Name: Fabricação de hidrogéis micropatterned para Sistemas de Cultura Neural usando fotolitografia Projeção Dinâmica Máscara (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-02-11T23:00:00.000+00:00
Duration: 16 min 6 s
Description: Aprenda a fabricar hidrogéis micropatterned para sistemas de cultura neural usando fotolitografia com máscara de projeção dinâmica. Este método permite criar ambientes celulares complexos para estudos de viabilidade neuronal e crescimento de neuritos.

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Os autores gostariam de agradecer o laboratório do Prof Anthony Windebank para compartilhar os seus conhecimentos sobre DRG dissecção e cultura, bem como o Prof Shaochen Chen para discussões úteis a respeito da configuração do DMD. Esta pesquisa foi financiada em parte pela Tulane University e subvenções do Conselho de Regentes Louisiana (LEQSF [2009-10]-RD-A-18) e os NIH (NS065374).

1. Setup DMD <ol><li> A placa DMD, guia de luz UV (com colimador) e lente objetiva de 4x são todos montados verticalmente sobre uma mesa de isolamento de vibração. </li><li> A guia de luz UV deve ser ajustada de modo que a luz atinge a matriz espelho em um ângulo de 45 ° em relação ao plano dos espelhos, e 24 ° abaixo do plano dos espelhos (Figura 1). </li><li> A lente objetiva é montado de modo que a distância do DMD para a lente objetiva corresponde ao comprimento focal associada com a lente. </li><li> Um microscópio invertido é colocado abaixo da lente objetiva, de tal forma que a luz refletida do foco DMD pode ser visualizado através do microscópio. A distância entre a lente objetiva para a superfície de polimerização deve corresponder aproximadamente à distância de trabalho da lente. O estágio no microscópio pode então ser usado para ajustar essa distância para finamente focalizar a imagem. Esta distância pode variar de acordo com a superfície de polimerização escolhido. </li></ol> 2. Constrói dupla Hydrogel de Culturas Remoção Tissue A. adesão explante DRG <ol><li> Revestimento das paredes de 6 bem-colágeno insere célula revestido de cultura (Corning) com X-chuva, tendo o cuidado de evitar a própria membrana. (Como alternativa, uma caneta barreira hidrofóbica pode ser usado.) </li><li> Insere hidratar durante a noite com 1,5 ml de meio de adesão em uma incubadora a 37 ° C e 5% CO 2. Média de adesão é de médio neurobasal com 10% de soro fetal bovino, 1% penicilina / estreptomicina, 0,5 mM L-glutamina, e 20 mcg / mL NGF. </li><li> Colheita gânglios da raiz dorsal embrionária (DRG) de E-15 filhotes de rato. DRG deve ser banhado em colágeno revestido 6-bem inserções, até quatro por pastilha. </li><li> Incubar inserções por 2 horas para permitir DRG adesão à membrana. </li></ol> B. fotopolimerização máscara dinâmica Um dispositivo de microespelhos digitais (DMD) é uma 1024 x 768 conjunto de espelhos individuais, semelhante ao de televisores de projeção, que reflete a luz seletivamente com base na posição do espelho. Para os nossos propósitos, a DMD é usada para acender padrão de radiação ultravioleta (UV) em hidrogéis photocrosslinkable, criando geometrias hidrogel especificáveis ​​de uma maneira simples e rápida. A Figura 1 mostra a configuração do caminho DMD e luz UV. Embora a nossa DMD é uma unidade autônoma, o dispositivo também pode ser integrado para uso com muitos microscópios existentes. <ol><li> Retire o excesso de líquido de inserir e adicionar 500 mL de meio de polimerização dentro da pastilha. Meio da polimerização contém PEG 10% (1000 MW) e 0,5% IRGACURE 2959 dissolvidos em meio neurobasal suplementada com 20 mg / mL e NGF Pen 1% / Strep. </li><li> Coloque a inserção por baixo do aparelho DMD numa lâmina de vidro chuva X-tratada. </li><li> Carregar a imagem apropriada preto e branco para ser usado como um "fotomáscara" na DMD, através do uso do programa gráfico incluído ALP-3 básicos. Para nossos propósitos, uma forma bifurcando foi escolhido para permitir a implementação de sistemas de orientação neurite. </li><li> Usando um microscópio invertido para visualização, alinhar os explantes de tecido com o local apropriado no fotomáscara usando uma fonte de luz visível, refletindo a DMD. </li><li> Mudar a fonte de luz visível para a fonte de luz UV, e iluminar a solução PEG até crosslinking é suficiente. (Para as condições dadas e 5,0 Watts / cm 2 incidente sobre a DMD, de reticulação pode ser concluída em menos de 55 segundos.) Repita o procedimento para todos os DRG quatro no insert. </li><li> Lave cada inserir três vezes com DPBS estéril e 1% Pen Strep. </li><li> Adicionar 1,5 ml meio de crescimento abaixo do inserções cultura de células, e deixar equilibrar em uma incubadora por 30 minutos. Meio de crescimento é médio neurobasal contendo B-27 2% Pen, 1% / Strep, 0,5 mM L-glutamina, e 20 mcg / mL NGF. </li></ol> C. hidrogel Secundária Puramatrix <ol><li> Para aplicações neuronal, Puramatrix 1% é diluída de acordo com as instruções do fabricante para 0,15% em estéril H 2 O e suplementado com 1 laminina mcg / mL solúvel. </li><li> Todos os meios em excesso devem ser removidos dos vazios PEG, que contêm os explantes DRG, usando um aplicador de ponta de algodão esterilizado, Kimwipe, ou micropipeta. </li><li> Puramatrix é adicionado ao vazios PEG com uma micropipeta, a fim de preencher o espaço vazio, sem transbordar. Dependendo do volume vazio, tipicamente ~ 1 mL é usado por construir. </li><li> Puramatrix começa o processo de auto-montagem imediatamente após o contato com uma solução salina fisiológica, ou seja, o PEG inchado, mas 1,5 mL de meio de crescimento é adicionado abaixo da inserção e colocado na incubadora por uma hora para garantir a gelificação total. </li><li> Inicialmente, Puramatrix é ligeiramente ácido, por isso alterar a mídia depois de uma hora para permitir que o pH para equilibrar. </li><li> Mudanças de mídia são necessários aproximadamente a cada 48 horas. Tenha cuidado para que toda a mídia éadicionada por baixo da inserção, para proteger a integridade de Puramatrix mecanicamente fraco. </li></ol> Agarose <ol><li> Para aplicações neuronal, agarose é diluída para uma solução a 1% em meio de crescimento e colocado em banho-maria a 60 ° C até a agarose dissolve completamente (~ 1 hr). A solução é, então, suplementado com 1 mg / mL laminina solúveis. </li><li> Todos os meios em excesso devem ser removidos dos vazios PEG. </li><li> Agarose é adicionado ao vazios PEG, a fim de preencher o espaço vazio, sem transbordar. Dependendo do volume de vazio, tipicamente ~ 1 mL é usado por construir. </li><li> 1,5 mL de meio de crescimento é pré-refrigeradas (8 ° C) em uma placa de 6 poços, e as pastilhas contendo agarose são transferidos para a mídia refrigerado e mantido em geladeira a 8 ° C por pelo menos três minutos para permitir que a agarose gel. </li><li> Finalmente, as inserções são transferidos para 1,5 mL de pré-aquecido meio de crescimento (37 ° C) e mantido na incubadora a 37 ° C, com mudanças mídia necessária a cada 48 horas. </li></ol> 3. Dupla Hydrogel encapsulamento de células em 3D Encapsulamento hidrogel dupla é apropriado quando se usa qualquer gel de auto-montagem. O gel photocrosslinkable, neste PEG caso, serve como um suporte estrutural para a apresentação geométrica do gel de auto-montagem, por exemplo Puramatrix ou agarose. Alguns dos métodos, especificamente o tipo de gel e escolha de fotomáscara, vai depender da aplicação específica desejada. <ol><li> Carregar uma máscara adequada na DMD. Para a nossa sobrevivência celular, aplicação, nós simplesmente escolhemos uma apresentação cilíndrica de Puramatrix para ajudar na criação de imagens de células. Pesquisadores que estudam a sinalização celular poderia estar interessado em uma geometria compartimental para permitir a difusão de moléculas quimiotáticas. Além disso, uma aproximação grosseira de uma artéria foi mostrado para representar possível aplicação para a investigação dos vasos sanguíneos. </li><li> Tratar as paredes de uma inserção da cultura de células de poliéster com Rain-X, e de local em DMD no slide Rain-X revestido. </li><li> Adicionar 500 mL de meio de polimerização para a inserção. Induzir a reticulação PEG pela exposição à luz UV por 55 segundos. </li><li> Lavar três vezes com DPBS estéril e 1% Pen Strep. </li><li> Remova toda a mídia em excesso dos vazios PEG. </li><li> Spin down células na densidade desejada em um pellet. Cuidados devem ser tomados para remover todas as médias do pellet de células antes da mistura, como Puramatrix começa a auto-montagem imediatamente após o contato com uma solução salina. Suspender as células dentro Puramatrix 0,15% diluído em H 2 O estéril suplementada com sacarose 10%. </li><li> Injetar o Puramatrix / célula / sacarose mistura dentro vazios em PEG. </li><li> Adicionar 1,5 mL de meio de crescimento abaixo da inserção, e deixe gel dentro da incubadora por uma hora. </li><li> Alterar mídia após uma hora, e ~ a cada 48 horas depois. </li></ol> 4. Hidrogel único encapsulamento de células em 3D Um único encapsulamento hidrogel seria apropriado para qualquer situação onde as células podem ser examinados dentro de um hidrogel photocrosslinkable. <ol><li> Carregar uma máscara adequada na DMD. Para estudos de sobrevivência da célula, mais uma vez escolheu uma máscara circular básicos para representar um cilindro. Máscaras semelhantes às mostradas no método 4 poderia voltar a ser aplicada para o campo de pesquisa apropriado. </li><li> Tratar um poliéster inserir cultura de células com Rain-X, e de local em DMD no slide Rain-X revestido. </li><li> Células em qualquer concentração desejada pode ser adicionado diretamente à solução de PEG 10%, misturando bem para garantir a distribuição homogênea. </li><li> Adicionar 500 mL de meio de polimerização para a inserção. Induzir a reticulação PEG pela exposição à luz UV por 55 segundos. </li><li> Lavar três vezes com DPBS estéril e 1% Pen Strep. </li><li> Preencha com o meio de crescimento ambos abaixo e em cima do insert, mudando a cada ~ 2 dias. </li></ol> 5. Polimerização Hydrogel Thin Film <ol><li> Carregar uma máscara adequada na DMD. </li><li> Tratar uma colágeno revestido de poliéster inserir cultura de células com chuva X-, e colocar no slide Rain-X revestido. </li><li> Adicionar meio da polimerização suficiente para apenas cobrir o fundo da inserção (~ 250-300 mL para inserções 6 bem-plate). Permitir que os meios de comunicação a permear a membrana de inserção para 30-45 minutos em temperatura ambiente. </li><li> Remova o meio de polimerização em excesso da pastilha com uma micropipeta ou Kimwipe. Adicionar uma quantidade suficiente de UV-transparente do petróleo para cobrir completamente a parte inferior da pastilha. Permitir a inserção de sentar para 15-30 minutos em temperatura ambiente, tempo suficiente para que o óleo forma uma camada distinta acima do meio da polimerização saturando a membrana de inserção. </li><li> Coloque a inserção e deslize sob a DMD. Induzir a reticulação PEG pela exposição à luz UV. Devido à pequena espessura da camada PEG, de reticulação pode ser concluída em menos de 15 segundos a 5,0 Watts / cm 2 incidente sobre a DMD. </li><li lave a inserir tr vezes com dpbs est e pen strep. persist de um res oleoso uma preocupa detergente suave como tween pode ser adicionado ao tamp lavagem><li> Armazenar os inserir em uma placa de cultura de 6 bem tecido. Adicionar meio de crescimento para as células em suspensão, na concentração desejada, e pipetar um volume suficiente de suspensão de células dentro do insert de cultura de células para obter a densidade de célula desejada. Em seguida, adicione meio de crescimento bastante abaixo da inserção para manter a viabilidade celular completamente (~ 1,5 mL). </li><li> Após 48 horas se passaram, lave a inserir três vezes com DPBS estéril e 1% Pen-Strep para desalojar quaisquer células unadhered. Alterar media aproximadamente uma vez a cada 48 horas. </li></ol> 6. Resultados representante Exemplos de hidrogel contendo dupla constrói explantes DRG são mostrados na Figura 2. Observe que a migração celular e extensão neurite está limitada à região de células permissivas do hidrogel dupla construir. A Figura 3 mostra células dissociadas encapsulado dentro da mesma forma as construções de hidrogel dual. Devido à natureza dinâmica do fotomáscara DMD, a geometria disponíveis para encapsulamento é limitada apenas pelas dimensões e resolução da óptica. Encapsulamento de células foi também possível dentro de um hidrogel único fotopolimerizável, PEG, e um teste de viabilidade ao vivo / morto foi realizada conforme evidenciado na Figura 4. Encapsulamento em PEG destina-se apenas como um exemplo, como PEG não representa um ambiente ideal para células neurais. Portanto, a viabilidade celular realizado em construções de nossa PEG é compreensivelmente baixo. Finalmente, utilizando exemplos de filmes PEG fina como uma camada padrão restritivo para adesão celular em inserções de cultura de células são mostrados na Figura 5. Além disso, exemplos de possíveis "maus" resultados são oferecidas na Figura 6. Os resultados representam apenas uma pequena fração dos possíveis usos dos métodos desenvolvidos em nosso laboratório. Elas são destinadas a demonstrar a facilidade, versatilidade e viabilidade de nossa abordagem, e poderia ser tratado como "prova de princípio" para os pesquisadores a desenvolver seus próprios possíveis adaptações. <img src="/files/ftp_upload/2636/2636fig1.jpg" alt="Figura 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 1"> Figura 1. Ilustração esquemática do caminho de luz usado para fotolitografia. Detalhe: A luz UV ilumina a DMD em um ângulo de 45 ° e 24 ° abaixo do plano da matriz espelho. <img src="/files/ftp_upload/2636/2636fig2.jpg" alt="Figura 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 2"> Figura 2. Rotuladas de crescimento e proliferação de construções de hidrogel contendo DRG dual. AD) Imagens que retratam construções polimerizado PEG (cinza) com neurites rotulados com Beta-tubulina III (verde), núcleos de células manchadas DAPI (azul). Os explantes DRG estão contidos em Puramatrix e localizados nas regiões circular do padrão, com neurites crescente para a bifurcação (s). <img src="/files/ftp_upload/2636/2636fig3.jpg" alt="Figura 3" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 3"> Figura 3. Constrói hidrogel duplo contendo células marcadas com calceína AM, um marcador de células vivas, após 48 horas em meio de crescimento. AD) formas PEG Various, cheio de Puramatrix contendo neurônios dissociados DRG (~ 5x10 3 células / mL). <img src="/files/ftp_upload/2636/2636fig4.jpg" alt="Figura 4" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 4"> Figura 4. Hidrogel única construção que contém células vivas rotulados com calceína AM (verde) e células mortas rotulados com homodímero de etídio-1 (vermelho) após 24 horas em meio de crescimento (5x10 3 células / mL). <img src="/files/ftp_upload/2636/2636fig5.jpg" alt="Figura 5" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 5"> Figura 5. PEG celular restritivas polimerizado como um filme fino utilizando um "padrão de teste" para seletivamente células dissociadas aderir à membrana de colágeno revestido de suporte permeável. A, B) células vivas são rotulados depois de 48 horas com calceína AM (verde), enquanto as células mortas são rotulados com homodímero de etídio-1 (vermelho). Adesão celular mínima ocorre na área do PEG contendo o filme fino. <img src="/files/ftp_upload/2636/2636fig6.jpg" alt="Figura 6" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 6"> Figura 6. Imagens representativas de resultados indesejáveis. A) polimerização parcial de PEG, levando a um PEG inutilizável construir. Polimerização inadequada pode ocorrer devido à presença de um menisco no meio de pré-polímero, quantidades insuficientes de meio da polimerização, a exposição UV insuficiente ou inadequada foco da óptica. B) Imagem retratando construções polimerizado PEG (cinza) com neurites rotulados com Beta-tubulina III (verde), núcleos de células manchadas DAPI (azul). O neurites foram capazes de crescer fora dos canais padronizados PEG. Isso geralmente ocorre na condição de que transborda Puramatrix em cima da porção PEG durante a injeção.

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Não há conflitos de interesse declarados.

O método descrito aqui pode ser usado por qualquer pesquisador que procuram sistemas de cultura de células simples e reprodutível. Teoricamente, devido à grande variedade de hidrogéis fotopolimerizável disponíveis, o ambiente pode ser adaptado para permitir o uso com qualquer tipo de célula, incluindo explantes tecido inteiro. Além disso, o sistema de hidrogel dupla permite o controle espacial melhorada na apresentação de auto-polimerização hidrogéis, que tendem a formar formas amorfas por conta própria. O resultado do &quot;2.5D&quot; constrói hidrogel micropatterned fornecer uma matriz 3D para o crescimento neural apresentado em uma configuração 2D que permite a avaliação microscópica conveniente. O substrato sobre o qual os géis são polimerizados também podem ser variadas, permitindo maior controle no delineamento experimental. Nossos métodos são otimizados para uso com suportes de cultura de células permeáveis, como vimos melhoria da viabilidade (Figura 4), em comparação com a polimerização em lâminas de vidro (dados não mostrados). No entanto, outras superfícies de polimerização pode ser mais aplicável para diferentes aplicações: fabricação em lâminas de vidro utilizado em experimentos microfluídica ou formações agregado de células, por exemplo. Nossa experiência com esses sistemas de cultura levou à identificação de áreas potenciais de dificuldade. Primeiro, as técnicas de cuidado são necessários para manter a esterilidade das construções. Devido à natureza volumosos da configuração do DMD, é difícil de operar as etapas de polimerização sob condições estéreis. Para combater este problema, a etapa de lavagem descrito nos métodos é útil, e os antibióticos devem ser usados ​​em todas as mídias. Além disso, a espessura final e forma da construção polimerizado é altamente dependente do comportamento do fluido da pré-mistura de polímeros, ea presença de um menisco pode resultar em construções de gel que são muito finas ou incompleta polimerizadas (Figura 6). Dois passos podem ser tomadas para minimizar a formação de um menisco no interior insere cultura de células. Para hidrogéis de espessura (&gt; 200 mm), um revestimento simples de X-Chuva volta a parede interna da pastilha é suficiente. No entanto, como brevemente descrito acima, para construções finas (&lt;200 mm), uma camada de óleo é necessária para minimizar tanto o menisco e nega extinção de oxigênio da polimerização de radicais livres. Resolução foi encontrado para ser dependente de espessura, com uma diminuição no tamanho do recurso cada vez mais realizado com gel mais espesso. A resolução também variou dependendo se o recurso representou um alívio positivo ou negativo no hidrogel. No entanto, conseguimos uma resolução suficiente para construções com tamanhos traço mínimo na escala de ~ 100 mm usando objetivos microscópio apenas como foco óptica. Nossos experimentos mostraram que o hidrogel dupla constrói aqui descritos representam uma excelente base para a formação de base in-vitro modelos de crescimento neurite e orientação. A técnica empregada micropatterning é uma adaptação dos métodos existentes 18,19, mas o nosso set-up enfatizou uma concepção simples de implementar e foi otimizado para a produção de construções de hidrogel dupla insere em cultura de células; insere cultura de células foram vitais para melhorar a viabilidade das células, assim como crosslinking torno explantes tecidos anteriormente aderente. O alcance dos resultados apresentados é limitada pelos interesses de nosso laboratório, no entanto, acreditamos que os métodos descritos nesta publicação serão úteis para os pesquisadores à procura de um método relativamente barato, rápido e fácil de usar para a fabricação de cultura celular 3D modelos.

<table><tbody><tr><td>Dispositivo Digital de Micromirrors</td><td>Texas Instruments</td><td>DLPD4X00KIT</td><td></td></tr><tr><td>Suporte Permeável com Revestimento de Colágeno Transwell</td><td>Corning</td><td>3491</td><td>Também referido como Inserto de Cultura Celular no manuscrito</td></tr><tr><td>Suporte Permeável de Poliéster Transwell</td><td>Corning</td><td>3412</td><td>Também referido como Inserto de Cultura Celular no manuscrito</td></tr><tr><td>Meio Neurobasal</td><td>Invitrogen</td><td>21103-049</td><td></td></tr><tr><td>Soro Bovino Fetal</td><td>Invitrogen</td><td>16000-036</td><td></td></tr><tr><td>L-glutamina</td><td>Invitrogen</td><td>25030-164</td><td></td></tr><tr><td>Fator de Crescimento Neural</td><td>Invitrogen</td><td>13257-019</td><td></td></tr><tr><td>Pen/Strep</td><td>Invitrogen</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>Suplemento B-27</td><td>Invitrogen</td><td>17504-044</td><td></td></tr><tr><td>DPBS</td><td>Invitrogen</td><td>14190-250</td><td></td></tr><tr><td>Puramatrix</td><td>BD Biosciences</td><td>354250</td><td></td></tr><tr><td>PEG 1000</td><td>Polysciences, Inc.</td><td>15178</td><td></td></tr><tr><td>Irgacure 2959</td><td>Ciba Specialty Chemicals</td><td>0298913AB</td><td></td></tr><tr><td>Óleo</td><td>Foram utilizados tanto óleo de canola quanto óleo de silicone</td><td></td><td>Deve ser transparente à UV e minimizar a formação de menisco positivo/negativo</td></tr><tr><td>OmniCure Série 1000</td><td>EXFO</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Rain-X</td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

fabricação de hidrogéis micropatterned para sistemas de cultura neural usando fotolitografia projeção dinâmica máscara

Fabrication of Micropatterned Hydrogels for Neural Culture Systems using Dynamic Mask Projection Photolithography

Cada vez mais, ambientes de cultura de células padronizadas estão se tornando uma técnica relevante para estudar características celulares, e muitos pesquisadores acreditam na necessidade de ambientes 3D para representar experimentos in vitro que imitar melhor em qualidades vivo 1-3. Estudos em áreas como a pesquisa do câncer 4, engenharia neural 5, fisiologia cardíaca 6, e célula-matriz de interação 7,8 têm mostrado o comportamento das células difere substancialmente entre as culturas tradicionais monocamada e construções em 3D. Hidrogéis são utilizados como ambientes 3D devido à sua diversidade, versatilidade e capacidade de composição molecular sob medida através de funcionalização 9-12. Numerosas técnicas existem para a criação de construções como células de suporte matrizes, incluindo electrospinning 13, selos de elastômero 14, impressão jato de tinta 15, photopatterning aditivo 16, fotomáscara estática litografia de projeção-17, e microstereolithography máscara dinâmica 18. Infelizmente, esses métodos envolvem várias etapas de produção e / ou equipamentos não é facilmente adaptável a célula e métodos convencionais de cultura de tecidos. A técnica empregada neste protocolo adapta os dois últimos métodos, usando um dispositivo de microespelhos digitais (DMD) para criar máscaras dinâmicas para crosslinking geometricamente específicas poli (etileno glicol) (PEG) hidrogéis, induzida através da polimerização UV iniciada de radicais livres. O resultado do &quot;2.5D&quot; estruturas de fornecer um ambiente restrito em 3D para o crescimento neural. Nós empregamos uma abordagem dual-hidrogel, onde PEG serve como uma estrutura de células-região restritivas para fornecer uma outra maneira disforme, mas células permissivas gel auto-montagem feita a partir de qualquer Puramatrix ou agarose. O processo de fabricação é uma etapa rápida e simples um que é altamente reprodutível e facilmente adaptado para uso com métodos convencionais de células de cultura e substratos. Explantes tecido inteiro, como gânglios da raiz dorsal embrionária (DRG), podem ser incorporadas ao hidrogel constrói dupla para ensaios experimentais, tais como crescimento de neuritos. Além disso, células dissociadas pode ser encapsulado no hidrogel photocrosslinkable ou auto-polimerização, ou seletivamente aderidas à membrana suporte permeável usando células-restritivas photopatterning. Usando o DMD, criamos hidrogel construções até ~ 1 mm de espessura, mas de película fina (&lt;200 mm) estruturas PEG foram limitados pela têmpera de oxigênio da reação de polimerização por radicais livres. Nós posteriormente desenvolveu uma técnica utilizando uma camada de óleo acima do líquido de polimerização que permitiu a polimerização estrutura fina PEG. Neste protocolo, descrevemos a criação rápida de sistemas de hidrogel 3D para a produção de células neurais e microfabricated culturas de tecidos. As construções de hidrogel dupla demonstrou aqui representam versáteis modelos in vitro que podem ser úteis para estudos em neurociência que envolvem a sobrevivência da célula, migração e / ou crescimento neurite e orientação. Além disso, como o protocolo pode funcionar para muitos tipos de hidrogéis e células, as possíveis aplicações são variadas e vastas.

Técnicas simples são descritos para a produção rápida de microfabricated sistemas de cultura neural usando um dispositivo de microespelhos digitais para litografia dinâmica máscara de projeção em substratos de cultura de células regulares. Estes sistemas cultura pode ser mais representativo da arquitectura biológica natural, e as técnicas descritas podem ser adaptadas para inúmeras aplicações.

Fabricação de hidrogéis micropatterned para Sistemas de Cultura Neural usando fotolitografia Projeção Dinâmica Máscara

Cada vez mais, os ambientes de cultura celular padronizados estão se tornando uma técnica relevante para estudar características celulares, e muitos pesquisadores acreditam que...

O objetivo geral deste procedimento é criar um sistema de cultivo celular com duplo hidrogel microestruturado para estudos neuronais. Isso é realizado primeiramente cultivando implantes de tecido, como gânglios da raiz dorsal embrionários, em insertos permeáveis para cultivo celular. Em seguida, uma microestrutura é criada em um hidrogel fotoconectável utilizando um dispositivo microespelho digital ou DMD como máscara fotodinâmica.Em seguida, adiciona-se o hidrogel autoagregante, como o Pure, que pode conter uma suspensão de células dissociadas. É necessário um tempo adequado de incubação antes da análise celular. Por fim, podem-se obter resultados que demonstram a viabilidade de células neuronais e o crescimento de neuritos por meio de configurações geométricas específicas definidas pelo DMD.A principal vantagem desta técnica em relação aos métodos existentes é que uma massa fotodinâmica pode ser rapidamente criada, modificada e projetada à distância para acomodar praticamente qualquer substrato, como inserts permeáveis para cultivo celular. Embora este método possa fornecer informações sobre sistemas neurais, ele também pode ser aplicado a outros sistemas que se beneficiariam de restrições geométricas específicas, como sinalização celular, migração celular, contato célula a célula ou morfogênese, para citar alguns. As luzes UV do painel DMD, o guia e a lente objetiva de quatro vezes são montados verticalmente sobre uma mesa de isolamento de vibração.Um microscópio invertido é colocado abaixo da lente objetiva de forma que a luz de foco refletida pelo DMD possa ser visualizada através do microscópio. Para obter mais detalhes sobre a configuração do DMD, consulte o protocolo escrito que o acompanha. Primeiro, prepare as seis inserções de cultura celular revestidas com colágeno para receber culturas explantes X, revestindo as paredes das inserções de cultura celular com rain x, tomando cuidado para não aplicar o rain X na própria membrana.Em seguida, adicione 1,5 mililitros de meio aian aos insertos e incube durante a noite a 37 graus Celsius e 5% de dióxido de carbono. No dia seguinte, após colher gânglios da raiz dorsal embrionários de filhotes de rato E15, plaque até quatro GDR em cada inserto de seis poços revestido com colágeno e incube por duas horas a 37 graus Celsius e 5% de dióxido de carbono para permitir que os GDR adiram à membrana.Após o período de incubação, os GDRs estarão prontos para a fotopolimerização. Um dispositivo digital de microespelhos é uma matriz de 1024 por 768 microespelhos individuais, que refletem seletivamente a luz com base na posição do espelho. Neste procedimento, o DMD é utilizado para direcionar luz ultravioleta sobre hidrogéis fotoativáveis CRO, criando geometrias de hidrogel especificáveis de maneira simples e rápida.Embora o nosso DMD seja uma unidade autônoma, o dispositivo também pode ser integrado para uso com muitos microscópios existentes. Primeiro, retire as plantas DRGX do incubador e aspire todo o líquido em excesso do inserto. Em seguida, adicione 500 microlitros de meio de polimerização ao interior do inserto.Transfira os inserções com as plantas DRGX para uma lâmina de vidro resistente à chuva e posicione a lâmina sob o DMD. Utilize o programa de interface gráfica básica ALP três para carregar a imagem em preto e branco que será usada como máscara fotográfica no DMD. Neste caso, escolheu-se uma forma bifurcada para permitir a implementação de sistemas de orientação de neuritos usando um microscópio invertido e uma fonte de luz visível DI.Alinhe o explante tecidual com a localização apropriada na máscara fotográfica, utilizando a luz refletida pelo DMD como guia. Em seguida, troque a fonte de luz visível por uma fonte de luz UV. Ilumine o meio de polimerização dentro da cultura celular.Insira até que a reticulação do PEG esteja completa. Repita para cada gânglio da raiz dorsal no inserto. Em seguida, lave cada inserto três vezes com solução salina tamponada com fosfato estéril contendo 1% de penicilina-estreptomicina.Por fim, adicione 1,5 mililitros de meio de crescimento sob os insertos de cultura celular e deixe equilibrar em uma incubadora de cultura de tecidos a 37 graus Celsius e 5% de dióxido de carbono por 30 minutos. Durante o período de incubação, sonique a matriz pura por 30 minutos. Para solubilizar os peptídeos, dilua a solução fornecida de 1% para 0,15% em água estéril e complemente com um micrograma por mililitro de laminina solúvel.Após 30 minutos, retire as culturas do incubador e aspire todo o meio em excesso do inserto. Em seguida, visualizando o vazio ao microscópio, aspire o meio de dentro da área vazada na construção de PEG, pipetando cerca de um microlitro da solução pura de matriz no vazio ao redor do explante de X. Certifique-se de que a matriz pura não transborde o vazio do pino.Em seguida, pipete 1,5 mililitros de meio de crescimento sob o inserto e coloque no incubador de cultura de tecidos a 37 graus Celsius e 5% de dióxido de carbono durante uma hora. Para garantir a totalização após esse período, substitua o meio de crescimento e, em seguida, retorne as culturas ao incubador. O meio de crescimento é substituído a cada 48 horas de cultura.Exemplos de construtos duplos de hidrogel contendo plantas DRGX são mostrados aqui. As plantas DRGX foram marcadas para marcadores de crescimento e proliferação. O construto de PEG polimerizado aparece cinza, os NEURITOS de DRG marcados com tubulina beta três aparecem verdes e a coloração DPI marca os núcleos celulares, visíveis em azul.Observe que a migração celular e a extensão de retículos estão limitadas à região permissiva para células da construção de hidrogel duplo. A encapsulação em hidrogel duplo é adequada quando se utiliza qualquer gel autoagregável ou gel fotoconectável. Neste caso, o PEG atua como suporte estrutural para a apresentação geométrica do gel autoagregável.Por exemplo, matriz pura ou aris. O tipo de gel e a escolha da máscara fotográfica dependerão da aplicação desejada específica. Trate as paredes de um inserto de cultura celular de poliéster com rain X conforme demonstrado anteriormente.Transfira o inserto para uma lâmina revestida com rain X e coloque-a sob o DMD. Em seguida, adicione 500 microlitros de meio de polimerização ao inserto. Carregue a máscara apropriada no DMD para este experimento de sobrevivência.Uma apresentação cilíndrica de matriz pura é utilizada para auxiliar na obtenção de imagens de células. Exponha o inserto à luz UV por 55 segundos para induzir a reticulação dos pinos após a reticulação. Lave o vazio recém-formado com DPBS estéril e penicilina-estreptomicina 1%.Use uma micropipeta ou um aplicador estéril de algodão para remover todo o líquido em excesso do espaço vazio. Prepare o Matrixx puro por sonicador durante 30 minutos, dilua a 0,15% em água estéril, suplementado com um micrograma por mililitro de laminina solúvel e 10% de sacarose. Em seguida, pelote as células a serem cultivadas por centrifugação.Aspire completamente o meio do pellet celular e re-suspenda o pellet numa concentração de aproximadamente cinco vezes 10 elevado a três células por mililitro na solução de matriz pura a 0,15%. É fundamental que todo o meio seja aspirado do pellet celular, pois a matriz pura inicia a auto-organização ao entrar em contato com a solução salina. Em seguida, pipete cerca de um microlitro da mistura de células em matriz pura suplementada no espaço vazio do pino.Este volume geralmente é suficiente para preencher o espaço vazio sem transbordar, adicionando 1,5 mililitros de meio de crescimento sob o inserto. Em seguida, coloque o hidrogel secundário de matriz pura no incubador de cultura de tecidos a 37 graus Celsius e 5% de dióxido de carbono por uma hora para garantir a completa gelificação. Após esse tempo, aspire o meio e adicione meio fresco sob o inserto, tomando cuidado para não danificar a matriz pura, que é mecanicamente frágil.Retorne as culturas ao incubador de cultura de tecidos e troque o meio a cada 48 horas de cultivo. Abaixo estão exemplos de neurônios de gânglios da raiz dorsal vivos encapsulados dentro de diversos construtos de hidrogel duplo. Após 48 horas em meio de crescimento, as células foram marcadas com cálcio, um marcador de células vivas que aparece em verde.Aqui, devido à natureza dinâmica da máscara fotolitográfica DMD, a geometria disponível para encapsulação é limitada apenas pelas dimensões e resolução da óptica. Uma encapsulação única em hidrogel é adequada quando as células podem ser examinadas dentro de um hidrogel fotoconectável fiel à cultura de células em poliéster. Insira com rain X e posicione sob o DMD em uma lâmina revestida com rain X.Como antes, pipete as células a serem cultivadas diretamente no meio de polimerização na concentração desejada e misture bem para garantir uma distribuição homogênea. Em seguida, pipete 500 microlitros da mistura de células no meio de polimerização no inserto. Escolha a máscara apropriada e carregue-a no DMD para induzir a reticulação de PEG mediante exposição à luz UV por 55 segundos.Para estudos de sobrevivência celular, uma máscara circular básica é utilizada para representar um cilindro; lave o inserto três vezes com DPBS estéril e penicilina-estreptomicina a 1%, em seguida pipete 1,5 mililitro de meio de crescimento sob o inserto e quantidade suficiente de meio de crescimento por cima para imergir completamente o inserto. Incube a 37 graus Celsius e 5% de dióxido de carbono, com trocas de meio a cada 48 horas. Abaixo, temos um exemplo de neurônios corticais dissociados vivos encapsulados dentro do PEG. Células vivas são marcadas com amida de cálcio e aparecem verdes, enquanto células mortas são marcadas com homodímero de AHy um e aparecem vermelhas.A encapsulação em PEG destina-se apenas como um exemplo, pois o PEG não representa um ambiente ideal para células neurais. A geometria escolhida representa um meio simples para estudar a viabilidade celular, mas pode ser adaptada a uma ampla gama de estruturas. Hidrogéis em filme fino podem ser usados para gerar padrões específicos de restrição celular.Novamente, trate o inserto de cultura celular de poliéster com rain X como antes e coloque-o sobre uma lâmina tratada com rain X. Em seguida, pipete de 250 a 300 microlitros de meio de polimerização no fundo do inserto de cultura celular tratado. Esse volume é suficiente para cobrir apenas o fundo do inserto; incube em temperatura ambiente por 30 a 45 minutos para permitir que o meio permeie a membrana do inserto. Aspire o meio em excesso do inserto com uma micropipeta.Em seguida, pipete uma quantidade suficiente de óleo transparente ao UV no fundo do inserto para cobrir completamente a área. Incube o inserto à temperatura ambiente por 15 a 30 minutos, tempo suficiente para que o óleo forme uma camada distinta acima do meio de polimerização. Para saturar a membrana do inserto, carregue uma máscara apropriada no DMD.Após posicionar o inserto e a lamínula sob o DMD, induza a reticulação por exposição à luz ultravioleta. Lave o inserto três vezes com DPBS estéril e 1% penicilina-estreptomicina; após a lavagem, transfira o inserto para uma placa de cultura de tecidos de seis poços, colete e pelletize as células a serem cultivadas. Aspire o meio e ressuspenda o pellet celular no meio de crescimento na concentração desejada, entre 10⁴ e 10⁶ células por mililitro.Em seguida, pipete um volume suficiente da suspensão celular no interior do inserto de cultura celular para obter a densidade celular desejada. Adicione meio de crescimento suficiente abaixo do inserto para manter completamente a viabilidade celular. Incube a 37 graus Celsius e 5% de dióxido de carbono após 48 horas de incubação.Lave o insert três vezes com DPBS estéril e penicilina-estreptomicina 1% para remover quaisquer células não aderidas. Em seguida, adicione meio de crescimento fresco aos poços. Retorne a placa ao incubador de cultura de tecidos e realize trocas do meio a cada 48 horas.Aqui, o PEG restritivo para células foi polimerizado como um filme fino utilizando um padrão de teste para aderir seletivamente células dissociadas à membrana revestida com colágeno de suportes permeáveis. As células foram marcadas após 48 horas de incubação. Células vivas marcadas com calc am aparecem verdes, enquanto células mortas são marcadas com homodímero de atherium um e aparecem vermelhas.Pode-se observar que ocorre uma adesão celular mínima na área contendo a película fina de PEG. Este é um exemplo de um resultado indesejável. A polimerização parcial do PEG resultou em uma construção de PEG inutilizável.A polimerização inadequada pode ocorrer devido à presença de um menisco no meio pré-polímero, quantidades insuficientes de polimerização, meio insuficiente, exposição inadequada à radiação UV ou foco incorreto da óptica. Este é um exemplo de uma má encapsulação tridimensional em duplo hidrogel de cultura de planta A-D-R-G-X. Nesta imagem, pode-se observar que os neuritos visíveis em verde foram capazes de crescer fora dos canais padronizados dos pinos.Isso geralmente ocorre quando a matriz pura transborda sobre a porção de PEG durante a injeção. Após este procedimento, outros métodos padrão, como o patch clamping ou a imunohistoquímica, podem ser realizados para responder perguntas adicionais, como a eletrofisiologia ou a expressão fenotípica.Após assistir a este vídeo, você deverá ter uma boa compreensão de como utilizar a fotolitografia por projeção de máscara dinâmica para definir a apresentação geométrica de sistemas de hidrogel simples ou duplos no estudo de culturas de células neuronais.

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Research

JoVE Journal

Bioengineering

Bioengenharia

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Fabricando degradáveis hidrogel de Thermoresponsive em várias escalas de comprimento através da extrusão reativa, microfluídica, auto-montagem e eletrofiação

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Controle da Geometria Celular através de Micropatterning Assistido por Laser Infravermelho

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Geração de Microambientes Celulares Multicue por UV-Fotopatterning de Substratos de Cultura Celular Tridimensional

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Aprenda a fabricar hidrogéis micropatterned para sistemas de cultura neural usando fotolitografia com máscara de projeção dinâmica. Este método permite criar ambientes celulares complexos para estudos de viabilidade neuronal e crescimento de neuritos.

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