por meio da fluorometria da grampo de voltagem.

Este método pode ajudar a responder a questões-chave no campo do transporte de íons de membrana, como como as mudanças no estado de confirmação da proteína facilitam o transporte de pequenas moléculas e íons através da membrana plasmática. Comece o procedimento clonando a bomba de sódio e potássio em um vetor adequado para postes xop, expressão de oócitos Lavis. O próximo passo é fazer mutações de cisteína em resíduos localizados na interface entre os domínios transmembrana e extracelular, conforme descrito no artigo anexo.

Quando terminar, verifique a inserção da mutação por sequenciamento de DNA após transcrever o DNA plasmático para mRNA conforme descrito no artigo anexo, quantifique o rendimento de mRNA usando um espectrofotômetro antes da cirurgia. O sapo deve ser jejuado por 12 horas para evitar vômitos durante a operação. Para iniciar a cirurgia no dia seguinte, mergulhe o sapo na solução anestésica até que o sapo pare de responder a um beliscão no dedo do pé.

Remova o sapo da solução anestésica e coloque-o com o lado dorsal voltado para baixo no lado absorvente de uma almofada de fralda. Coloque uma toalha de papel molhada no sapo para mantê-lo úmido. Além disso, se os olhos do sapo estiverem abertos, mantenha-os úmidos com solução salina.

Faça uma pequena incisão sísmica em um lado da linha média do sapo. Localize o ovário e traga-o para o exterior do sapo. Evite tocar o ovário na pele.

Remova o ovário e coloque-o em uma placa de Petri contendo solução de ringer. Verifique se há sangramento no tecido restante antes de colocá-lo de volta dentro da cavidade sísmica. Se ocorrer sangramento, aplique pressão com um cotonete estéril até que pare.

Termine a cirurgia suturando a incisão usando um padrão de sutura interrompido. Retorne o sapo ao seu alojamento para se recuperar da anestesia usando uma tesoura. Divida o lobo ovariano isolado em partes menores.

Transfira os aglomerados para solução de ringer mais cálcio com colagenase. Em seguida, agite suavemente a solução de digestão por duas horas a 18 graus Celsius. Quando a maioria dos citos estiver separada, lave os oócitos com solução de ringer menos cálcio.

Em seguida, incube os oócitos por 10 minutos em solução de ringer menos cálcio à temperatura ambiente. Neste ponto, lave os citos exaustivamente em anéis mais solução de cálcio. Em seguida, transfira os oócitos para solução de ringer mais cálcio para armazenamento antes da injeção.

Para a próxima etapa, recupere o mRNA sintetizado do freezer de 20 graus Celsius negativos. Adicionar 25 nanogramas de mRNA a um volume final de 50 nanolitros. Em seguida, injete o mRNA nos citos após a injeção.

Coloque os oócitos em solução de ringer e um miligrama por mililitro de gentamicina e incube-os a 18 graus Celsius no escuro por três a sete dias. Isso permite que a bomba de sódio e potássio seja expressa dentro da membrana plasmática do oócito. No dia do experimento, retire os oócitos da incubadora e coloque-os em tampão de carregamento por 45 minutos e depois em tampão pós-carregamento por 45 minutos.

Isso aumenta a concentração intracelular de sódio para facilitar a medição da bomba de sódio e potássio. Para medições de fluorescência, incube os citos em um tampão pós-carregamento que contenha cinco micromolares do fluoróforo desejado, como TMRM ou FM por cinco a 10 minutos no escuro. Após a marcação da flora quatro, lave os oócitos exaustivamente com tampão pós-corante sem corantes.

Mantenha os oócitos no escuro para evitar o fotobranqueamento. Para se preparar para as medições de grampo de tensão de dois eletrodos, comece enchendo os microeletrodos com cloreto de potássio de três molares e testando a resistência. A resistência deve estar entre 0,5 e 1,5 mega ohms.

Para experimentos de varredura de cisteína, equipe o microscópio de fluorescência com um filtro de excitação 5 35 DF 50, um filtro de emissão 5 65 EFLP e um espelho diic de cinco 70 DRLP. Em seguida, coloque o octe em uma câmara RC 10 no microscópio fluorescente stage. Em seguida, insira suavemente os dois microeletrodos na octe usando o amplificador para manter o potencial de membrana em um valor constante.

Meça o fluxo de íons através da membrana ativando a proteína usando uma técnica apropriada, como troca de solução ou alteração do potencial de membrana. Para medições simultâneas de fluorescência, use uma fonte de luz de tungstênio de 100 watts para excitar o fluoróforo do doador e para fixar 0 2 2, uma foto DDE para detectar mudanças na intensidade da fluorescência para rotulagem fluorescente. Após a varredura de cisteína.

Meça a mudança na intensidade fluorescente em corrente estacionária usando etapas de tensão controladas pelo software P clamp 10. Uma segunda parte do protocolo envolve a realização de medições de atropia anes juntamente com medições de distância. Para calcular a faixa de valores de kappa ao quadrado, uma atropia mede a mobilidade relativa do fluoro quatro devido à rotação.

Consulte o artigo anexo para obter detalhes sobre os cálculos. Para medir as restrições de distância, use uma enzima holo, que possui dois resíduos de cisteína extracelular acessíveis que podem ser marcados com fluoro fours. Adicione tampão pós-carregamento contendo um FM micromolar e quatro TMRM micromolar.

Esse é o doador e o aceitador. Fluoro fours para um lote de oócitos adiciona apenas um FM micromolar. Isso é apenas o flúor do doador.

Quatro a outro lote de oócitos incubam os dois lotes de oócitos no gelo por 30 minutos no escuro. Isso permite que as medições sejam feitas de enzimas hollo marcadas com e sem um aceptor de fluoro quatro. Em seguida, equipe o microscópio com um filtro de excitação 4 75 DF 40, um filtro de emissão de cinco 30 DF 30 e um espelho dicróico 5 0 5 DRLP.

Em seguida, coloque o oócito na câmara no estágio do microscópio de fluorescência. Mantendo um fluxo contínuo de solução, medir a dependência temporal do branqueamento do doador na presença e ausência da flora aceptora. Quatro. Esses resultados podem ser usados para calcular a distância entre os dois resíduos na bomba de sódio e potássio utilizando a de silvicultor.

As medições de grampo de tensão do eletrodo da equação dois devem ser feitas simultaneamente para garantir que a proteína esteja funcional. Usando o recurso de grampo X no grampo P 10 calcula a média dos resultados da fotodestruição do doador fluoro quatro para um mínimo de quatro gravações no local oh. Para medir o movimento relativo das subunidades proteicas, use construções de cisteína dupla que contêm aceptor e doador de fluoro fours.

A intensidade de fluorescência nesses resíduos é insensível ao estado de confirmação da proteína e será uma função da distância entre os dois quatros. Em seguida, troque o conjunto de filtros no microscópio para um filtro de excitação 4 75 a F 40, um filtro de emissão 5 95 a F 60 e um espelho dicróico 5 0 5 DRLP. Em seguida, coloque o OI na câmara no estágio do microscópio de fluorescência.

Em seguida, o doador é excitado com uma fonte de luz de tungstênio de 100 watts e a intensidade de fluorescência do aceitador. O fluoro quatro é medido usando um método apropriado, como ligante de voltagem ou troca de solução, ativa a proteína da membrana e mede simultaneamente a mudança na intensidade da fluorescência. Esta figura mostra a correlação do transporte de íons através da membrana celular e as mudanças na intensidade da fluorescência.

O traço superior mostra as medições da pinça de corrente na presença da solução de teste de sódio e da solução de teste de potássio na presença de 10 micromolares e 10 milimolares. O traço inferior mostra mudanças na intensidade de fluorescência medidas em conjunto com as medições de pinça de corrente. Esta figura mostra dois oócitos marcados com TMRM, o aceptor fluoro quatro.

O oócito à esquerda expressa atpa de sódio e potássio do tipo selvagem, enquanto o oócito à direita expressa APAs de sódio e potássio com um resíduo de cisteína acessível. Os traços superiores desta figura mostram dados de corrente transitória no pulso de tensão. Os traços inferiores mostram registros em tempo real das mudanças de intensidade de fluorescência no pulso de tensão.

Esta figura mostra que a dependência do tempo da fotodestruição da foto do doador de fotobranqueamento é medida na ausência e presença de flúor aceptor quatro o branqueamento da foto ocorre mais rapidamente sem um flúor aceptor quatro. Cada traço é a média de quatro gravações do local. Esta figura mostra o movimento relativo da subunidade após as alterações de confirmação.

As mudanças de fluorescência são mostradas nos traços vermelhos e o fluxo de corrente é mostrado nos traços pretos. Um aumento na intensidade de fluorescência mostrado à esquerda indica que os pisos da flora se aproximam. Nenhuma mudança na intensidade de fluorescência mostrada no meio indica que a distância Fluor quatro permanece estática.

Uma diminuição na intensidade de fluorescência mostrada à direita indica que os quatro de flúor se afastam ao tentar este procedimento. É importante lembrar de correlacionar as mudanças na intensidade da fluorescência cinética e do estado estacionário com as mudanças de confirmação na proteína.