Name: Estudando a base neural do Comportamento Locomotor Adaptive em Insetos (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-04-13T11:03:00.000+00:00
Duration: 10 min 19 s
Description: Aprenda a registrar atividade motora em insetos fixados para estudar o controle neural do comportamento locomotor adaptativo. Este método utiliza eletrodos EMG e superfície escorregadia para analisar a fisiologia muscular em Carausius morosus.

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Agradecemos a Michael Dübbert, Oliver Hoffmann, Hans Scharstein, Jan Sydow e Anne Wosnitza de assistência técnica excelente. Este estudo foi apoiado pelo DFG conceder Bu 857 / 8,10 a AB

1. A superfície de caminhada A superfície de caminhada preto é composto de duas placas de latão revestido de níquel permanentemente unidos, lado a lado e eletricamente isolados entre si por uma tira de dois milímetros de largura de 2 componentes cola epóxi (UHU plus, UHU GmbH, Alemanha), diretamente abaixo do eixo longitudinal do o animal. Eles produzem uma superfície total de 13.5x15.5cm (Figura 1). A separação dos planos metade para as pernas esquerda e direita permite a monitoração de contato tarsal independente para uma única perna em cada lado. <ol><li> A placa é lubrificada com uma mistura de glicerina / água na proporção de 95 partes de glicerina a 5 partes saturada de NaCl solução para transmitir escorregadio e condutividade elétrica; a viscosidade é de aproximadamente 430cStokes (Shankar e Kumar, 1994). </li><li> A mistura é aplicada diretamente sobre a superfície e se dispersa com um pedaço de tecido mole para assegurar uma espessura total de 0,1 0,2 milímetros. </li></ol> 2. Setup Estimulação óptica <ol><li> Episódios andar são extraídas usando dois projetores, como descrito por Scharstein (1989) para projetar um padrão listrado em dois redondos, telas de vidro moído (diâmetro 130mm, telas Marata, Linos Photonics, Göttingen, Alemanha), que estão posicionados a uma distância de aprox. 70 milímetros dos olhos, e em um ângulo de 45 ° na parte frontal esquerda e à direita do prato (Fig.1). O comprimento de onda do padrão listrado é mantida constante em λ = 21 °. A freqüência de contraste de estímulos em movimento pode ser variado entre 0,35, 0,72, 1,07 e 1.49Hz. Desde a reação dos animais depende apenas da freqüência ω contraste / λ (ω = velocidade angular, λ = comprimento de onda padrão) se o contraste padrão é alto o suficiente (Fermi e Reichhardt, 1963), não variam ao longo do λ experimentos . A luminosidade da faixas brilhantes do lado do animal é de aproximadamente 15cd/m2 eo contraste 0,8. O olho composto do inseto stick (Carausius morosus) tem 24 omatídeos no eixo dorso-ventral (Friza, 1928) e um pouco mais no eixo rostro-caudal. Como o ângulo de divergência do olho de inseto vara é, em média, 6,2 ° (Jander e Volk-Henrichs, 1970) comprimento de onda padrão de nossa era de aproximadamente 4 vezes o ângulo do omatídeos. Os experimentos são criados em uma gaiola de Faraday escurecida e realizadas em uma sala escura de 20-22 ° C. </li><li> Andar para a frente é induzida por um padrão progressivo em ambas as telas, onde as listras na tela de cada movimento para fora, ou um único feixe preto sobre fundo branco colocado entre as telas </li><li> Turning é induzida por listras que se deslocam na mesma direção em ambas as telas. Não encontramos uma correlação entre a velocidade do movimento e listras o ângulo da curva. Uma vez luminância do padrão listrado está definido para induzir a pé, que geralmente não requer ajuste adicional, mas pode ser ajustado para diferentes animais de acordo com a necessidade pela tensão das lâmpadas halógenas nos projetores. </li></ol> 3. Preparando o animal Experimental <ol><li> Insetos adultos do sexo feminino stick (Carausius morosus) são coladas (cimento dental, ProTempII, a 3M ESPE, Seefeld, Alemanha), lado ventral para baixo em um pedaço de pau balsa fina (3x5x100mm, WxHxL), que é inserido em um tubo de bronze que tem vários conectores. O animal é mantido pressionado por aproximadamente um minuto até que a cola é pelo menos parcialmente endurecido. </li><li> A cabeça e as pernas se projetam a partir da frente e do lado do pino para permitir a sua livre circulação. A área da coxas de todas as pernas, bem como a maior parte do abdômen tem que ser deixado livre de cola. </li><li> Cabeça de inseto, tórax e nas extremidades distais de cada fêmur e tíbia são marcadas com pigmentos fluorescentes (Dr. Kremer Farbmühle, Aichstetten, Alemanha) misturado com cimento dental para rastreamento de vídeo mais tarde. </li></ol> 4. Colocação de eletrodos EMG Atividade muscular dos músculos das pernas diferentes, tais como, neste exemplo, o transferidor e músculos coxas retrator, que estão localizados no tórax e protração causa (movimento para frente) e retração (movimento para trás) da perna, é registrado por meio de eletrodos EMG implantado no tórax. Todas as gravações são diferencialmente EMG amplificado. O sinal foi amplificado 100x em um pré-amplificador (eletrônica workshop, Zoological Institute, Colónia), band-pass filtrada, (100Hz-2000Hz), ainda mais ampliada (10x), e importado por meio de um conversor AD em Spike2 (Vers.5.05, CED, Cambridge, UK). <ol><li> Os eletrodos são feitos de fios de cobre revestido (Elektrisola, Eckernhagen, Alemanha; diâmetro externo 47μm). Para um eletrodo, dois fios são os primeiros untada com cola, então, os dois fios são trançados pegajosas em torno de si </li><li> Em uma extremidade do fio torcido extremidades são soldadas a uma mini-ficha. Na outra ponta os fios são cortados para fornecer termina limpa sem isolamento para a inserção no animal. </li><li> Os eletrodos EMG são Plugged no conector pequeno na extremidade do tubo de latão. </li><li> Um pino Minuten é usada para fazer furos pequenos na cutícula </li><li> As extremidades do corte do eletrodo são então separadas e inserido em um músculo em cerca de 1 milímetro de distância um do outro, que, em nossa experiência, dá um bom sinal-ruído. Cuidados devem ser tomados para não inserir os eletrodos muito profundo no músculo para evitar o seu dano. A Figura 2 mostra a localização dos eletrodos no tórax do animal. A Figura 3 mostra um animal com os fios de eletrodos no lugar. </li><li> Usamos uma pequena gota de cola histoacrylic (3M Vetbond, St.Paul, Minnesota, EUA) para manter os fios no lugar. </li><li> Um fio terra é inserida no abdômen. </li></ol> 5. Gravação do contato do tarso Contato do tarso é sempre gravado juntamente com traços EMG. Desde a superfície escorregadia é dividido em duas metades, um máximo de dois contralateral contatos tarsal pode ser registrado, ao mesmo tempo. Para este fim, a perna é usado como um "interruptor" para fechar um circuito entre a placa eo amplificador. Atual pode ser aplicado para as placas separadamente através de dois soquetes na base de cada prato. Podemos gerar dois sinais de onda quadrada com 2-4MV amplitudes com um gerador de pulsos (modelo MS501, eletrônica workshop, Zoological Institute, Colônia), que são de fase atrasada de 90 °. Os sinais são atenuados pela 60dB (/ 1000) e aplicado a as duas metades da superfície escorregadia. Neste experimento utilizamos apenas um dos dois sinais. É, simultaneamente, alimentados em uma fechadura-em-amplificador como um sinal de referência. O lock-in-amplificador de 2 fases (eletrônica workshop, Zoological Institute, Colónia) seletivamente apenas amplifica os sinais da mesma freqüência e fase do sinal de referência fornecidos. Um segundo canal só detecta o sinal de fase de 90 ° atrasada. Sinais de ruído de frequências de frequência de referência são rejeitadas e não afetam a medição. O sinal de saída do amplificador é alimentado em um conversor AD (Micro 1401k II, CED, Cambridge, UK) e Spike2 usando digitalizadas. Entre touch-down e levante-off do tarso para e da superfície escorregadia, a corrente flui através da placa de tarso e tíbia para o fio de cobre (ver abaixo: 5,3-5,8). O amplificador escolhido tem uma resistência de entrada elevada (1MΩ) eo sinal de tensão é muito pequena, a fim de evitar afetar o comportamento pé do animal. A passagem de corrente através tarso e tíbia é entre 2 e 4NA. O tempo de espera do sinal durante a touch-down, entre a entrada em que o lubrificante ea superfície de contato é menor que 1 ms. A transição do sinal de contato durante a decolagem é menos íngreme e mais atrasado. Isto é devido à ruptura atrasada do lubrificante do tarso por um efeito de ascensão capilar e devido ao movimento da perna, sem completar a decolagem em fase de balanço. <ol><li> O tubo de bronze com o pau de balsa para o qual o animal é colado é inserido em um micromanipulador para permitir o ajuste da altura do animal, entre 7 e 12 milímetros acima da superfície escorregadia, o que corresponde à altura durante a caminhada livre. </li><li> Para medir o fluxo de corrente sempre que o tarso inseto da perna é monitorado no chão, um fio (47μm de diâmetro) é cortado em cerca de 15cm longos pedaços. </li><li> O isolamento de um cobre é removido por queima-lo com álcool. </li><li> Um ciclo é formado com uma extremidade do fio e deslizou ao longo do tarso do animal </li><li> O laço é amarrado na extremidade distal da tíbia para proporcionar um bom contato entre o animal eo fio. </li><li> O fio é então fixado no tórax do animal com uma gota de cola de dois componentes (ProTempII, veja acima), e ligado ao amplificador diferencial através de uma pinça jacaré. </li><li> Para melhorar a condutividade do fio em suas extremidades, uma gota de creme é aplicado eletrodo (Marquette Hellige, Freiburg, Alemanha) nas áreas de contato. </li><li> A intensidade do sinal é então testada no monitor. Devido às propriedades filtro passa-baixa do lock-in-amplificador (10ms de tempo constante) eo lift-off/touch-down gradual do tarso, o sinal não é um sinal exata quadrados. Um, portanto, tem que definir limites adequados perto do ponto de transição para determinar o momento exato de contato tarsal e verificar manualmente cada evento determinado pelo software de digitalização. Com base no contato tarsal, que definiu o momento em que o tarso de uma perna dado estava no chão como posição e momento em que estava no ar como a fase de balanço. </li><li> O sinal de disparo para a câmera é gravada simultaneamente com o traçado EMG eo sinal de contato tarsal, e permite um quadro preciso por correlação de quadros de comportamento e traços gravados. </li></ol> 6. A gravação óptica de movimentos de pernas para Análise Digital A freqüência de aprofundamento da pau insetos em superfícies escorregadias pode chegar a 3-4Hz (Graham e Cruse, 1981). <ol><li>Antes de gravar sequências de caminhar, um espelho é colocado em um ângulo de 45 ° para trás o animal para ter um monitor adicional visual para touch-down. A câmera é acionada externamente e imagens são alimentados em um PC através de uma interface FireWire. </li><li> Gravamos andando seqüências de cima com uma câmera de vídeo de alta velocidade (Marlin F-033C, a Allied Vision Technologies, Stadtroda, Alemanha) em 100fps para analisar os movimentos das pernas digitalmente, e correlacioná-los com a atividade EMG e entre em contato tarsal. </li><li> Durante a gravação de sequências de caminhar, o animal é iluminado com LED azul matrizes (30-50V DC, 24cd luminância, Eletrônica Workshop, Instituto Zoológico da Universidade de Colônia), que são ajustadas em intensidade para iluminar os marcadores fluorescentes. Segundo a literatura (Schlegtendal, 1934), bichos-pau não possuem visão de cores e não observamos um efeito adverso da iluminação de luz UV sobre a resposta de viragem. Um filtro amarelo na frente da lente da câmera suprime o comprimento de onda curta da luz de ativação e dá um maior contraste para as gravações de vídeo. </li><li> Os arquivos de vídeo podem ser analisados ​​usando o software de rastreamento de movimento (WINanalyze, Vers.1.9, Mikromak serviço, Berlim, Alemanha). </li></ol> 7. Gravação de seqüências Walking <ol><li> Como controle, primeiro de uma seqüência andar com um animal intacto é gravado. </li><li> A velocidade do padrão listrado está definido e padrão ea gravação de vídeo são iniciados aproximadamente ao mesmo tempo. </li><li> Se o animal não começar a locomoção espontânea, ele pode ser estimulado no abdômen com um pincel (Bassler e Wegener, 1983), ou por um sopro de ar para as antenas. Neste caso, os animais tocou no lado esquerdo do abdômen tendem a virar à esquerda e vice-versa. O padrão listrado é mantida em movimento até que o animal pára de andar ou até depois de 3 minutos de gravações contínuas. </li><li> A fim de testar até que ponto a atividade muscular em uma perna é dependente de estímulos sensoriais das pernas vizinhos, o animal é induzido a autotomize suas pernas. O site de autotomia fecha naturalmente dentro de segundos. Um exemplo de um animal com frente autotomized e patas traseiras é mostrado na Figura 3. </li><li> Por exemplo, para experimentos com animais com apenas uma perna do meio, que induzem autotomia das pernas pró e metathoracic apertando o fêmur proximal com um par de fórceps (Schmidt e Grund, 2003) ou cortar as pernas ao nível dos coxas após a gravação do animal intacto. Depois que um mínimo de 30min para o tempo de recuperação é dado ao animal. </li><li> Então novo recorde seqüências andar como antes. Em preparações reduzida, muitas vezes precisamos induzir andar usando pinceladas de tinta. </li></ol> 8. Resultados representativos: <img src="/files/ftp_upload/2629/2629fig1.jpg" alt="Figura 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 1"> Figura 1 configuração Experimental; A:. Fotografia de um inseto de vara amarrada acima da superfície escorregadia, marcado com pigmentos fluorescentes para rastreamento perna e com fio para EMG de gravação e de medição de contato tarsal. B: Esquema de ligação dupla de gravação de contato tarsal da perna durante a caminhada sobre a superfície escorregadia. <img src="/files/ftp_upload/2629/2629fig2.jpg" alt="Figura 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 2"> Figura 2. Posições para a colocação de eletrodos EMG nos músculos transferidor e retrator no tórax da perna meio pau de insetos. ML: perna média; FL: frente perna <img src="/files/ftp_upload/2629/2629fig3.jpg" alt="Figura 3" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 3"> . Figura 3 Vara de insetos com fios de EMG nos músculos pró e afastador da perna meio no lugar, pernas da frente e traseiros foram retirados para estudar o efeito da presença de pernas vizinhos na cinemática e atividade muscular das pernas no meio a preparação reduzida. <img src="/files/ftp_upload/2629/2629fig4.jpg" alt="Figura 4" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 4"> Figura 4. Traço Exemplo de afastador atividade EMG com sinal de referência de contato tarsal em uma perna dentro do meio durante a manobra. No início do trace (caixa azul em primeiro lugar) o retrator é ativo durante a postura, enquanto a perna tem contato com o solo ("circuito fechado"), indicando que a perna faz frente passos, depois de um interruptor de curto (caixa azul segundo), a retrator é ativo durante o balanço, enquanto que a perna está no ar ("circuito aberto", caixa azul terceiros), mostrando a ocorrência de passos para trás dirigido. <img src="/files/ftp_upload/2629/2629fig5.jpg" alt="Figura 5" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 5"> Figura 5. Captura de tela de uma gravação do transferidor (traço em cima) e retrator (traço médio) músculos e traços de contato gravados simultaneamente tarsal (traço inferior). Observe a atividade alternando nos traços EMG que corresponde à atividade dos dois músculos no ciclo de passo, que é a atividade transferidor imediatamente antes e duranteswing, quando o contato tarsal rastrear sinais de perda de contato com o solo e atividade retrator após e durante o touch-down do tarso, quando a perna está na postura. A inserção mostra o arquivo de vídeo correspondente correspondente a esta gravação que é usado para verificar o comportamento do animal.

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<li>Shankar, P. N., Kumar, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Experimental+Determination+of+the+Kinematic+Viscosity+of+Glycerol-Water+Mixtures%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Mathematical+and+Physical+Sci%22%5BJournal%5D)">Experimental Determination of the Kinematic Viscosity of Glycerol-Water Mixtures.</a> Proc. Mathematical and Physical Sci. 444, 573-581 (1994).</li>
<li>Tryba, A. K., Ritzmann, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multi-Joint+coordination+during+walking+and+foothold+searching+in+the+Blaberus+cockroach+I.+Kinematics+and+electromyograms%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurophysiol%22%5BJournal%5D)">Multi-Joint coordination during walking and foothold searching in the Blaberus cockroach I. Kinematics and electromyograms.</a> J Neurophysiol. 83, 3323-3336 Forthcoming.</li>
<li>Tryba, A. K., Ritzmann, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multi-Joint+coordination+during+walking+and+foothold+searching+in+the+Blaberus+cockroach.+II.+Extensor+motor+neuron+pattern%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurophysiol%22%5BJournal%5D)">Multi-Joint coordination during walking and foothold searching in the Blaberus cockroach. II. Extensor motor neuron pattern.</a> J Neurophysiol. 83, 3337-3350 Forthcoming.</li>
<li>Tsuchida, Y., Hama, N., Takahata, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+optical+telemetry+system+for+underwater+recording+of+electromyogram+and+neuronal+activity+from+non-tethered+crayfish%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci+Methods%22%5BJournal%5D)">An optical telemetry system for underwater recording of electromyogram and neuronal activity from non-tethered crayfish.</a> J Neurosci Methods. 137, 103-109 (2004).</li>
<li>Wang, H., Ando, N., Kanzaki, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Active+control+of+free+flight+maneuvers+in+a+hawkmoth%2C+Agrius+convolvuli%5BTitle%5D)+AND+%22J+Exp+Biol%22%5BJournal%5D)">Active control of free flight maneuvers in a hawkmoth, Agrius convolvuli.</a> J Exp Biol. 211, 423-432 (2008).</li>
</ol>

Não há conflitos de interesse declarados.

Nós descrevemos uma configuração que permite a geração opticamente induzida de transformar o comportamento e permite um elevado grau de desacoplamento do neuronalmente gerada atividade pé do passivo efeitos causados ​​pelo deslocamento mecânico dos membros outras andando sobre o chão. Fluxo de informações de potencial entre as pernas através do sistema nervoso sobre as forças de reação do solo ou entre em contato tarsal, por outro lado, ainda é possível e permite que o pesquisador a estudar a influência de tais informações na elaboração reduzida. As principais vantagens da configuração incluem superfície escorregadia que os animais mostram uma tendência muito alta para caminhar, e ao contrário do pé ou pisar em uma treadwheel, o animal pode realizar balanço e movimentos fase de apoio em todas as direções de caminhada natural. Além disso, os graus de liberdade para todas as pernas que os animais possam realizar curva andando se é uma preparação intactas ou semi-intactas. Porque as pernas não podem ser passivamente movida simplesmente pelo movimento para a frente do animal ou do movimento do substrato por baixo, cada movimento reflete a saída do motor do que a perna (Cruse, 1976; Graham e Wendler, 1981). A configuração é muito adequado para investigar a base neuronal de comportamentos adaptativos, tais como o giro para trás ou para frente vs andando, porque pode-se combinar gravações eletrofisiológicas da atividade motora com a análise da cinemática movimentos dos membros. Usamos resposta optomotor o inseto bastão para provocar a pé. As respostas dos animais para o padrão de distribuição rotativa mostrar a sua disponibilidade para executar curva de caminhar enquanto amarrados sobre a superfície escorregadia. Mais surpreendente para nós, pernas único single-perna preparações qualitativamente mostram o mesmo padrão se movendo como no animal intacto. Temos, assim, razão para acreditar que o controle de andar curva pode funcionar em grande parte sem coordenação estímulos sensoriais das pernas vizinhos. Será importante para testar novas experiências em se a atividade dos neurônios motores das pernas removidas também é influenciada pelo padrão optomotor. A configuração pode ser facilmente modificado para permitir o estudo de outras tarefas, como para a frente e para trás, colocando a pé uma única faixa na frente do animal ou puxando as antenas. A medição precisa do contato com o solo nos permite correlacionar a atividade muscular e posição das pernas. A alta resolução temporal deste sinal de contato elétrico é melhor do que 1ms e nos leva a uma nova visão sobre o momento da mudança de balançar a fase de apoio. A resolução é pior para a postura para balançar transição devido ao atraso no corte do lubrificante condução e uma falta de necessidade de uma completa lift-off durante a protração na superfície escorregadia. No entanto, o conhecimento sobre o balanço preciso fazer a transição postura é uma etapa particularmente útil primeiro, se quisermos compreender os mecanismos que o tempo de controle muscular e as atividades coordenadas dos músculos da perna em diferentes contextos comportamentais (veja também: Büschges et al, 2008;. Büschges &amp; Gruhn 2008). Como exemplo, usamos o músculo retrator e coxas transferidor da perna do meio e precisamente relacionada a sua actividade com a mudança de balançar a fase de apoio, enquanto que, simultaneamente, monitorou o contexto comportamental em que a perna foi utilizado. Para este propósito, que induziu a pé e registrou a atividade muscular continuamente. Uma perna dado pode ser um interior ou um perna de fora, dependendo do sentido de rotação. Na perna pisando meio, atuando como uma perna dentro, no sentido funcional, pode-se observar que os músculos afastador e transferidor tanto pode funcionar como músculos postura funcional, pois a perna para trás de forma intermitente produz passos, além de um passo à frente dirigido (ver Fig.4 ). A eletromiografia (EMG) de ambos os músculos foram retificados e normalizados para o momento do toque para baixo e da latência dos picos primeiro músculo foi calculada. Curiosamente, as latências de ambos os músculos em relação ao lift-off e touch-down dependem da função do músculo como balanço respectivos ou postura músculo (ver Fig.4) e não no próprio músculo, e mostrar apenas pequenas alterações na calendário de início de atividade. A maioria das explicações para a mudança de estado de balançar a postura assume que os sinais sensoriais de gatilho de contato tarsal o início da postura. A questão interessante de como as latências curtas entre pousar e ativação muscular no bicho-pau são trazidas e em que a informação sensorial que eles dependem agora podem ser tratadas com a configuração modificada. Em resumo, nós mostramos uma configuração de superfície escorregadia que nos permite obter de forma confiável andando em linha reta e curva em bichos-pau parado. Cinemática, atividade muscular eo tempo de tarso touch-down e decolagem podem ser monitorados e correlacionados nos dois diferentes c comportamentaisontexts ao mesmo tempo. Isso nos dá uma excelente ferramenta para estudar a ligação detalhada entre atividade muscular e contexto comportamental para uma única perna, bem como no animal intacto e os mecanismos subjacentes.

<table><tbody><tr><td>Cola epóxi de 2 componentes</td><td>UHU plus, UHU GmbH, Alemanha</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Telas de vidro (diâmetro 130 mm)</td><td>Linos Photonics</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Cimento dental</td><td>ProTemp II, 3M ESPE, Seefeld, Alemanha</td><td>3M Id: 70-2011-0358-0 Número do catálogo: 46430</td><td>Disponível através da 3M (&lt;a href=&quot;http://www.3m.com/">http://www.3m.com/&lt;/a&gt;) ou fornecedores odontológicos</td></tr><tr><td>Pigmentos fluorescentes</td><td>Dr. Kremer Farbm&amp;uuml;hle, Aichstetten, Alemanha</td><td>Cat. nºs: por exemplo, 56200 Pigmento Fluorescente Amarelo Dourado, 56350 Pigmento Fluorescente Vermelho Chama</td><td>&lt;a href=&quot;http://kremer-pigmente.de/en">http://kremer-pigmente.de/en&lt;/a&gt; ou &lt;a href=&quot;http://www.kremerpigments.com/">http://www.kremerpigments.com/&lt;/a&gt;</td></tr><tr><td>Cola histoacrilica</td><td>3M</td><td></td><td>fornecedor: WPI</td></tr><tr><td>Fio de cobre revestido</td><td>Elektrisola Eckernhagen</td><td></td><td>&lt;a href=&quot;http://www.elektrisola.com/">http://www.elektrisola.com/&lt;/a&gt;</td></tr><tr><td>Creme eletrodal</td><td>Marquette Hellige, Freiburg, Alemanha</td><td></td><td>O produto está descontinuado; sugerimos, por exemplo: &lt;a href=&quot;http://www.grasstechnologies.com">www.grasstechnologies.com&lt;/a&gt;</td></tr><tr><td>Gerador de pulso</td><td>Modelo MS501, oficina eletrônica, Instituto de Zoologia, Colônia, Alemanha</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Amplificador lock-in</td><td>Instituto de Zoologia</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Conversor AD</td><td>Cambridge Electronic Design</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Pré-amplificador</td><td>Instituto de Zoologia</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Câmera de vídeo de alta velocidade</td><td>Allied Vision Technologies</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Matrizes de LED UV</td><td>Instituto de Zoologia</td><td></td><td>30-50 V CC, oficina eletrônica&lt;br/&gt;
&amp;#955;390-395 nm&lt;br/&gt;Luminância 24 cd</td></tr><tr><td>Software digitalizador Spike2</td><td>Ver. 5.05, CED, Cambridge, Reino Unido</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Software de rastreamento de movimento</td><td>Serviço Mikromak, Berlim, Alemanha</td><td>WINanalyze, Ver. 1.9</td><td></td></tr></tbody></table>

estudando a base neural do comportamento locomotor adaptive em insetos

Studying the Neural Basis of Adaptive Locomotor Behavior in Insects

Estudando a base neural de andar comportamento, muitas vezes um enfrenta o problema que é difícil separar a saída neuronalmente produzido pisar daqueles movimentos de pernas, que resultam das forças passiva e interações com outras pernas por meio do contato com o substrato comum. Se queremos entender, que parte de um dado movimento é produzido pela saída do sistema nervoso motor, análise cinemática dos movimentos de pisar, portanto, precisa ser complementado com gravações eletrofisiológicas da atividade motora. O registro da atividade neuronal ou muscular em um animal se comportando é muitas vezes limitada pelo equipamento eletrofisiológicas que podem restringir o animal em sua capacidade de mover-se com graus de liberdade como muitos como possível. Isto pode ser evitado pelo uso de eletrodos implantáveis ​​e depois ter o movimento de animais em uma corda longa (ie Clarac et al, 1987;. Duch &amp; Pflüger, 1995; Böhm et al, 1997;. Gruhn &amp; Rathmayer, 2002) ou por transmissão os dados usando dispositivos de telemetria (Kutsch et al, 1993; Fischer et al, 1996;. Tsuchida et al 2004;. Hama et al, 2007;.. Wang et al, 2008). Ambos os métodos elegantes, que são utilizados com sucesso em artrópodes maiores, muitas vezes, difícil de aplicar em insetos menores andando que nem facilmente se enredar na corda longa ou são prejudicadas pelo peso do dispositivo de telemetria e suas baterias. Além disso, em todos estes casos, ainda é impossível distinguir entre a base puramente neuronal de locomoção e os efeitos exercidos por acoplamento mecânico entre as pernas andando através do substrato. Uma solução para este problema é a realização de experimentos em um animal amarrado, que é livre para andar no local e que é localmente suspensos, por exemplo, sobre uma superfície escorregadia, o que efetivamente remove mecânica contato mais chão. Isso tem sido usado para estudar as respostas de fuga (camhi e Nolen, 1981; camhi e Levy, 1988), transformando (Tryba e Ritzman, 2000a, b;. Gruhn et al, 2009a), para trás a pé (Graham e Epstein, 1985) ou mudanças na velocidade (Gruhn et al., 2009b) e permite que o experimentador facilmente combinar intra e extracelulares fisiologia com análises cinemáticas (Gruhn et al., 2006). Nós usamos uma configuração de superfície escorregadia para investigar o tempo de músculos da perna no bicho-pau se comportando em relação ao touch-down e levante-off em diferentes paradigmas comportamentais, tais como andar para a frente e curvas em preparações intactas e reduzida.

Nós descrevemos um método de registro da atividade motora, programado para o sinal de contato tarsal eletricamente gravado em um inseto amarrado, andando sobre uma superfície escorregadia. Isto é usado para estudar as bases neurais do comportamento adaptativo sob a influência reduzida de interação mecânica entre as pernas através do substrato.

Estudando a base neural do Comportamento Locomotor Adaptive em Insetos

Ao estudar a base neural do comportamento da caminhada, frequentemente enfrenta-se o problema de que é difícil separar a resposta de passos produzida neuronalmente daquelas...

O objetivo geral deste procedimento é analisar a fisiologia muscular das pernas, bem como seu tempo e cinemática em um inseto preso durante diferentes situações de locomoção. O inseto-pau *Carausius morosus* é utilizado neste estudo porque, para um inseto, possui tamanho relativamente grande e ganglios segmentares claramente separados.Primeiro, o animal é preso e marcado para rastreamento por vídeo fluorescente. Em seguida, eletrodos de EMG são posicionados nos músculos protractor e retractor. Então, segue-se o preparo do inseto preso para a gravação do contato tarsal sobre uma superfície escorregadia.O passo final do procedimento é o registro simultâneo da atividade muscular das pernas e do contato tarsal durante diferentes situações de locomoção. Em última análise, podem-se obter resultados que mostrem alterações no cronograma da atividade muscular. Dependendo do contexto comportamental, uma perna é utilizada no principal vantagem deste método em comparação com técnicas existentes, como o estudo de.Caminhar sobre bolas de treino elimina o acoplamento mecânico com o solo. Este método pode ajudar a responder perguntas fundamentais no controle motor, como a contribuição de uma única perna para a locomoção em um animal com pernas motoras. As implicações dessa técnica ampliam o campo do comportamento locomotor adaptativo, pois agora podemos estudar alterações na velocidade de locomoção e na direção do movimento no nível de uma única perna, demonstrando que a montagem será eficaz.Peter Boha, um técnico no meu laboratório, duas placas de latão revestidas com níquel firmemente unidas e isoladas uma da outra por uma tira de dois milímetros de largura composta por dois componentes. O epóxi é usado para preparar a superfície escorregadia para o animal; lubrifique cada metade da placa separadamente com uma mistura condutiva elétrica de glicerina e solução salina usando um pedaço de tecido macio. Quando aplicada corretamente, a solução deve ter entre 0,1 e 0,2 milímetros de espessura e criar uma viscosidade cinemática superficial de cerca de 430 centistokes.Duas telas circulares de vidro fosco são posicionadas diante da placa de modo que, durante um experimento, fiquem a 70 milímetros dos olhos do animal. Quando um padrão listrado em movimento é projetado nessas telas, o animal começará a caminhar para frente. A caminhada é induzida por um padrão progressivo em ambas as telas, com listras se movendo para fora, ou por um único feixe preto sobre fundo branco colocado entre as telas, o qual pode provocar sequências de caminhada reta mais longas.Se ambos os padrões de listras progressivas se movendo na mesma direção induzirem rotação. Uma vez que a montagem experimental estiver pronta, o animal pode ser preparado para um experimento usando cimento dental para prender um inseto bastão adulto fêmea com o lado ventral voltado para baixo sobre um fino palito, que é fixado a um tubo de latão com um soquete. A cabeça e as pernas se projetam pela frente e pelos lados do suporte, permitindo seu movimento livre.Em seguida, pigmentos fluorescentes misturados com cimento dental são usados para marcar a cabeça, o tórax e o fêmur distal e a tíbia de cada pata para rastreamento por vídeo posterior. A atividade muscular do animal é registrada por meio de eletrodos de EMG implantados no tórax.O sinal é amplificado 100 vezes em um pré-amplificador e, em seguida, amplificado 10 vezes e filtrado de 100 hertz a 2000 hertz antes da conversão em um sinal digital. Os eletrodos são feitos de dois fios de cobre revestidos espalhados com cola, depois torcidos um ao redor do outro, solda-se uma extremidade do fio torcido a um mini plugue e corta-se a outra extremidade usando um perfurador de pino minúsculo para fazer pequenos orifícios na cutícula por onde o eletrodo passará. Para entrar em contato com os músculos, coloca-se o mini plugue em uma extremidade do fio na tomada conectada ao tubo de latão ao qual o animal está preso.Insira a extremidade cortada de um eletrodo através do orifício logo abaixo da cutícula em um músculo, de modo que os dois fios de cada eletrodo sejam colocados em orifícios separados, aproximadamente um milímetro de distância um do outro. Para manter os fios no lugar, utilizamos uma pequena gota de cola acrílica histológica. Mais um fio é inserido no abdômen, o qual funcionará como eletrodo de referência, a fim de compreender a relação entre a cinemática da locomoção do inseto e a fisiologia muscular.O contato do tarso durante a caminhada é medido durante a gravação de EMG: queime a isolação na extremidade de um pedaço de fio de cobre com 15 centímetros de comprimento com álcool para poder medir o fluxo de corrente através do tarso. Em seguida, forma-se uma alça em uma das extremidades do fio, que é deslizada sobre o tarso do animal e apertada na extremidade distal da tíbia. O fio é então fixado no tórax do animal com uma gota de cimento dental, e a bolsa fixada no tubo de latão ao qual o animal está colado é conectada a um micromanipulador.Para permitir o ajuste da altura do animal entre sete e doze milímetros acima da superfície escorregadia, o que corresponde à altura do inseto durante a locomoção livre por uma prensa de jacaré, a outra extremidade do fio é então conectada ao amplificador diferencial com trava de fase. Aplicamos uma gota de creme eletrolítico nas áreas de contato para melhorar a condutividade do fio. Nas extremidades, o circuito é fechado conectando a placa ao amplificador com conectores na base da placa.Um gerador de pulsos cria um sinal que é aplicado em ambas as metades da placa por meio desses conectores. Um dos cabos da placa é conectado ao amplificador e usado como sinal de referência. Agora, com o animal posicionado e os fios conectados, sua perna torna-se uma chave, e uma corrente fluirá através do tarso para fechar um circuito entre a placa e o amplificador.Isso produz um sinal com um tempo de antecedência inferior a um milissegundo no contato e um sinal atrasado na perda de contato. A intensidade do sinal é testada movendo-se o tarso para cima e para baixo. Os fios de EMG são então conectados aos amplificadores.O sinal de gatilho para a câmera é registrado simultaneamente com o contato tarsal e o traçado de EMG, permitindo a correlação quadro a quadro dos traçados. Agora, uma sequência de locomoção pode ser registrada com o animal em posição e com todos os dispositivos conectados. O padrão visual e a gravação em vídeo são iniciados simultaneamente para criar uma gravação visual do movimento como controle.Utilizando uma câmera de vídeo de alta velocidade de 100 quadros por segundo, grave o movimento das pernas de cima e por meio de um espelho posicionado em um ângulo de 45 graus atrás do animal. Se o animal não iniciar a locomoção espontaneamente, ele pode ser estimulado no abdômen com uma escova ou com um sopro nas antenas. O rastreamento dos marcadores fluorescentes no animal pode ser aprimorado iluminando-o com um conjunto de luzes LED azuis e fixando um filtro amarelo na lente da câmera.Isso suprime o comprimento de onda curto da luz de ativação e adiciona contraste ao vídeo. Primeiro, grave a sequência de locomoção do animal intacto como controle. A alteração dos estímulos visuais muda a direção da locomoção.Se desejar, ampute as pernas pinçando o fêmur com um par de pinças e permita que o animal se recupere por 30 minutos. Agora, o papel fisiológico das pernas ausentes pode ser avaliado. Os pontos nesta imagem mostram as posições dos eletrodos nos músculos protractor e retractor da perna média.Nesta preparação de EMG, as patas dianteiras e traseiras foram removidas para estudar o efeito das patas vizinhas sobre a cinemática e a atividade muscular das patas médias. Agora, os dados neste traçado de um animal em curva, o traçado superior mostra o traçado de contato tarsal. Enquanto o traçado inferior mostra o EMG do músculo retrator.Durante os passos para frente no início do traçado, o retrator está ativo durante a fase de apoio, enquanto a perna está em contato com o solo. Após uma breve transição, a perna realiza passos para trás e o retrator fica ativo durante a fase de balanço, enquanto a perna está no ar. Abaixo, há uma visão completa de todos os dados coletados enquanto o animal caminha; na parte superior, está o traçado de EMG do músculo protetor.No centro está o traçado do EMG dos músculos retratores e abaixo está o sinal de contato tarsal. No detalhe, é possível observar os movimentos reais do animal capturados pela câmera de alta velocidade. A atividade alternada nos traçados do EMG corresponde à atividade dos dois músculos no ciclo das passadas.O músculo protensor está ativo logo antes e durante a fase de balanço, e o retrator está ativo após o toque do solo e durante a fase de apoio. Uma vez dominado, o preparo pode ser realizado em menos de 90 minutos, e os dados podem ser adquiridos por várias horas após este procedimento. Outros métodos, como análise cinemática ou registros de célula única, podem ser realizados em um animal consciente quase intacto após seu desenvolvimento.Essa técnica ajudou pesquisadores na área do controle motor a responder perguntas sobre como apêndices individuais geram padrões locomotores flexíveis e adaptáveis.

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