Estudando Trajetórias celular Rolamento no Patterns Receptor Asymmetric
13 de fevereiro de 2011
Nós descrevemos um protocolo de observar e analisar as trajetórias de células rolando no assimétrica receptor-padrão substratos. Os dados resultantes são úteis para a engenharia de receptor-padrão substratos para a etiqueta livre de separação de células e análise.
Este protocolo observa e analisa trajetórias de rolamento celular em padrões de receptores assimétricos para facilitar a engenharia de substratos com padrões de receptores para separação e análise de células sem marcação. Comece com a impressão por microcontato de moléculas de PEG sobre um substrato de ouro para criar padrões alternados de monocamadas auto-organizadas, seguido pelo preenchimento do substrato com P-selectina e receptores. Em seguida, incorpore o substrato à câmara de fluxo. Introduza as células HL-60 na câmara.
Registre uma sequência de imagens da interação de rolamento de células HL 60 em padrões de P-selectina e analise as imagens convertidas a partir do vídeo. As trajetórias do rolamento, o rastreamento da borda celular, o comprimento e as velocidades de rolamento em planos, regiões e bordas podem ser obtidos usando um programa MATLAB. Este método pode fornecer informações sobre como as células HO 60 se movem sobre padrões assimétricos de receptores sob fluxo de cisalhamento.
Isso pode ser aplicado para quantificar interações com outras superfícies celulares, análise direta das células mediante a observação de suas trajetórias em padrões de receptores e para o projeto de dispositivos microscópicos de fixação para separação celular. A microimpressão por contato é utilizada para criar padrões alternados de monocamadas auto-organizadas de moléculas de peg sobre um substrato de ouro.
Primeiro, encharque o carimbo de PDMS com uma solução de PEG cinco milimolar em etanol. Seque a superfície por 20 minutos. Coloque suavemente o carimbo sobre a superfície de ouro por 40 segundos e certifique-se de que haja um bom contato entre a superfície de ouro e o carimbo.
Nenhuma pressão excessiva é necessária. Enxágue a superfície com etanol e seque sob um fluxo de nitrogênio. Agora, utilizando uma câmara de perfusão, incube os substratos com solução de P-selectina a 15 microgramas por mililitro durante três horas à temperatura ambiente para padronizar as áreas restantes com P-selectina, enxágue a câmara e, em seguida, complete as superfícies com BSA a um miligrama por mililitro durante uma hora para bloquear interações inespecíficas.
Lave a superfície com tampão DPBS antes de realizar o experimento de rolamento celular. Monte a câmara de fluxo e, em seguida, faça passar uma suspensão de 10 à quinta células por mililitro. Células HL 60 sobre o padrão, superfícies em uma câmara de fluxo retangular com ângulos de inclinação do padrão de receptor de 10 graus.
À temperatura ambiente de 24,5 graus Celsius. Ajuste a bomba de seringa para gerar uma taxa de fluxo de 75 microlitros por minuto, com tensão de cisalhamento laminar correspondente de 0,5 dina por centímetro quadrado. Agora, com um microscópio invertido e câmera acoplada, grave o rolamento das células HL 60.
Interações com p adesivo, selecione e substratos. Utilize uma objetiva de quatro x a uma taxa de um quadro por segundo durante períodos de 300 segundos. Realize três experimentos independentes.
Apresente os dados como média e desvio padrão dos valores médios obtidos de cada experimento. As imagens de microscópio convertidas a partir do vídeo de HL 60. Rolling. Interações com substratos adesivos p-selectina demonstram regiões claras e escuras correspondentes às regiões de receptor p-selectina e PEG, respectivamente.
As trilhas são delimitadas usando um programa personalizado em MATLAB aqui. O ângulo de inclinação da borda foi de 10 graus e a tensão de cisalhamento foi de 0,5 dina por centímetro quadrado. Análises adicionais são baseadas na distribuição do comprimento de rastreamento da borda, no valor médio do comprimento de rastreamento da borda, bem como em VE e VP, as velocidades de rolamento na borda e no interior das faixas.
Após assistir a este vídeo, você deverá ter uma boa compreensão de como examinar as trajetórias celulares em padrões assimétricos de receptores.
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Visão Geral
Este protocolo observa e analisa trajetórias de rolamento celular em padrões de receptores assimétricos para facilitar a engenharia de substratos com padrões de receptores para separação e análise de células sem marcação.
Componentes Principais do Estudo
Área de Ciência
- Biologia celular
- Biomateriais
- Microfluídica
Contexto
- A rolagem celular é um processo crítico em diversas interações biológicas.
- Padrões assimétricos de receptores podem influenciar o comportamento celular.
- Técnicas livres de marcadores são essenciais para separação e análise de células.
- A microgravura por contato é um método útil para criar substratos com padrões definidos.
Objetivo do Estudo
- Desenvolver um protocolo para observar o rolamento celular em substratos com padrões de receptores.
- Analisar as trajetórias de células em rolamento para melhorar a engenharia de substratos.
- Fornecer insights sobre a dinâmica de movimento celular sob condições de fluxo.
Métodos Utilizados
- Microcontato impressão de moléculas de PEG sobre um substrato de ouro.
- Criação de padrões alternados de monocamadas auto-organizadas.
- Preenchimento reverso do substrato com P-selectina e receptores.
- Incorporação da câmara de fluxo e imagem de células HL-60 rolantes sobre os padrões.
Resultados Principais
- Foram registradas sequências de imagens das interações de células HL-60.
- As trajetórias de células rolantes foram analisadas usando MATLAB.
- Foram obtidos dados sobre o comprimento do rastreamento de borda e as velocidades de rolamento.
- Foram fornecidas informações sobre o movimento celular em padrões assimétricos de receptores.
Conclusões
- O protocolo permite a análise detalhada da dinâmica do rolamento celular.
- Padrões assimétricos de receptores podem ser projetados para separação eficaz de células.
- Este método contribui para a compreensão do comportamento celular em fluxo de cisalhamento.
Perguntas Frequentes
Relevância Executiva para a Indústria
O entendimento das trajetórias de rolamento celular em padrões assimétricos de receptores permite o projeto racional de dispositivos de separação microfluídicos livres de marcadores. Este protocolo fornece dados quantitativos sobre o comprimento do rastreamento de borda e a velocidade de rolamento sob tensão de cisalhamento definida, apoiando a modelagem preditiva do comportamento celular em fluxo. Essas informações reduzem a iteração empírica na engenharia de dispositivos para fluxos de trabalho de purificação celular e análise fenotípica.
Aplicações Estratégicas em P&D de Biotecnologia Farmacêutica
Descoberta Inicial e Validação de Alvos
- Valor Científico: Permite a investigação da cinética de ligação ligante-receptor sob cisalhamento fisiológico, contribuindo para a validação de alvos em vias mediadas por adesão.
- Valor Operacional: Oferece um método livre de marcadores para avaliar a atividade funcional do receptor sem etiquetas fluorescentes ou repórteres genéticos.
Desenvolvimento de Triagem e Ensaio
- Valor Científico: Gera leituras quantitativas da velocidade de rolamento celular e do comprimento de rastreamento da borda para análise comparativa entre densidades de receptores ou geometrias de padrão.
- Valor Operacional: Padroniza a preparação do substrato por meio de impressão por microcontato e integração da câmara de fluxo para ensaios de adesão reprodutíveis.
Pesquisa Translacional e Pré-clínica
- Valor Científico: Apoia a redução de riscos mecanicistas em estratégias de separação baseadas em adesão, vinculando o design do padrão de receptores aos resultados observáveis nas trajetórias celulares.
- Valor Operacional: Permite a triagem de fenótipos celulares com base no comportamento de rolamento, útil para enriquecer subpopulações em modelos pré-clínicos.
Integração de Pipeline e Fluxo de Trabalho
O método se insere na fase inicial de descoberta para orientar o desenvolvimento de ensaios e a geração de ferramentas pré-clínicas, especialmente para alvos nos quais a adesão sob fluxo é uma leitura funcional.
- Biologia da Descoberta: Facilita a verificação de hipóteses sobre interações receptor-ligante em fluxo sob cisalhamento, esclarecendo as contribuições mecanicistas ao rolamento celular.
- Triagem: Fornece métricas padronizadas e quantitativas de adesão, permitindo a comparação de linhagens celulares ou moduladores de receptores.
- Análise: Gera distribuições de comprimento de rastreamento de borda e velocidade de rolamento, fornecendo base estatística para comparação entre condições.
- Pesquisa Translacional: Relaciona a dinâmica de rolamento in vitro com a utilidade potencial em dispositivos de separação celular sem marcadores para processamento de amostras pré-clínicas.
- Reutilização Empresarial: Estabelece uma plataforma reutilizável para avaliação do comportamento celular mediado por adesão em múltiplos alvos e tipos celulares.
Impacto Operacional e Empresarial
- Valor Científico: Aumenta a confiança preditiva em mecanismos de separação baseados em adesão ao quantificar parâmetros de trajetória sob cisalhamento controlado.
- Valor Operacional: Garante reprodutibilidade por meio da padronização da impressão por microcontato, preenchimento de receptores e configuração da câmara de fluxo.
- Valor Estratégico: Reduz o risco biológico em estágios avançados do desenvolvimento de dispositivos ao permitir a validação funcional precoce de padrões de receptores.
- Impacto no Portfólio: Apoia decisões de prosseguir/interromper tecnologias de separação em microfluídica ao fornecer dados empíricos sobre o desempenho dos padrões.
Considerações sobre a Implementação
- Requer experiência em microcontato litográfico, química de superfície e controle de fluxo microfluídico.
- Depende do acesso a microscopia invertida de campo claro, câmera de alta velocidade e ferramentas baseadas em MATLAB para rastreamento de partículas.
- Necessita padronização entre equipes na fabricação de substratos e na documentação das condições de fluxo para reprodutibilidade em múltiplos locais.
- A adaptação a tipos celulares alternativos exige validação dos pares ligante-receptor e otimização dos parâmetros de tensão de cisalhamento.
- Limitado pela natureza transitória das interações nas bordas celulares, o que restringe a reconstrução completa das trajetórias e exige análise segmentada.
