Fabricação de hidrogéis micropatterned para Sistemas de Cultura Neural usando fotolitografia Projeção Dinâmica Máscara

O objetivo geral deste procedimento é criar um sistema de cultivo celular com duplo hidrogel microestruturado para estudos neuronais. Isso é realizado primeiramente cultivando implantes de tecido, como gânglios da raiz dorsal embrionários, em insertos permeáveis para cultivo celular. Em seguida, uma microestrutura é criada em um hidrogel fotoconectável utilizando um dispositivo microespelho digital ou DMD como máscara fotodinâmica.

Em seguida, adiciona-se o hidrogel autoagregante, como o Pure, que pode conter uma suspensão de células dissociadas. É necessário um tempo adequado de incubação antes da análise celular. Por fim, podem-se obter resultados que demonstram a viabilidade de células neuronais e o crescimento de neuritos por meio de configurações geométricas específicas definidas pelo DMD.

A principal vantagem desta técnica em relação aos métodos existentes é que uma massa fotodinâmica pode ser rapidamente criada, modificada e projetada à distância para acomodar praticamente qualquer substrato, como inserts permeáveis para cultivo celular. Embora este método possa fornecer informações sobre sistemas neurais, ele também pode ser aplicado a outros sistemas que se beneficiariam de restrições geométricas específicas, como sinalização celular, migração celular, contato célula a célula ou morfogênese, para citar alguns. As luzes UV do painel DMD, o guia e a lente objetiva de quatro vezes são montados verticalmente sobre uma mesa de isolamento de vibração.

Um microscópio invertido é colocado abaixo da lente objetiva de forma que a luz de foco refletida pelo DMD possa ser visualizada através do microscópio. Para obter mais detalhes sobre a configuração do DMD, consulte o protocolo escrito que o acompanha. Primeiro, prepare as seis inserções de cultura celular revestidas com colágeno para receber culturas explantes X, revestindo as paredes das inserções de cultura celular com rain x, tomando cuidado para não aplicar o rain X na própria membrana.

Em seguida, adicione 1,5 mililitros de meio aian aos insertos e incube durante a noite a 37 graus Celsius e 5% de dióxido de carbono. No dia seguinte, após colher gânglios da raiz dorsal embrionários de filhotes de rato E15, plaque até quatro GDR em cada inserto de seis poços revestido com colágeno e incube por duas horas a 37 graus Celsius e 5% de dióxido de carbono para permitir que os GDR adiram à membrana.

Após o período de incubação, os GDRs estarão prontos para a fotopolimerização. Um dispositivo digital de microespelhos é uma matriz de 1024 por 768 microespelhos individuais, que refletem seletivamente a luz com base na posição do espelho. Neste procedimento, o DMD é utilizado para direcionar luz ultravioleta sobre hidrogéis fotoativáveis CRO, criando geometrias de hidrogel especificáveis de maneira simples e rápida.

Embora o nosso DMD seja uma unidade autônoma, o dispositivo também pode ser integrado para uso com muitos microscópios existentes. Primeiro, retire as plantas DRGX do incubador e aspire todo o líquido em excesso do inserto. Em seguida, adicione 500 microlitros de meio de polimerização ao interior do inserto.

Transfira os inserções com as plantas DRGX para uma lâmina de vidro resistente à chuva e posicione a lâmina sob o DMD. Utilize o programa de interface gráfica básica ALP três para carregar a imagem em preto e branco que será usada como máscara fotográfica no DMD. Neste caso, escolheu-se uma forma bifurcada para permitir a implementação de sistemas de orientação de neuritos usando um microscópio invertido e uma fonte de luz visível DI.

Alinhe o explante tecidual com a localização apropriada na máscara fotográfica, utilizando a luz refletida pelo DMD como guia. Em seguida, troque a fonte de luz visível por uma fonte de luz UV. Ilumine o meio de polimerização dentro da cultura celular.

Insira até que a reticulação do PEG esteja completa. Repita para cada gânglio da raiz dorsal no inserto. Em seguida, lave cada inserto três vezes com solução salina tamponada com fosfato estéril contendo 1% de penicilina-estreptomicina.

Por fim, adicione 1,5 mililitros de meio de crescimento sob os insertos de cultura celular e deixe equilibrar em uma incubadora de cultura de tecidos a 37 graus Celsius e 5% de dióxido de carbono por 30 minutos. Durante o período de incubação, sonique a matriz pura por 30 minutos. Para solubilizar os peptídeos, dilua a solução fornecida de 1% para 0,15% em água estéril e complemente com um micrograma por mililitro de laminina solúvel.

Após 30 minutos, retire as culturas do incubador e aspire todo o meio em excesso do inserto. Em seguida, visualizando o vazio ao microscópio, aspire o meio de dentro da área vazada na construção de PEG, pipetando cerca de um microlitro da solução pura de matriz no vazio ao redor do explante de X. Certifique-se de que a matriz pura não transborde o vazio do pino.

Em seguida, pipete 1,5 mililitros de meio de crescimento sob o inserto e coloque no incubador de cultura de tecidos a 37 graus Celsius e 5% de dióxido de carbono durante uma hora. Para garantir a totalização após esse período, substitua o meio de crescimento e, em seguida, retorne as culturas ao incubador. O meio de crescimento é substituído a cada 48 horas de cultura.

Exemplos de construtos duplos de hidrogel contendo plantas DRGX são mostrados aqui. As plantas DRGX foram marcadas para marcadores de crescimento e proliferação. O construto de PEG polimerizado aparece cinza, os NEURITOS de DRG marcados com tubulina beta três aparecem verdes e a coloração DPI marca os núcleos celulares, visíveis em azul.

Observe que a migração celular e a extensão de retículos estão limitadas à região permissiva para células da construção de hidrogel duplo. A encapsulação em hidrogel duplo é adequada quando se utiliza qualquer gel autoagregável ou gel fotoconectável. Neste caso, o PEG atua como suporte estrutural para a apresentação geométrica do gel autoagregável.

Por exemplo, matriz pura ou aris. O tipo de gel e a escolha da máscara fotográfica dependerão da aplicação desejada específica. Trate as paredes de um inserto de cultura celular de poliéster com rain X conforme demonstrado anteriormente.

Transfira o inserto para uma lâmina revestida com rain X e coloque-a sob o DMD. Em seguida, adicione 500 microlitros de meio de polimerização ao inserto. Carregue a máscara apropriada no DMD para este experimento de sobrevivência.

Uma apresentação cilíndrica de matriz pura é utilizada para auxiliar na obtenção de imagens de células. Exponha o inserto à luz UV por 55 segundos para induzir a reticulação dos pinos após a reticulação. Lave o vazio recém-formado com DPBS estéril e penicilina-estreptomicina 1%.

Use uma micropipeta ou um aplicador estéril de algodão para remover todo o líquido em excesso do espaço vazio. Prepare o Matrixx puro por sonicador durante 30 minutos, dilua a 0,15% em água estéril, suplementado com um micrograma por mililitro de laminina solúvel e 10% de sacarose. Em seguida, pelote as células a serem cultivadas por centrifugação.

Aspire completamente o meio do pellet celular e re-suspenda o pellet numa concentração de aproximadamente cinco vezes 10 elevado a três células por mililitro na solução de matriz pura a 0,15%. É fundamental que todo o meio seja aspirado do pellet celular, pois a matriz pura inicia a auto-organização ao entrar em contato com a solução salina. Em seguida, pipete cerca de um microlitro da mistura de células em matriz pura suplementada no espaço vazio do pino.

Este volume geralmente é suficiente para preencher o espaço vazio sem transbordar, adicionando 1,5 mililitros de meio de crescimento sob o inserto. Em seguida, coloque o hidrogel secundário de matriz pura no incubador de cultura de tecidos a 37 graus Celsius e 5% de dióxido de carbono por uma hora para garantir a completa gelificação. Após esse tempo, aspire o meio e adicione meio fresco sob o inserto, tomando cuidado para não danificar a matriz pura, que é mecanicamente frágil.

Retorne as culturas ao incubador de cultura de tecidos e troque o meio a cada 48 horas de cultivo. Abaixo estão exemplos de neurônios de gânglios da raiz dorsal vivos encapsulados dentro de diversos construtos de hidrogel duplo. Após 48 horas em meio de crescimento, as células foram marcadas com cálcio, um marcador de células vivas que aparece em verde.

Aqui, devido à natureza dinâmica da máscara fotolitográfica DMD, a geometria disponível para encapsulação é limitada apenas pelas dimensões e resolução da óptica. Uma encapsulação única em hidrogel é adequada quando as células podem ser examinadas dentro de um hidrogel fotoconectável fiel à cultura de células em poliéster. Insira com rain X e posicione sob o DMD em uma lâmina revestida com rain X.

Como antes, pipete as células a serem cultivadas diretamente no meio de polimerização na concentração desejada e misture bem para garantir uma distribuição homogênea. Em seguida, pipete 500 microlitros da mistura de células no meio de polimerização no inserto. Escolha a máscara apropriada e carregue-a no DMD para induzir a reticulação de PEG mediante exposição à luz UV por 55 segundos.

Para estudos de sobrevivência celular, uma máscara circular básica é utilizada para representar um cilindro; lave o inserto três vezes com DPBS estéril e penicilina-estreptomicina a 1%, em seguida pipete 1,5 mililitro de meio de crescimento sob o inserto e quantidade suficiente de meio de crescimento por cima para imergir completamente o inserto. Incube a 37 graus Celsius e 5% de dióxido de carbono, com trocas de meio a cada 48 horas. Abaixo, temos um exemplo de neurônios corticais dissociados vivos encapsulados dentro do PEG. Células vivas são marcadas com amida de cálcio e aparecem verdes, enquanto células mortas são marcadas com homodímero de AHy um e aparecem vermelhas.

A encapsulação em PEG destina-se apenas como um exemplo, pois o PEG não representa um ambiente ideal para células neurais. A geometria escolhida representa um meio simples para estudar a viabilidade celular, mas pode ser adaptada a uma ampla gama de estruturas. Hidrogéis em filme fino podem ser usados para gerar padrões específicos de restrição celular.

Novamente, trate o inserto de cultura celular de poliéster com rain X como antes e coloque-o sobre uma lâmina tratada com rain X. Em seguida, pipete de 250 a 300 microlitros de meio de polimerização no fundo do inserto de cultura celular tratado. Esse volume é suficiente para cobrir apenas o fundo do inserto; incube em temperatura ambiente por 30 a 45 minutos para permitir que o meio permeie a membrana do inserto. Aspire o meio em excesso do inserto com uma micropipeta.

Em seguida, pipete uma quantidade suficiente de óleo transparente ao UV no fundo do inserto para cobrir completamente a área. Incube o inserto à temperatura ambiente por 15 a 30 minutos, tempo suficiente para que o óleo forme uma camada distinta acima do meio de polimerização. Para saturar a membrana do inserto, carregue uma máscara apropriada no DMD.

Após posicionar o inserto e a lamínula sob o DMD, induza a reticulação por exposição à luz ultravioleta. Lave o inserto três vezes com DPBS estéril e 1% penicilina-estreptomicina; após a lavagem, transfira o inserto para uma placa de cultura de tecidos de seis poços, colete e pelletize as células a serem cultivadas. Aspire o meio e ressuspenda o pellet celular no meio de crescimento na concentração desejada, entre 10⁴ e 10⁶ células por mililitro.

Em seguida, pipete um volume suficiente da suspensão celular no interior do inserto de cultura celular para obter a densidade celular desejada. Adicione meio de crescimento suficiente abaixo do inserto para manter completamente a viabilidade celular. Incube a 37 graus Celsius e 5% de dióxido de carbono após 48 horas de incubação.

Lave o insert três vezes com DPBS estéril e penicilina-estreptomicina 1% para remover quaisquer células não aderidas. Em seguida, adicione meio de crescimento fresco aos poços. Retorne a placa ao incubador de cultura de tecidos e realize trocas do meio a cada 48 horas.

Aqui, o PEG restritivo para células foi polimerizado como um filme fino utilizando um padrão de teste para aderir seletivamente células dissociadas à membrana revestida com colágeno de suportes permeáveis. As células foram marcadas após 48 horas de incubação. Células vivas marcadas com calc am aparecem verdes, enquanto células mortas são marcadas com homodímero de atherium um e aparecem vermelhas.

Pode-se observar que ocorre uma adesão celular mínima na área contendo a película fina de PEG. Este é um exemplo de um resultado indesejável. A polimerização parcial do PEG resultou em uma construção de PEG inutilizável.

A polimerização inadequada pode ocorrer devido à presença de um menisco no meio pré-polímero, quantidades insuficientes de polimerização, meio insuficiente, exposição inadequada à radiação UV ou foco incorreto da óptica. Este é um exemplo de uma má encapsulação tridimensional em duplo hidrogel de cultura de planta A-D-R-G-X. Nesta imagem, pode-se observar que os neuritos visíveis em verde foram capazes de crescer fora dos canais padronizados dos pinos.

Isso geralmente ocorre quando a matriz pura transborda sobre a porção de PEG durante a injeção. Após este procedimento, outros métodos padrão, como o patch clamping ou a imunohistoquímica, podem ser realizados para responder perguntas adicionais, como a eletrofisiologia ou a expressão fenotípica.

Após assistir a este vídeo, você deverá ter uma boa compreensão de como utilizar a fotolitografia por projeção de máscara dinâmica para definir a apresentação geométrica de sistemas de hidrogel simples ou duplos no estudo de culturas de células neuronais.