Examinando o Dynamics Conformacional de Proteínas de Membrana In situ Com Labeling-Site dirigido Fluorescência

O objetivo geral deste procedimento é examinar a dinâmica conformacional de proteínas de membrana utilizando marcação fluorescente direcionada a sítios na superfície de células individuais. Isso é realizado primeiramente mutando individualmente resíduos na interface dos domínios extracelular e transmembrana para cisteína, conforme indicado pela letra C vermelha. Em seguida, é necessário determinar se esse resíduo pode ser marcado com um fluoróforo reativo à cisteína. O segundo passo do procedimento é verificar se a mutagênese da cisteína e/ou a marcação com o fluoróforo afetam a cinética e/ou o estado conformacional da proteína.

Isso é realizado utilizando a configuração mostrada. O terceiro passo do procedimento é comparar e contrastar as alterações na intensidade de fluorescência com os parâmetros cinéticos da proteína-alvo. Um traçado típico de fluorescência é mostrado aqui.

O passo final do procedimento é rotular pares de cisteínas mutadas com fluoróforos doadores ou com pares doador-aceptor de Fluor quatro, a fim de medir as taxas de fotodestruição em conjunto com medidas de fixação de voltagem para determinar restrições de distância. Esta figura mostra as taxas de fotodestruição do doador na ausência do aceitador em preto; a fotodestruição do doador na presença do aceitador está em vermelho. Em última análise, podem-se obter resultados que demonstram que alterações na intensidade de fluorescência, resultantes de mudanças conformacionais na proteína, podem ser correlacionadas à função de proteínas de membrana por meio da fluorometria com fixação de voltagem.

Este método pode ajudar a responder perguntas fundamentais no campo do transporte iônico pela membrana, como a forma pela qual as alterações no estado conformacional da proteína facilitam o transporte de moléculas pequenas e íons através da membrana plasmática. Inicie o procedimento clonando a bomba sódio-potássio em um vetor apropriado para expressão em oócitos de Xenopus. O próximo passo é introduzir mutações de cisteína em resíduos localizados na interface entre os domínios transmembrana e extracelulares, conforme descrito no artigo complementar.

Quando finalizado, verifique a inserção da mutação por meio de sequenciamento de DNA após transcrever o DNA plasmidial para mRNA conforme descrito no artigo complementar e quantifique o rendimento de mRNA utilizando um espectrofotômetro antes da cirurgia. O sapo deve ser mantido em jejum por 12 horas para prevenir vômitos durante a operação. Para iniciar a cirurgia no dia seguinte, imerga o sapo na solução anestésica até que ele deixe de responder a um aperto no dedo do pé.

Retire o sapo da solução anestésica e coloque-o com o lado dorsal voltado para baixo sobre a parte absorvente de uma fralda descartável. Coloque uma toalha de papel úmida sobre o sapo para mantê-lo úmido. Além disso, se os olhos do sapo estiverem abertos, mantenha-os úmidos com solução salina.

Faça uma pequena incisão smic em um dos lados da linha média do sapo. Localize o ovário e traga-o para o exterior do animal. Evite tocar o ovário na pele.

Remova o ovário e coloque-o em uma placa de Petri contendo solução de ringer. Verifique o tecido remanescente quanto a sangramento antes de reposicioná-lo dentro da cavidade smic. Se ocorrer sangramento, aplique pressão com um cotonete estéril até que cesse.

Finalize a cirurgia suturando a incisão usando um padrão de sutura interrompida. Devolva o sapo ao seu alojamento para se recuperar da anestesia usando tesoura. Divida o lobo ovariano isolado em partes menores.

Transfira os agregados para solução de Ringer com cálcio contendo colagenase. Em seguida, agite suavemente a solução de digestão por duas horas a 18 graus Celsius. Quando a maioria dos citos estiver separada, lave os ovócitos com solução de Ringer sem cálcio.

Em seguida, incubar os ócitos por 10 minutos em solução de ringer sem cálcio à temperatura ambiente. Neste momento, lavar os ócitos exaustivamente em solução de ringer com cálcio. Em seguida, transferir os ócitos para solução de ringer com cálcio para armazenamento antes da injeção.

Para a próxima etapa, retire o mRNA sintetizado do congelador a menos 20 graus Celsius. Adicione 25 nanogramas do mRNA a um volume final de 50 nanolitros. Em seguida, injete o mRNA nos citoplasmas após a injeção.

Coloque os ovócitos em solução de Ringer com gentamicina a um miligrama por mililitro e incube-os a 18 graus Celsius, no escuro, por três a sete dias. Isso permite que a bomba de sódio-potássio seja expressa na membrana plasmática do ovócito. No dia do experimento, retire os ovócitos do incubador e coloque-os no tampão de carregamento por 45 minutos, seguidos pelo tampão pós-carregamento por mais 45 minutos.

Isso aumenta a concentração intracelular de sódio para facilitar a medição da bomba sódio-potássio. Para medições de fluorescência, incubar os citos em um tampão pós-marcação que contenha cinco micromolares do fluoróforo desejado, como TMRM ou FM, por cinco a 10 minutos no escuro. Após a marcação com flora quatro, lavar os ovócitos exaustivamente com tampão pós-marcação livre de corante.

Mantenha os oócitos no escuro para evitar o desbotamento fotossensível. Para se preparar para as medidas com o clamp de tensão por dois eletrodos, comece enchendo os microeletrodos com cloreto de potássio 3 molar e testando a resistência. A resistência deve estar entre 0,5 e 1,5 megaohms.

Para experimentos de varredura por cisteína, equipe o microscópio de fluorescência com um filtro de excitação 5 35 DF 50, um filtro de emissão 5 65 EFLP e um espelho dicromático five 70 DRLP. Em seguida, coloque o octo em uma câmara RC 10 sobre a platina do microscópio de fluorescência. Então, insira suavemente ambos os microeletrodos no octo utilizando o amplificador para manter o potencial da membrana em um valor constante.

Meça o fluxo iônico através da membrana ativando a proteína usando uma técnica apropriada, como troca de solução ou alteração do potencial da membrana. Para medições simultâneas de fluorescência, use uma fonte de luz de tungstênio de 100 watts para excitar o fluoróforo doador e para fixar 0 2 2, A foto DDE para detectar alterações na intensidade de fluorescência para marcação fluorescente. Após varredura por cisteína.

Meça a alteração na intensidade fluorescente em corrente estacionária utilizando degraus de tensão controlados pelo software P clamp 10. Uma segunda parte do protocolo envolve realizar medidas de atropia juntamente com medidas de distância. Para calcular a faixa de valores de kappa quadrado, uma medida de atropia avalia a mobilidade relativa do fluoro quatro devido à rotação.

Consulte o artigo acompanhante para obter detalhes sobre os cálculos. Para medir as restrições de distância, utilize uma enzima holo, que possui dois resíduos de cisteína extracelulares acessíveis que podem ser marcados com fluoróforos. Adicione tampão pós-carregamento contendo um micromolar de FM e quatro micromolares de TMRM.

Isso é o doador e o aceitador. Adicione quatro fluoro a um lote de ovócitos, adicionando apenas um micromolar de FM. Isso é somente o fluoro doador.

Quatro para outro lote de ovócitos, incubar ambos os lotes de ovócitos em gelo por 30 minutos no escuro. Isso permite que sejam realizadas medições de enzimas oco marcadas com e sem um fluoroaceitador quatro. Em seguida, equipar o microscópio com um filtro de excitação 4 75 DF 40, um filtro de emissão 5 30 DF 30 e um espelho dicromático 5 0 5 DRLP.

Em seguida, coloque o oócito na câmara sobre a platina do microscópio de fluorescência. Mantendo um fluxo contínuo da solução, meça a dependência temporal do branqueamento do doador na presença e na ausência do aceptor flora. Quatro. Esses resultados podem ser utilizados para calcular a distância entre os dois resíduos na bomba sódio-potássio utilizando o método de Förster.

As medições de clampeamento de tensão com dois eletrodos devem ser realizadas simultaneamente para garantir que a proteína seja funcional. Utilizando o recurso X de clampeamento no P clamp 10, calcule a média dos resultados da foto destruição do fluoróforo doador quatro por pelo menos quatro gravações em sítios ô. Para medir o movimento relativo das subunidades proteicas, utilize construtos de cisteína dupla que contenham fluoróforos doador e aceitador quatro.

A intensidade de fluorescência nesses resíduos é insensível ao estado conformacional da proteína e será uma função da distância entre os dois grupos. Em seguida, troque o conjunto de filtros no microscópio por um filtro de excitação 4 75 a F 40, um filtro de emissão 5 95 a F 60 e um espelho dicróico 5 0 5 DRLP. Então, coloque o OI na câmara sobre a platina do microscópio de fluorescência.

Em seguida, o doador é excitado com uma fonte de luz de tungstênio de 100 watts e a intensidade de fluorescência do aceptor. O fluoro quatro é medido utilizando um método apropriado, como ligante de voltagem ou troca de solução, ativando a proteína de membrana e medindo simultaneamente a alteração na intensidade de fluorescência. Esta figura mostra a correlação entre o transporte de íons através da membrana celular e as alterações na intensidade de fluorescência.

O traço superior mostra medições de fixação de corrente na presença de solução-teste de sódio e solução-teste de potássio na presença de ing a 10 micromolar e 10 milimolar. O traço inferior mostra as alterações na intensidade de fluorescência medidas em paralelo com as medições de fixação de corrente. Esta figura mostra dois ovócitos marcados com TMRM, o fluoróforo aceptor.

O oócito à esquerda expressa a ATPase sódio-potássio do tipo selvagem, enquanto o oócito à direita expressa ATPases sódio-potássio com um resíduo de cisteína acessível. Os traços superiores desta figura mostram dados de corrente transitória durante um pulso de tensão. Os traços inferiores mostram gravações em tempo real das alterações na intensidade da fluorescência durante um pulso de tensão.

Esta figura mostra a dependência temporal do fotobranqueamento: a destruição fotônica do doador é medida na ausência e na presença do fluoro aceptor quatro; o fotobranqueamento ocorre mais rapidamente na ausência de um fluoro aceptor quatro. Cada traço representa a média de quatro gravações no local. Esta figura mostra o movimento relativo das subunidades durante mudanças conformacionais.

As alterações na fluorescência são mostradas nos traços vermelhos e o fluxo de corrente é mostrado nos traços pretos. Um aumento na intensidade da fluorescência mostrado à esquerda indica que os pisos da flora estão se aproximando. Nenhuma alteração na intensidade da fluorescência mostrada no centro indica que a distância entre os Fluor quatro permanece estática.

Uma diminuição na intensidade da fluorescência mostrada à direita indica que os Fluor fours se afastam durante a realização deste procedimento. É importante lembrar de correlacionar as alterações na intensidade da fluorescência em estado cinético e em estado estacionário às mudanças conformacionais na proteína.