Name: Eletrofisiologia da Scorpion Peg sensilla (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-04-13T13:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 50 s
Description: Aprenda a técnica de eletrofisiologia para estudar a fisiologia quimiossensorial de sensilas individuais em escorpiões. Este método de gravação extracelular permite isolar estímulos químicos e investigar respostas neurais específicas.

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Agradecemos do fundo de Vida, Universidade de Oklahoma Graduação de Pesquisa do Programa Oportunidades, e do Departamento de Zoologia para o financiamento deste trabalho. Agradecemos também Hoefnagels Dr. Marielle para ajudar a editorial.

1. Pré-gravação, Preparação Animais Vivos <ol><li> Remova o escorpião do seu jar casa e colocá-lo em um recipiente de vidro pré-refrigerados; seguinte, coloque o jar contendo o escorpião em um ambiente de congelamento (-5 ° C) por um período mínimo de dois minutos. Este tempo pode variar de acordo com a idade, tamanho, espécies, etc do escorpião específica em estudo. Mas, geralmente, a fase de ambiente de congelamento é completo quando o animal está imóvel. </li><li> Depois de dois minutos, retire o escorpião imobilizado do recipiente de vidro frio, e colocá-lo lado ventral para cima sobre uma lâmina de microscópio. Segura o ferrão, cauda, ​​pernas e pedipalpos com barro moldável (à base de óleo, Van Aken Plastalina). </li><li> Tornar uma plataforma na qual a colocar pectinas do escorpião. Ajustar o comprimento da plataforma e largura de acordo com o tamanho do pecten. Tipicamente, as nossas plataformas são construídos a partir de tampa de vidro do microscópio e são aproximadamente 10 (L) X 18 mm (W). </li><li> Aderem fita dupla face adesiva para a plataforma pecten, aparando a fita (se necessário) para se adequar. </li><li> Para fazer com que uma câmara pectínios, coloque três dos quatro lados da plataforma, em pré-fundido de cera (que usam chips de cera de abelha 100%) a uma profundidade de 3-4 mm. Nós derreter a cera, colocando as fichas em uma placa de Petri de vidro, localizada em uma chapa quente. Uma vez que a cera nas bordas da câmara de pectínios é resfriado a temperatura ambiente, este deve criar paredes de cera cerca de 1 mm de altura. </li><li> Sobre o animal, localizar o ponto de inserção pectínios, e coloque a borda un-encerado da plataforma (fita up-side) imediatamente posterior a ele. Depois, estabilizar a plataforma (para que ele não se moverá mais tarde) pressionando suavemente a sua direita e esquerda bordas periféricas contra o barro utilizado para limitar as pernas do animal. </li><li> Use uma pinça de ponta fina, coloque cuidadosamente a pecten pectinas ou no interior da câmara. Especificamente, usando uma pinça, segure o pecten ao longo da espinha pectínios, e gentilmente trazer o pecten de baixo da tampa de vidro e abaixá-lo para o chão plataforma adesivo. Estabelecer um vínculo pecten-para-fita com cuidado de aplicar pressão sobre a coluna pectínios. </li><li> Agora, aplique cera derretida (nós usamos uma espátula de metal pré-aquecido) até a borda un-encerado da plataforma. O objetivo é duplo, para garantir a pecten e para envolver completamente a câmara para futura introdução de óleo mineral. Tenha cuidado ao aplicar a cera sobre pecten do animal, como é possível danificar o pecten com cera que é muito quente. </li><li> A construção da câmara pecten está completa. Em seguida, estabeleça uma conexão eletrodo indiferente com hemolinfa do animal através da inserção de um fio de prata entre dois segmentos da cauda. </li></ol> 2. Gravação simultânea Extracelular e Estimulação Química <ol><li> Nós preparamos o animal 24 horas antes da realização extracelular, tip-gravações, que, entre outras razões (ou seja, ajuste de posição fixa para animais), dá tempo para fazer custom-pipetas de um estimulante específico (sensillum-dependente) da ponta de diâmetro. Usamos um extrator micropipeta para se alcançar tais especificações. Idealmente, o diâmetro das pipetas é ≈ 2 M maior do que o diâmetro dos poros sensillar. Nós ajustamos nossas especificações micropipeta de acordo para cada animal. </li><li> 1 h antes da gravação, adicionar 5 mL de óleo mineral para a câmara de pectínios, submergindo o pecten sob óleo. Então, a posição do animal debaixo de um microscópio de alta potência, que há muito trabalho a distância e objetivos epi-iluminação. </li><li> Para estimular quimicamente peg sensilla, introduzimos tastants aquoso (ou seja, ácido cítrico e sal) por meio de óleo. Primeiro, usamos um enchimento micropipeta para injetar o estimulante para a pipeta estimulante. Nota: todas as soluções estimulante deve conter um eletrólito de condutância elétrica. </li><li> Em seguida, após o posicionamento da pipeta estimulante em um micromanipulador (no equipamento de gravação), insira o eletrodo de registro para o fim, sem corte aberto da pipeta estimulante. É importante para garantir o contato entre o eletrodo de metal e uma solução eletrolítica estimulante. </li><li> Uma vez que a preparação é eletricamente aterrado (através do eletrodo indiferente), simplesmente diminuir a pipeta através do meio de petróleo e em um poro sensillar. A duração da estimulação química por sensillum pectínios pode variar de tanto quanto 30 minutos para apenas um segundo. Geralmente, podemos amostra pinos múltiplos (&gt; 30) por pipeta. No caso em que a pipeta estimulantes torna-se obstruídas por escombros minuto, simplesmente trocar a pipeta entupidos de uma pipeta, nova sem uso. </li></ol> 3. Preparação de um animal por vários dias de Experimentação <ol><li> Se o animal deve ser usado durante um período de tempo prolongado, recomendamos a reutilização da câmara pectínios e substituindo a gota de óleo mineral para cada sessão de gravação. Após a sessão de um determinado dia de gravação estiver concluída, remova o animal a partir da gravação de set-up e fazer uma lavagem de óleo mineral. </li><li> Specifically, adicionar uma gota (5 L) de óleo mineral para a câmara, e remover todo o óleo. Isso ajuda a minimizar a presença de estimulantes residual, o que pode ter vazado para fora da pipeta durante a sessão de gravação. </li><li> Antes da próxima sessão, adicione uma gota de óleo como descrito anteriormente. </li></ol> 4. Resultados representativos: Dependendo do equipamento de gravação utilizado (por exemplo, o amplificador particular, digitalização hardware, etc), um resultado representativo é uma gravação extracelular com um S: N proporção de pelo menos 3:1. Sucesso na construção da câmara de óleo mineral é necessário para isolar a estimulação química sensilla individual, uma vez que fornece um meio para a entrega tastants química polar (à base de água) 8. Se houver óleo muito pouco ou mesmo nenhum, a solução vai se espalhar estimulante do sensillum gravadas ao seu sensilla vizinhos, o que é susceptível de causar um ataque prolongado e descontrolado de químicos estimulação 8.

<ol><li>Hodgson, E. S., Lettvin, J. Y., Roeder, K. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Physiology+of+a+Primary+Chemoreceptor+unit%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Physiology of a Primary Chemoreceptor unit.</a> Science. 12, 417-418 (1955).</li>
<li>Newland, P. L. Taste processing in the insect nervous system. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aNewland%2C+PL+%22Methods+in+Insect+Sensory+Neuroscience%22">Methods in Insect Sensory Neuroscience</a>. Christensen, T. A. , CRC Press. Boca Raton. 289-318 (2005).</li>
<li>Foelix, R. F., Müller-Vorholt, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+fine+structure+of+scorpion+sensory+organs+II.+Pecten+sensilla%5BTitle%5D)+AND+%22Bull.+Br.+Arachnol.+Soc%22%5BJournal%5D)">The fine structure of scorpion sensory organs II. Pecten sensilla.</a> Bull. Br. Arachnol. Soc. 6, 68-74 (1983).</li>
<li>Carthy, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fine+structure+and+function+of+the+sensory+pegs+on+the+scorpion+pecten%5BTitle%5D)+AND+%22Experientia%22%5BJournal%5D)">Fine structure and function of the sensory pegs on the scorpion pecten.</a> Experientia. 22, 89-91 (1966).</li>
<li>Gaffin, D. D., Brownell, P. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Response+properties+of+chemosensory+peg+sensilla+on+the+pectines+of+scorpions%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Comp.+Physiol.+A%22%5BJournal%5D)">Response properties of chemosensory peg sensilla on the pectines of scorpions.</a> J. Comp. Physiol. A. 181, 291-300 (1997).</li>
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<li>Gaffin, D. D., Brownell, P. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electrophysiological+evidence+of+synaptic+interactions+within+chemosensory+sensilla+of+scorpion+pectines%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Comp.+Physiol.+A%22%5BJournal%5D)">Electrophysiological evidence of synaptic interactions within chemosensory sensilla of scorpion pectines.</a> J. Comp. Physiol. A. 181, 301-307 (1997).</li>
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<li>Knowlton, E. D., Gaffin, D. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+new+tip-recording+method+to+test+scorpion+pecten+chemoresponses+to+water-soluble+stimulants%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci+Methods%22%5BJournal%5D)">A new tip-recording method to test scorpion pecten chemoresponses to water-soluble stimulants.</a> J. Neurosci Methods. , Forthcoming Forthcoming.</li>
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<li>Bland, R. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sensilla+on+the+antennae%2C+mouthparts%2C+and+body+of+the+larva+of+the+alfalfa+weevil%2C+hypera+postica+%28gyllenhal%29+%28Coleoptera+%3A+Curculionidae%29%5BTitle%5D)+AND+%22Int.+J.+Insect+Morphol.+Embryol%22%5BJournal%5D)">Sensilla on the antennae, mouthparts, and body of the larva of the alfalfa weevil, hypera postica (gyllenhal) (Coleoptera : Curculionidae).</a> Int. J. Insect Morphol. Embryol. 12, 261-272 (1983).</li>
<li>Cate, H. S., Derby, C. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hooded+Sensilla+Homologues%3A+Structural+Variations+of+a+Widely+Distributed+Bimodal+Chemomechanosensillum%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Comp.+Neurol%22%5BJournal%5D)">Hooded Sensilla Homologues: Structural Variations of a Widely Distributed Bimodal Chemomechanosensillum.</a> J. Comp. Neurol. 444, 345-357 (2002).</li>
</ol>

Temos publicados anteriormente estes métodos em dois jornais, Knowlton e Gaffin (2009) e Knowlton e Gaffin (no prelo).

O protocolo acima descreve como preparar um deserto pastagens escorpião (Paruroctonus utahensis) para estudo eletrofisiológico. Especificamente, mostramos como construir uma câmara de controle extracelular ponta gravações de pectínios neurônios chemosensory sob óleo. Porque água e óleo não se misturam, é possível isolar a estimulação química (com base de água estimulantes) para sensilla único. Deve-se ressaltar que P. utahensis, é um animal relativamente pequeno (≈ 2,5-5 cm) e aplicando este protocolo para animais maiores podem exigir ajustes de tamanho de muitos, tais como o tamanho da plataforma do animal, de câmara, e quantidade de óleo aplicado. Recomendamos a realização de estudos-piloto para testar a quantidade mínima de óleo necessária para liberação controlada de estimulantes à base de água química. Além disso, não houve efeito do óleo sobre a atividade neural de base dentro pectínios sensilla 8. Este deve ser confirmado para sistemas de outro modelo, bem como, antes de avaliar chemoresponsiveness. Este método pode ser usado em conjunto com outro método para testar efeitos de interação entre chemoresponse sensilla no campo sensorial. Por exemplo, é possível registrar-ponta (em óleo) a partir de uma base de sensillum como registro (através de um eletrodo de tungstênio) de uma sensillum vizinhos 9. Essa configuração de gravação pode ser usada para avaliar se deve ou não quimicamente estimulando uma sensillum afeta a atividade neural do sensillum-base registrados. Até o momento, ninguém testou isso por escorpião pectínios sensilla, e permanece uma questão em aberto para outros sistemas chemosensory também. Para resumir, nós achamos que o método de gravação de ponta em avanços de petróleo do âmbito de investigações eletrofisiológicas para a base neural da gustação artrópodes. Neste manuscrito, nós fornecemos um protocolo para a preparação de animais para este método, e esperamos que fornece uma base sólida para um estudo mais aprofundado de periféricos sensoriais sistema nervoso.

<table><tbody><tr><td>Guia Lift-N-Press</td><td>Ted Pella, Inc.</td><td>16082</td><td>Adesivo dupla face</td></tr><tr><td>MicroFil</td><td>World Precision Instruments, Inc.</td><td>MF34G</td><td>Enchimento para micropipeta</td></tr><tr><td>Capilares de Vidro Padrão</td><td>World Precision Instruments, Inc.</td><td>1B100F-6</td><td>Pipetas de vidro</td></tr><tr><td>Suporte para micr&amp;#8211;eletrodo</td><td>World Precision Instruments, Inc.</td><td>MEH3SBW10</td><td></td></tr></tbody></table>

eletrofisiologia da scorpion peg sensilla

Electrophysiology of Scorpion Peg Sensilla

Nós descrevemos uma modificação de uma técnica existente 1,2 ponta de gravação para eletrofisiologicamente investigando curto, peg-like sensilla sensoriais 3,4. Na superfície ventral de todos os escorpiões são dois apêndices chamados pectinas, que têm campos densos de mecano-peg e chemosensory sensilla 5,6. Um método para avaliar chemoresponsiveness destes sensilla usa um eletrodo de tungstênio para extracelularmente gravação atividade neural dentro de um sensillum como um odorant volátil é introduzido no campo sensorial 5,7. As limitações deste método incluem a coleta de dados lento e estimulante introdução não controlada, e remoção de, no campo peg. Para superar essas limitações, desenvolvemos uma técnica de ponta de gravação de novo que usa óleo mineral apolares como um meio através do qual a entregar à base de água tastants para indivíduo peg sensilla 8,9. Nós temos aplicado com sucesso este método para obter chemoresponses sensillar ao ácido cítrico, etanol e sal. Aqui nós descrevemos o protocolo experimental para tal estudo 9. Nós pensamos que este novo método pode ser útil para estudar as propriedades de resposta de outros artrópodes chemosensory sistemas, incluindo os dos insetos 10, 11 e 12 de crustáceos.

Este artigo descreve um método eletrofisiológico para isolar a estimulação química sensilla individuais via extracelular, tip-gravações sob óleo mineral.

Eletrofisiologia da Scorpion Peg sensilla

Descrevemos uma modificação de uma técnica de registro por ponta já existente1,2 para a investigação eletrofisiológica de sensilas sensoriais curtas, em formato de pino3,4. No...

O objetivo geral deste procedimento é estudar a fisiologia quimiossensorial de um único pecten em um pecten de escorpião. Isso é realizado primeiramente imobilizando-se um escorpião anestesiado com o lado ventral voltado para cima sobre uma lâmina de vidro. Utilizando massa de modelar para fixar o espécime, é necessário submergir os pectens em uma câmara personalizada cheia de óleo e preparar eletrodos preenchidos com um estimulante químico.As respostas sensoriais químicas são registradas em ilos individuais do pecten, que acabam produzindo perfis de resposta semelhantes aos estímulos químicos aquosos. Utilizávamos para registrar a partir da base do ilo enquanto soprava estímulos voláteis através dos poros. A principal vantagem da técnica de registro na ponta é que ela permite isolar a estimulação a um único pecten sem afetar a atividade dos seus vizinhos.Este método pode nos ajudar a responder perguntas fundamentais na área da biologia quimiossensorial, por exemplo, por que os animais utilizam tantos cílios repetidos na detecção e percepção química? Os escorpiões podem não parecer os animais mais seguros para estudar, no entanto, nem todas as espécies são perigosas ou difíceis de lidar. Por exemplo, os escorpiões dos campos áridos têm apenas quatro a cinco centímetros de comprimento, são fáceis de manter em laboratório e raramente picam se manipulados corretamente.Se for picado, o veneno ativa artificialmente seus neurônios sensoriais, alguns dos quais transmitem informações de dor. A sensação geralmente diminui em cerca de 15 minutos. Os escorpiões são organismos resistentes e podem suportar vários dias de experimentação, sendo frequentemente devolvidos aos seus habitats.Quando o experimento estiver concluído para imobilizar o escorpião, coloque-o em um recipiente de vidro previamente resfriado. Em seguida, coloque o frasco contendo o escorpião em um ambiente congelante por um mínimo de dois minutos e retire-o do congelador quando o animal estiver imóvel. Agora, posicione o escorpião imobilizado com a face ventral voltada para cima sobre uma lâmina de microscópio.Fixe as patas da cauda com ferrão e os pedipalpos com argila moldável. Os peignes do escorpião são estruturas pareadas semelhantes a pentes localizadas próximo aos órgãos sexuais e são exclusivas desses animais. Deve-se criar uma câmara para conter um único peigne sem removê-lo do animal.Primeiro, faça uma plataforma para a pectina ajustar-se a uma lâmina de vidro cortada com aproximadamente cinco milímetros por 18 milímetros. Geralmente funciona bem. Em seguida, adicione fita adesiva dupla face à plataforma e corte a fita para ajustá-la, se necessário.Terceiro, derreta algumas lascas de cera de abelha a 100% em um recipiente de vidro utilizando uma placa aquecedora. Em seguida, mergulhe três das quatro bordas da plataforma na cera derretida até uma profundidade de três a quatro milímetros. A cera resfriada atua como uma parede, formando uma câmara.Agora, posicione a borda livre da plataforma logo posterior ao ponto de inserção peitoral no animal. Estabilize a plataforma pressionando suavemente suas bordas periféricas direita e esquerda contra a argila usada para imobilizar as patas do animal, utilizando pinças de ponta fina. Segure cuidadosamente um dos pectinos ao longo da espinha peitoral e retire-o suavemente de sob o lamínula, colocando-o em seguida sobre a superfície adesiva da plataforma.Fixe a pectina aplicando cuidadosamente pressão sobre a espinha pectal. Complete a câmara usando uma espátula metálica pré-aquecida para aplicar cera derretida na borda livre da plataforma. O animal está agora quase pronto para realizar gravações de eletrofisiologia.Agora é um bom momento para fazer uma conexão com um eletrodo indiferente. Insira um fio de prata entre dois segmentos da cauda no hemolinfa do escorpião. Pressione parte do fio que sai do animal contra a argila para fixá-lo, deixando comprimento suficiente para alcançar o amplificador.Agora, deixe o preparo de lado por pelo menos uma hora antes de realizar as gravações, para permitir que o preparo se estabilize. Use um puxador de micropipetas para fabricar pipetas com diâmetro interno cerca de dois mícrons maior que o diâmetro do poro do sensor, o qual varia entre os animais. Uma hora antes da gravação, encha a câmara de pectina com cinco microlitros de óleo mineral.Em seguida, posicione o animal sob o microscópio de alta potência com objetivas de longa distância de trabalho e iluminação epi para estimular quimicamente a peg illa. Carregue a pipeta do estimulante com sabores aquosos misturados em uma solução eletrolítica. Usando um enchimento para micropipeta, conecte então a pipeta carregada com o estimulante a um micromanipulador.Agora insira o eletrodo de registro na extremidade aberta da pipeta do estimulante. É importante garantir o contato entre o eletrodo metálico e a solução eletrolítica do estimulante. Conecte os cabos dos eletrodos de registro e indiferente a um amplificador diferencial.O amplificador está conectado a um osciloscópio para visualizar a atividade elétrica e a uma caixa acústica para detectar alterações elétricas auditivamente. A montagem agora está pronta para realizar gravações. Utilizando o micromanipulador, abaixe cuidadosamente a pipeta sobre um poro sensorial.Uma mudança para frequências mais altas será ouvida quando o contato elétrico for estabelecido entre o eletrólito da pipeta e o fluido dentro do sensilo em pino. Nesse momento, também podem ser ouvidos os estalos distintos dos potenciais de ação neural. A duração da estimulação química por sensilo perpétuo pode variar de até 30 minutos a apenas um segundo.Normalmente, uma pipeta pode amostrar mais de 30 pinos. Substitua pipetas entupidas por pipetas limpas. As pipetas são fáceis de preparar e o entupimento não é incomum, portanto mantenha sempre pipetas extras prontas para uso.É possível realizar a gravação de um único animal por várias horas em uma única sessão de gravação antes de precisar trocar o óleo mineral. Um único animal pode ser mantido no lugar no aparato de gravação por múltiplas sessões de gravação ao longo de vários dias consecutivos. Para sessões subsequentes, reutilize a câmara pectoral, mas substitua o óleo mineral.Basta remover todo o óleo antigo com uma pipeta e adicionar uma nova gota. Isso ajuda a minimizar a presença de estimulante residual, que pode ter vazado da pipeta de estimulante durante a sessão de gravação. Abaixo estão gravações representativas das pontas em resposta a diferentes estimulantes.Este traçado mostra uma resposta relativamente consistente ao cloreto de potássio 0,01 molar. Este pino envia resposta ao ácido cítrico 0,1 molar, que começa de forma muito mais intensa e depois diminui em intensidade dentro de uma fração de segundo, seguida por alguma redução na frequência. Em uma resposta típica ao etanol 30%, o traçado mostra rajadas com múltiplos picos entre breves intervalos de inatividade ao comparar gravações de ponta das respostas de diferentes sensores ao mesmo estimulante, como o ácido cítrico 0,1 molar.As respostas são muito semelhantes. Ao tentar este procedimento, é importante lembrar-se de encher a pipeta com um estimulante à base de água, que não se mistura com o meio oleoso e permite estimular quimicamente um lum de cada vez. Após assistir a este vídeo, você deverá ter uma boa compreensão de como estimular de forma controlada CINs individuais em um pecten de escorpião utilizando óleo mineral como meio.

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