Name: Estabelecimento e propagação de Tumores Humanos em Retinoblastoma Imune camundongos deficientes (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-08-04T13:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 55 s
Description: Aprenda a estabelecer tumores ortotópicos de retinoblastoma humano em camundongos imunodeficientes. Este método permite estudar a biologia tumoral e testar intervenções terapêuticas in vivo.

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Financiamento para este projeto é fornecido pela Fundação Clayton para a Investigação e da Fundação de Pesquisa Retina.

1. Preparação de tumorspheres retinoblastoma <ol><li> Obtenção de amostra de tumor retinoblastoma em um IRB-aprovado protocolo. </li><li> Prepare fresca media de células-tronco definido (Neurobasal-A mídia, 1X B-27 suplemento menos vitamina A, 1X não essenciais solução de aminoácidos, L-glutamina 1X, 20 ng / mL EGF, 10 ng / mL bFGF). </li><li> Mecanicamente desagregar o tecido tumoral com um bisturi, usando uma técnica transversal em um tecido estéril, a cultura tratados com seis bem-chapa. Imediatamente adicione 100 mL de mídia células-tronco para definir o tecido e delicadamente espalhar o tecido picada usando o bisturi. Adicionar 5 mL dos meios de comunicação de células-tronco definido para o bem. </li><li> Incubar a 37 ° C, 5% de CO 2 em uma incubadora umidificada e inspecionar diariamente. Alguns tumorspheres deve surgir a partir do tecido tumoral interrompido quase imediatamente, com um número crescente ao longo de 2-4 dias. </li><li> Semanais, tumorspheres centrifugue a 300xg por 5 minutos, ressuspender em recém-preparados media células-tronco definido, e pipeta cima e para baixo 10 vezes para interromper maior, esferas de necrose central e permitir que novas esferas saudáveis ​​a se formar. </li></ol> 2. Preparação de células tumorais para injecção <ol><li> Se injetar tumorspheres cultivadas, gentilmente esferas pipeta para um tubo de 15 mL cônico. Pipeta suavemente para cima e para baixo com uma pipeta sorológica 10-15 vezes de interromper as esferas. </li><li> Contar as células a ser injetado através de um hemocitômetro, e alíquota, pelo menos, 50 mil células por injeção em um novo tubo. Prepare-se para muitos como injeções possível com base no número de células disponíveis. </li><li> Centrifugar a 300xg por 5 minutos. Aspirar cuidadosamente o sobrenadante e ressuspender em 5 mL de PBS. Repetir a centrifugação e aspiração, e ressuspender em 10 mL PBS por injeção. </li></ol> 3. Preparação dos animais <ol><li> Usando uma seringa de insulina, administrar uma injeção intraperitoneal de cocktail anestesia roedores (ketamina 37,6 mg / mL, xilazina 1,92 mg / mL, acepromazina 0,38 mg / mL) a 1 mL por grama de peso corporal (GBW). Espere 5 minutos para que o animal se sedado. Verifique se há batimento cardíaco e colocar o animal em uma almofada aquecida. Manter animais em uma almofada aquecida em todas as vezes até a recuperação. </li><li> Após a sedação, administrar 1 gota de HCl proximetacaína no olho direito. Substituir animais na almofada aquecida e espere um minuto. </li><li> Administrar 1 gota de fenilefrina HCl para o olho direito. Substituir o animal na almofada aquecida e aguarde 5 minutos. Se a dilatação da pupila não ocorreu, re-administrar 1 gota e esperar mais 5 minutos. </li><li> Monitorar os animais em busca de sinais de movimento ou contração muscular, que pode ocorrer em&gt; 30 minutos após a sedação. Aos primeiros sinais de movimento, administrar 1 mL / GBW de cetamina HCl (diluído a 10 mg / mL em PBS) e aguarde 5 minutos. </li></ol> 4. Injeção de células tumorais <ol><li> Coloque o animal anestesiado sob o microscópio de lado, com o olho direito para cima e com a cabeça descansando sobre uma gaze e centrado para obter um reflexo vermelho do fundo do olho direito (pupila dilatada deve ser neste momento) quando observada através do microscópio . </li><li> Escorar o globo direito empurrando levemente para baixo simultaneamente com dois dedos sobre as pálpebras e mantenha esta posição de forma constante para o restante do procedimento. </li><li> Usando uma agulha estéril de calibre 30 acoplada a uma seringa Luer-lock, furar o globo lateralmente através da conjuntiva e esclera adjacente ao limbo da córnea na área da pars plana (Figura 1) e apenas através da coróide na cavidade vítrea. Retire a agulha da abertura. </li><li> Esterilizar a agulha Hamilton com um algodão embebido em álcool. Chamar a suspensão de células para dentro da seringa Hamilton e inserir a agulha na abertura até que a agulha é visualizado através do microscópio atrás da lente no vítreo perto da retina. Com a ajuda de uma segunda pessoa, enquanto segura a agulha firmemente nesta posição, o êmbolo lentamente. Remova a agulha. Se necessário, use um cotonete para absorver qualquer líquido da abertura. </li><li> Gentilmente liberar a pressão das pálpebras para fechar as pálpebras mouse. </li><li> Administrar 1 gota de hipromelose para cada olho e voltar animal para almofada aquecida para recuperação. </li></ol> 5. Monitoramento de camundongos injetados e colheita de tumores <ol><li> Diária, examine o olho injetado de leucocoria (reflexo branco papilar) e / ou distensão periocular que geralmente se torna aparente 2-4 semanas após a injecção. </li><li> Uma vez que o crescimento do tumor é detectado, a eutanásia de animais de acordo com as diretrizes institucionais. </li><li> Se o tumor do olho e são cobertos por pálpebras, use o bisturi para fazer duas incisões ortogonal à fenda palpebral e levante a retalhos cutâneos. </li><li> Sob visualização usando o microscópio estereoscópico, faça uma incisão circunferencial no limbo, eliminando a córnea ea lente, e dissecar cuidadosamente a maior parte da massa tumoral a partir de outros tecidos usando tweezers. Coloque o tumor em estéril RPMI-1640 mídia. </li><li> Use uma pinça para retirar o mundo aberto a partir do soquete. Para garantir um nervo ligado óptica para a invasão do tumor pode ser visualizado, puxe o mundo até que o nervo é exposto e usar a tesoura para cortar o nervo maior tempo possível. Coloque em formalina 10% para regular processamento para exame histológico. </li></ol> 6. Resultados representativos: Tumorspheres retinoblastoma começarão a aparecer a partir do tecido desagregados quase imediatamente como eles são liberados a partir da massa tumoral. Dentro de 2-4 dias, mais tumorspheres começará a forma e vai aumentar de tamanho. As esferas tendem a ser regular e exibem uma membrana bem definida, secundárias em torno do agregado (Figura 2). O animal normalmente apresenta-se com leucocoria dentro de 4 semanas pós-injeção (Figura 3b), seguido pelo alargamento do globo e distensão dos tecidos circundantes 5-8 semanas após a injeção que o tumor cresce (Figura 3c). <img src="/files/ftp_upload/2644/2644fig1.jpg" alt="Figura 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 1"> Figura 1. Transversal diagrama do olho do rato que destaca as características referenciadas no protocolo. <img src="/files/ftp_upload/2644/2644fig2.jpg" alt="Figura 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 2"> Figura 2. Cultura de células humanas in vitro retinoblastoma fotografada em um 4x), e b) ampliação da objetiva 10x. Retinoblastoma células do tumor primário produzir tumorspheres com uma forma regular esférica e uma membrana externa crisp. Barras de escala representam a) 500 mm, e b) M 200. <img src="/files/ftp_upload/2644/2644fig3.jpg" alt="Figura 3" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 3"> Figura 3 Eye of RAG2 -. / - Mostrando um rato características) normal, b) leucocoria indicativo de uma massa tumoral na cavidade vítrea, e c) uma grande massa tumoral preenchendo o mundo com distensão periocular associados, hemorragia intra-ocular.

<ol><li>Chèvez-Barrios, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Metastatic+and+Nonmetastatic+Models+of+Retinoblastoma%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Pathol%22%5BJournal%5D)">Metastatic and Nonmetastatic Models of Retinoblastoma.</a> Am. J. Pathol. 157, 1405-1412 (2000).</li>
<li>Suber, M. L., Hurwitz, M. Y., Chèvez-Barrios, P., Hurwitz, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immune+consequences+of+intraocular+administration+of+modified+adenoviral+vectors%5BTitle%5D)+AND+%22Hum.+Gene+Ther%22%5BJournal%5D)">Immune consequences of intraocular administration of modified adenoviral vectors.</a> Hum. Gene Ther. 12, 833-838 (2001).</li>
<li>Mallam, J. N., Hurwitz, M. Y., Mahoney, T., Chèvez-Barrios, P., Hurwitz, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+Gene+Transfer+into+Retinal+Cells+Using+Adenoviral+Vectors%3A+Dependence+on+Receptor+Expression%5BTitle%5D)+AND+%22Invest.+Ophthalmol.+Vis.+Sci%22%5BJournal%5D)">Efficient Gene Transfer into Retinal Cells Using Adenoviral Vectors: Dependence on Receptor Expression.</a> Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 45, 1680-1687 (2004).</li>
</ol>

Experimentos em animais foram realizados de acordo com as diretrizes e regulamentos estabelecidos pelo Colégio Baylor de Medicina IACUC Comitê.

A técnica descrita a seguir facilita a propagação de tumores retinoblastoma no seu meio, intraocular intravítrea. A técnica de injeção intra-ocular tem sido usado no passado para criar tumores a partir de linhas de células derivadas de retinoblastoma 1, bem como para entregar vetores virais para terapia genética intra-ocular 2,3. Esta técnica já foi utilizada com sucesso para produzir tumores retinoblastoma humano por injeção direta de células do tumor primário e injeção de tumorspheres bem como a propagação de série de tumores xenoenxerto. Evidência visível de formação de tumores (geralmente leucocoria) é geralmente observado pela primeira vez dentro de 4 semanas, após o que a hemorragia intra-ocular e distensão do globo e / ou tecidos que circundam a órbita desenvolver dentro de 5-8 semanas. Uma minoria de camundongos injetados ferir o olho injetado, levando ao encerramento definitivo das pálpebras. Nestes casos, a distensão é o único sinal de formação de tumores. Estabelecimento de tumores xenoenxerto murino não foi bem sucedido com todos os tumores retinoblastoma humano, embora a propagação de tumores xenoenxerto estabelecido é altamente bem sucedido. Esta observação sugere que certas características do tumor primário, como a invasão e nível de diferenciação ou algum outro fator desconhecido, pode estar influenciando a capacidade de estes tumores de persistir no ambiente ocular murino. A quantidade de tecido que podem ser adquiridos a partir de um tumor retinoblastoma humano é muito pequeno, e há limitações significativas sobre a capacidade de células cultura humana retinoblastoma in vitro, tais como tempo de vida limitado, a perda de histologia do tumor sólido e mudanças no fenótipo celular. Este protocolo fornece uma maneira relativamente simples de propagar o tumor humano e estabelecer um modelo murino da doença humana. Isso permite que mais in vitro e em experimentação in vivo de biologia do retinoblastoma e de manutenção mais longos do lado de fora do tumor do paciente.

<table border="1"><tbody><tr><th> Nome </th><th> Companhia </th><th> Catalogo </th><th> Comentários </th></tr><tr><td> Fenilefrina HCl 2,5% </td><td> Bausch &amp; Lomb </td><td> 053-11 </td><td> Solução oftálmica </td></tr><tr><td> 30-ga Agulha </td><td> BD </td><td> 305128 </td><td> Bisel regulares </td></tr><tr><td> 10 ml Seringa Luer-Lock </td><td> BD </td><td> 309604 </td><td></td></tr><tr><td> 3/10-cc seringa de insulina </td><td> BD </td><td> 328431 </td><td></td></tr><tr><td> Compressas com álcool </td><td> BD </td><td> 326895 </td><td></td></tr><tr><td> 6-Bom Prato Tecido, Cultura-Tratada </td><td> BD </td><td> 353046 </td><td></td></tr><tr><td> Proximetacaína HCl 0,5% </td><td> Butler AHS </td><td> 017239 </td><td> Solução oftálmica </td></tr><tr><td> Ketamina HCl 100mg/ml </td><td> Fort Dodge </td><td> 4402A </td><td></td></tr><tr><td> 10 mL Hamilton Seringa </td><td> Empresa Hamilton </td><td> 7648-01 </td><td></td></tr><tr><td> 32-ga Hamilton Agulha </td><td> Empresa Hamilton </td><td> 7803-04 </td><td> Comprimento personalizado - 0.5 &quot; </td></tr><tr><td> Neurobasal-A Mídia </td><td> Invitrogen </td><td> 10888-022 </td><td></td></tr><tr><td> B-27 Suplemento Minus vitamina A, 50X </td><td> Invitrogen </td><td> 12587-010 </td><td></td></tr><tr><td> RPMI-1640 Mídia </td><td> Mediatech </td><td> 10-040-CV </td><td></td></tr><tr><td> Não essenciais solução de aminoácidos, 100X </td><td> Mediatech </td><td> 25-025-CI </td><td></td></tr><tr><td> L-Glutamina, 100X </td><td> Mediatech </td><td> 25-005-CI </td><td></td></tr><tr><td> Descartáveis ​​# 11 Scalpel </td><td> Miltex </td><td> 4-411 </td><td></td></tr><tr><td> Combo Anestesia roedores </td><td> n / a </td><td> n / a </td><td> Na casa de formulação de farmácia (ketamina 37,6 mg / mL, xilazina 1,92 mg / mL, acepromazina 0,38 mg / mL) </td></tr><tr><td> Recombinante Fator de crescimento epidérmico humano (EGF) </td><td> StemCell Technologies </td><td> 02633 </td><td> Reconstituir a 10 mg / mL solução estoque </td></tr><tr><td> Fator de Crescimento Humano Recombinante fibroblasto básico (bFGF) </td><td> StemCell Technologies </td><td> 02634 </td><td> Reconstituir a 10 mg / mL solução estoque </td></tr><tr><td> OMS-75 Microscópio Operação </td><td> Topcon Medical Systems </td><td> OMS-75 </td><td> Este modelo foi descontinuado </td></tr><tr><td> Formalina a 10% </td><td> VWR </td><td> 95042-908 </td><td></td></tr></tbody></table>

estabelecimento e propagação de tumores humanos em retinoblastoma imune camundongos deficientes

Establishment and Propagation of Human Retinoblastoma Tumors in Immune Deficient Mice

A cultura de células de tumor retinoblastoma nos meios de comunicação célula-tronco dá origem definida para tumorspheres primária que pode ser cultivado e mantido apenas por um período limitado. Estes tumorspheres cultivadas podem apresentar marcadamente diferentes fenótipos celulares quando comparado aos tumores original. Demonstração de que as células cultivadas têm a capacidade de formar novos tumores é importante para garantir que o modelo células cultivadas a biologia do tumor original. Aqui apresentamos um protocolo para a propagação de tumores retinoblastoma humano in vivo utilizando RAG2 - / - ratos imunológico deficiente. Cultivadas tumorspheres retinoblastoma humano de passagem baixa ou células obtidas de recém-colhido tumores retinoblastoma humano injetado diretamente na cavidade vítrea de olhos murino formar tumores dentro de 2-4 semanas. Estes tumores podem ser colhidas e quer ainda várias passagens nos olhos murino in vivo ou crescido como tumorspheres in vitro. Propagação foi realizado com sucesso há pelo menos três passagens estabelecendo assim uma fonte contínua de tecido retinoblastoma humano para fazer novas experiências. Wesley S. Bond e Lalita Wadhwa são co-autores primeiro.

Um método é descrito para propagar tumores retinoblastoma humano em camundongos. Células tumorais são diretamente injetadas nos olhos de ratos imune deficiente. Tumores secundários foram estabelecidas com sucesso usando as duas células diretamente colhidas a partir de tumores humanos e tumorspheres cultivadas.

Estabelecimento e propagação de Tumores Humanos em Retinoblastoma Imune camundongos deficientes

O cultivo de células tumorais de retinoblastoma em meios definidos para células-tronco originou esferas tumorais primárias que podem ser cultivadas e mantidas por apenas um período limitado...

O objetivo geral deste procedimento é estabelecer um tumor ortotópico de retinoblastoma em um camundongo imunodeficiente, fornecendo um modelo conveniente para experimentação adicional e permitindo a propagação do tumor. Isso é realizado primeiramente colhendo células de um tumor primário ou xenotransplantado e cultivando esferas tumorais in vitro. O segundo passo do procedimento consiste em injetar as células tumorais cultivadas na cavidade vítrea ou no espaço subretiniano do olho de um camundongo imunodeficiente rag dois nulo.O terceiro passo do procedimento é monitorar os camundongos injetados em busca de sinais de formação tumoral, incluindo leucocoria, aumento do globo ocular e distensão periocular. O passo final do procedimento é colher o tumor xenotransplantado. Em última análise, podem-se obter resultados que demonstram a formação de tumor ortotópico no olho de camundongo por meio de exame histopatológico.A demonstração visual desta técnica é fundamental devido à natureza delicada da injeção intraocular. As estruturas circundantes podem ser facilmente danificadas, se não forem identificadas corretamente. Geralmente, indivíduos novos neste método enfrentam dificuldades porque a colocação da injeção na cavidade vítrea exige precisão para entregar as células tumorais no local correto.Agora, este método pode fornecer informações sobre a biologia de tumores de retinoblastoma. Também pode ser aplicado a outros sistemas, como a administração interocular de vetores para transferência gênica. Primeiro, prepare meio fresco definido para células-tronco em uma placa estéril de cultura de tecidos de 10 centímetros de diâmetro.Coloque o tecido tumoral de retinoblastoma e aspire o meio de transporte em excesso, deixando quantidade suficiente para evitar ressecamento; desagregue mecanicamente o tecido com um bisturi utilizando uma técnica de corte cruzado. Adicione imediatamente 100 microlitros de meio definido para células-tronco ao tecido e espalhe suavemente o tecido picado usando o bisturi. Em seguida, adicione 10 mililitros de meio definido para células-tronco à placa. Incube a placa a 37 graus Celsius com 5% de dióxido de carbono em um incubador umidificado e examine diariamente alterações na turbidez e no pH.Algumas esferas tumorais devem surgir do tecido tumoral dissociado quase imediatamente, com aumento progressivo ao longo de sete a dez dias, quando for observado crescimento suficiente. A partir daí, semanalmente, centrifugue as esferas tumorais a 300 vezes G durante cinco minutos. Resuspenda-as em meio definido para células-tronco recém-preparado e pipeteie para cima e para baixo 10 vezes para dissociar as esferas maiores com necrose central e permitir a formação de novas esferas saudáveis.Para preparar esferoides tumorais cultivados para injeção, transfira suavemente os esferoides para um tubo cônico de 15 mililitros. Pipete suavemente para cima e para baixo de 10 a 15 vezes para romper os esferoides. Conte as células a serem injetadas utilizando um hemocitômetro com tripano azul para excluir células não viáveis.Prepare-se para tantas injeções quantas forem necessárias com base na quantidade de células disponíveis e nos requisitos experimentais. Em seguida, centrifugue os tubos a 300 vezes G durante cinco minutos. Aspire cuidadosamente o sobrenadante e ressuspenda as células em cinco mililitros.Repita a centrifugação e os passos de aspiração com PBS mais uma vez. Por fim, ressuspenda as células em 10 microlitros de PBS estéril por injeção. Para preparar os animais para o procedimento, comece colocando um camundongo anestesiado sobre uma placa aquecida.Para manter a temperatura corporal, administre uma gota de cloridrato de propana no olho direito e aguarde um minuto. Em seguida, administre uma gota de cloridrato de fenilefrina no olho direito e aguarde cinco minutos. Se a dilatação da pupila não tiver ocorrido, administre outra gota e aguarde mais cinco minutos.Coloque o animal anestesiado de lado sob o microscópio, apoiando a cabeça sobre uma gaze. Vire o lado direito para cima e centralize o olho para obter um reflexo vermelho do olho direito. Ao observar o fundo do olho através do microscópio, sustente o globo ocular direito empurrando suavemente para baixo simultaneamente com dois dedos sobre as pálpebras.Mantenha esta posição estável pelo restante do procedimento. Utilizando uma agulha estéril de calibre 30 acoplada a uma seringa com fechamento por encaixe, perfure o globo lateralmente através da conjuntiva e da esclera adjacentes ao limbo corneano na região do pars plana, e apenas através da coroide até a cavidade vítrea.Remova a agulha da abertura. Esterilize uma agulha Hamilton com um cotonete de álcool. Aspire a suspensão celular para dentro da seringa Hamilton e insira a agulha na abertura até que a agulha seja visualizada pelo microscópio atrás da lente, no vítreo, próximo à retina.Com a ajuda de uma segunda pessoa, mantenha a agulha firme nesta posição enquanto pressiona o êmbolo; remova lentamente a agulha. Se necessário, use um cotonete para absorver qualquer sangue ou fluido da abertura. Libere suavemente a pressão para fechar as pálpebras do camundongo.Retorne o animal para uma placa aquecida para recuperação. A cada dia após a injeção, examine o olho em busca de leucocoria. Isso geralmente se torna aparente de duas a quatro semanas após a injeção.Uma vez detectado o crescimento tumoral, eutanazie o animal de acordo com as diretrizes institucionais. Sob um microscópio estereoscópico, faça uma incisão circunferencial na córnea, removendo a córnea e o cristalino, e dissecção cuidadosamente a maior parte da massa tumoral dos demais tecidos utilizando pinças. Coloque o tumor em RPMI 1640 estéril.Com o uso de pin&ccedil;as, puxe lentamente o globo ocular aberto da &oacute;rbita at&eacute; que o nervo &oacute;ptico seja exposto. Enquanto levanta suavemente o globo da &oacute;rbita, use tesoura para cortar o nervo &oacute;ptico, deixando o maior comprimento poss&iacute;vel do nervo aderido ao globo, a fim de avaliar a invas&atilde;o do nervo &oacute;ptico pelo tumor. Coloque em formalina tamponada a 10% para histologia, conforme observado.Aqui está um exemplo de esferoides tumorais cultivados. Após três dias, apenas alguns esferoides tumorais são aparentes entre o tecido tumoral dissociado. No entanto, aos 10 dias, o número de esferoides tumorais aumentou.As esferas exibem uma membrana externa nítida, conforme mostrado no inseto no canto superior direito, várias semanas após a injeção. O camundongo injetado exibe leucocoria, o reflexo pupilar branco é devido ao tumor localizado na parte posterior do olho. Nestes exemplos de cortes oculares corados com h e d, observe o tumor de retinoblastoma xenotransplantado preenchendo a cavidade vítrea à esquerda, e a ausência de tal crescimento no olho injetado com controle à direita.Após assistir a este vídeo, você deverá ter uma boa compreensão de como preparar células tumorais cultivadas, realizar corretamente uma injeção intraocular no olho de um camundongo e como verificar a progressão tumoral. Uma vez dominada, a técnica de injeção pode ser realizada em aproximadamente 30 minutos por animal. Se realizada corretamente, não se esqueça de que as células tumorais podem ser perigosas e precauções, como o uso de EPI adequado, incluindo jaleco laboratorial e máscaras, devem ser sempre tomadas durante a realização deste procedimento. Células de câncer humano devem sempre ser manipuladas sob condições BSL 2.

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