Estudando a base neural do Comportamento Locomotor Adaptive em Insetos

O objetivo geral deste procedimento é analisar a fisiologia dos músculos das pernas. Seu tempo e cinemática em um inseto amarrado durante diferentes situações de caminhada. O bicho-pau raus miose é usado para este estudo porque, para um inseto, é relativamente grande e tem gânglios segmentares claramente separados.

Primeiro, o animal é amarrado e rotulado para rastreamento de vídeo fluorescente. Em seguida, os eletrodos EMG são colocados nos músculos transferidor e retrator. Em seguida, segue-se a preparação do inseto amarrado para o registro do contato tarsal em uma superfície escorregadia.

A etapa final do procedimento é o registro simultâneo da atividade muscular da perna e do contato do tarso durante diferentes situações de caminhada. Em última análise, podem ser obtidos resultados que mostram alterações no tempo muscular. Dependendo do contexto comportamental, uma perna é usada em A principal vantagem deste método sobre as técnicas existentes, como o estudo.

Andar em bolas de caminhada é que o acoplamento mecânico através do solo é removido. Esse método pode ajudar a responder a questões-chave no controle motor, como o quanto uma única perna contribui para andar em um animal com perna motora. As implicações desta técnica abrem o campo do comportamento locomotor adaptativo porque agora podemos estudar mudanças na velocidade de caminhada, na direção de caminhada no nível de uma perna, demonstrando que a configuração será caçadas.

Peter Boha, um técnico do meu laboratório, Duas placas de latão revestidas de níquel firmemente unidas isoladas uma pela outra através de uma tira de dois milímetros de largura de dois componentes. O epóxi é usado para preparar a superfície escorregadia para o animal, lubrifique cada metade da placa separadamente com uma mistura salina de glicerina eletricamente condutora usando um pedaço de tecido mole. Quando aplicada corretamente, a solução deve ter entre 0,1 e 0,2 milímetros de espessura e criar uma viscosidade cinemática superficial de cerca de 430 centi stokes.

Duas telas redondas de vidro fosco são posicionadas na frente da placa de modo que, durante um experimento, fiquem a 70 milímetros dos olhos do animal. Quando um padrão listrado em movimento é projetado nessas telas, o animal começa a andar para frente. A caminhada é induzida por um padrão progressivo em ambas as telas com listras se movendo para fora ou por um único feixe preto sobre fundo branco colocado entre as telas, o que pode provocar sequências de caminhada retas mais longas.

Se ambos os padrões de listras progressivas se movendo na mesma direção, o giro é induzido. Uma vez que a configuração experimental é montada, o animal pode ser preparado para um experimento usando corda de cimento dental, um inseto adulto fêmea com o lado ventral voltado para baixo em um bastão fino, que é preso a um tubo de latão com um soquete. A cabeça e as pernas se projetam da frente e do lado do dell para permitir seu movimento livre.

Em seguida, pigmentos fluorescentes misturados com cimento dentário são usados para marcar a cabeça, o tórax e o fêmur distal e a tíbia de cada perna para mais tarde. Rastreamento de vídeo. A atividade muscular do animal é registrada por meio de eletrodos EMG implantados no tórax.

O sinal é amplificado 100 vezes em um pré-amplificador e depois amplificado 10 vezes e filtrado de 100 hertz a 2000 hertz antes da conversão para um sinal digital. Os eletrodos são feitos de dois fios de cobre revestidos esfregados com cola, depois torcidos um ao redor do outro, vendidos em uma extremidade do fio torcido para um mini plugue e cortam a outra extremidade usando um pino minúsculo perfurar pequenos orifícios na cutícula através da qual o eletrodo passará. Para entrar em contato com os músculos, coloque o mini plugue em uma extremidade do fio para o soquete conectado ao tubo de latão ao qual o animal está amarrado.

Insira a extremidade cortada de um eletrodo através do orifício logo abaixo da cutícula em um músculo de modo que os dois fios de cada eletrodo sejam colocados em orifícios separados por cerca de um milímetro. Para manter os fios no lugar, usamos uma pequena gota de cola histoacrílica. Mais um fio é inserido no abdômen, que atuará como eletrodo de referência para entender a relação entre a cinemática da marcha dos insetos e a fisiologia muscular.

O contato do tarso durante a caminhada é medido durante a gravação EMG, queimando o isolamento na extremidade de um pedaço de fio de cobre de 15 centímetros de comprimento com álcool para poder medir o fluxo de corrente através do tarso. Em seguida, um laço é formado em uma extremidade do fio deslizado sobre o tass do animal e apertado na extremidade distal da tíbia. O fio é então fixado no tórax do animal com uma gota de cimento dentário, e o bastão bolsa no tubo de latão ao qual o animal está colado é conectado a um micro manipulador.

Para permitir o ajuste de altura do animal entre sete e 12 milímetros acima da superfície escorregadia, isso corresponde à altura do inseto durante a caminhada livre através de uma crimpagem de jacaré. A outra extremidade do fio é então conectada ao amplificador de travamento do diferencial. Aplicamos uma gota de creme de eletrodo nas áreas de contato para melhorar a condutividade do fio Em suas extremidades, o circuito é completado conectando a placa ao amplificador com plugues na base da placa.

Um gerador de pulso cria um sinal que é aplicado a ambas as metades da placa por meio desses plugues. Um dos fios da placa é conectado ao amplificador e usado como sinal de referência. Agora, com o animal no lugar e os fios conectados, sua perna se torna um interruptor e uma corrente fluirá através do tarso para fechar um circuito entre a placa e o amplificador.

Isso produz um sinal com um tempo de espera de menos de um milissegundo no contato e um sinal atrasado que decola. A intensidade do sinal é testada movendo o tarso para cima e para baixo. Os fios EMG são então conectados aos amplificadores.

O sinal de disparo da câmera é gravado simultaneamente com o contato do tarso e o traço EMG para permitir a correlação quadro a quadro dos traços. Agora, uma sequência de caminhada pode ser gravada com o animal no lugar e tudo preso. O padrão visual e a gravação de vídeo são iniciados simultaneamente para criar uma gravação visual do movimento como controle.

Usando uma câmera de vídeo de alta velocidade de 100 quadros por segundo, grave o movimento da perna de cima e através de um espelho colocado em um ângulo de 45 graus atrás do animal. Se o animal não iniciar a locomoção espontaneamente, pode ser estimulado no abdômen com uma escova ou com um baiacu até as antenas. Qualquer rastreamento dos marcadores fluorescentes no animal pode ser melhorado iluminando o animal com uma série de luzes LED azuis e anexando um filtro amarelo à lente da câmera.

Isso suprime o comprimento de onda curto da luz de ativação e adiciona contraste ao vídeo. Primeiro registre a sequência de caminhada do animal intacto como controle. Mudar os estímulos visuais muda a direção da locomoção.

Se desejar, ampute as pernas beliscando o fêmur com uma pinça e deixe o animal se recuperar por 30 minutos. Agora o papel fisiológico das pernas perdidas pode ser avaliado. Os pontos nesta imagem mostram as posições dos eletrodos nos músculos transferidor e retrator da perna média.

Nesta preparação EMG, as patas dianteiras e traseiras foram removidas para estudar o efeito das pernas vizinhas na cinemática e atividade muscular das pernas médias. Agora, os dados neste traço de um animal girando, o traço superior mostra o traço de contato do tarso. Enquanto o traço inferior mostra o EMG do músculo retrator.

Durante os passos para a frente no início do traço, o retrator está ativo durante o apoio enquanto a perna tem contato com o solo. Após uma troca curta, a perna engata em passos para trás e o retrator fica ativo durante o balanço, enquanto a perna está no ar. Aqui está uma visão completa de todos os dados coletados enquanto o animal caminha em cima do traço EMG do músculo transferidor.

No centro está o traço EMG dos músculos retratores e, abaixo, o sinal de contato do tarso. Na inserção, você pode ver os movimentos reais do animal capturados pela câmera de alta velocidade. A atividade alternada nos traçados EMG corresponde à atividade dos dois músculos no ciclo de passos.

O músculo transferidor está ativo imediatamente antes e durante a fase de balanço, e o afastador está ativo após o toque e durante a fase de apoio. Uma vez dominado, a preparação pode ser feita em menos de 90 minutos, e os dados podem ser adquiridos por várias horas após este procedimento. Outros métodos, como análise cinemática ou registros de células únicas, podem ser realizados em um animal com comportamento quase intacto após seu desenvolvimento.

Essa técnica ajudou os pesquisadores no campo do controle motor a abordar questões sobre como apêndices únicos geram padrões de locomotivas flexíveis e adaptativos.