Mapeamento e Aplicação de Enhancer-trap Expressão Flippase em larval e Adultos Drosophila CNS

O objetivo geral do experimento a seguir é refinar a expressão de GAL quatro por meio do uso de lipase específica do tecido com ferramentas de conversão de GAL 80. Isso é conseguido gerando uma coleção de linhagens de moscas transgênicas Philippe de armadilha intensificadora e determinando o padrão de expressão da lipase do SNC em cada linha. Usando um repórter GFP, os relatórios IMMUNOCHEMISTRY e GFP podem diferenciar GL da expressão neuronal para cruzar a expressão GAL quatro em linhas de interesse ET linhas de flip através das moscas contendo uma ferramenta de conversão GAL 80 na progênie.

A análise clonal pode ser usada para analisar o refinamento da expressão de quatro GAL, como no olho. A principal vantagem dessa técnica sobre os métodos existentes é que as linhas baseadas em reprodução de trilha aprimorada, juntamente com as ferramentas de conversão GAL 80, podem ser usadas com uma coleção rápida de GAL quatro alianças já disponíveis na comunidade fly. Além disso, esse conceito pode ser expandido para outros quatro organismos modelo emergentes de UAS GALI, como o peixe-zebra.

Esse método pode ajudar a responder a perguntas-chave no mapeamento de circuitos neurais subjacentes ao comportamento. Embora este protocolo demonstre o uso de flip base em um subconjunto de células fotorreceptoras, o método interseccional pode ser aplicado à análise de outros tecidos, incluindo tecidos não neuronais. À medida que mais linhas de lipase de armadilha intensificadora são caracterizadas.

A gota quatro US é uma técnica importante amplamente utilizada por biólogos de moscas. Uma ressalva da maioria das quatro linhas do GAL é aquela expressa de forma muito ampla para ser usada para mapeamento do comportamento cerebral usando os métodos dos dedos. Não é possível ajustar a expressão de GAL quatro em camisetas de interesse Antes de usar um transgene ET flip para restringir parcialmente a expressão de quatro linhas de expressão de GAL.

Primeiro, é útil conhecer o padrão de expressão do transgene ET flip x two em estágio avançado de lava em desenvolvimento e em adultos para visualizar a expressão de flip a No SNC configurar um cruzamento entre machos com o transgene ET t flip X dois de interesse e fêmeas virgens abrigando um repórter GFP para et flip expressão da progênie. Colete larvas F1 de terceiro ínstar errantes para dissecação. Coloque-os em um prato de proteção S limpo e remova quaisquer detritos com um pincel e enxágue o prato uma vez com uma vez PBS.

Agora encha o prato com PBS gelado uma vez para anestesiar as larvas para acessar o SNC de uma lava, segure seu gancho bucal com um par de pinças. Pegue a cutícula perto da esférica anterior estendida e retire-a. O SNC permanece preso ao gancho da boca junto com algumas outras estruturas.

Agora, com uma pinça, remova todas as estruturas em excesso ao redor do SNC enquanto disseca o SNC. Transfira-os individualmente para uma placa de pirex de três mundos cheia de PBS. Depois que todos os SNC estiverem dissecados, fixe-os submergindo-os totalmente em 200 microlitros de 4% de PFA no gelo.

Se um SNC flutuar, ele não foi totalmente limpo de todo o tecido circundante. Caso isso ocorra, use uma pinça para submergir novamente o SNC no fixador após a fixação por 15 minutos, lave o tecido com PB S3 gelado vezes e depois lave o tecido mais três vezes em PBT gelado. O tecido agora está pronto para ser fotografado ou marcado por anticorpos ou armazenado em PBT a quatro graus Celsius para mais tarde.

Coloração do mesmo cruzamento usado para fazer as larvas coletarem adultos F1 antes da dissecação. Submergiu de cinco a 10 moscas e resfriou etanol a 95% por 30 segundos para remover a cera da superfície da cutícula. Para remover o etanol, lave os adultos três vezes com PBS gelado uma vez e após a terceira lavagem, transfira um deles para uma placa de proteção de 35 milímetros cheia de PBS gelado uma vez para preparar um adulto para dissecação.

Coloque-o com o lado ventral para cima e insira um pino de lacaio no meio do abdômen. Comece a dissecar usando uma pinça para remover as pernas. Em seguida, remova a cutícula da cabeça prendendo a cabeça nos adereços e, simultaneamente, descascando a cutícula de baixo do olho em direção ao topo da cabeça.

Usando cuidadosamente pinças afiadas, remova, rastreie seus tecidos ao redor do cérebro, porque rastrear seus tecidos têm forte autofluorescência e faz o cérebro flutuar durante a fixação. O cérebro é apenas parte do SNC adulto. A outra parte é o cordão nervoso ventral ou VNC no tórax e também deve ser dissecado.

Primeiro, remova a cutícula torácica prendendo a mosca na base da pata traseira e puxando suavemente a cutícula torácica até a base do pescoço. Em segundo lugar, para expor o VNC, espalhe suavemente as duas metades da cutícula torácica. Terceiro, remova o abdômen do tórax prendendo na base da segunda perna e afastando o abdômen perto da primeira noite de agitação abdominal.

Quarto, limpe o VNC prendendo na área umeral e arrancando suavemente o tecido ao redor do VNC. Rasgue o anel de tecido conjuntivo ao redor do conjuntivo cervical e continue removendo o excesso de tecido enquanto coleta o cérebro. E a VNC os transfere como peras para um prato de pirex de nove mundos cheio de PBS refrigerado uma vez mantido no gelo.

Para fixar os tecidos adultos, mergulhe-os em 4% de PFA no gelo por 15 minutos. Siga o banho com três lavagens PBS geladas e três lavadoras PBT. O tecido agora está pronto para ser fotografado ou marcado por anticorpos para analisar a expressão do transgene com precisão.

É útil rotular o SNC com marcadores neuronais ou gliais para fornecer um quadro de referência: comece incubando o tecido a quatro graus Celsius durante a noite com anticorpos para neurônios ou glia no dia seguinte. Lave a preparação cinco vezes com PBT e incube com o anticorpo secundário fluorescente à temperatura ambiente por duas horas. Enrole a placa e o papel alumínio para evitar o fotobranqueamento do anticorpo quando a incubação terminar.

Lave a preparação com PBS e monte a preparação inteira em uma lâmina. Use um anel de plástico OSHA para evitar que o tecido seja esmagado pela lamínula. O sistema nervoso está agora pronto para ser examinado quanto aos padrões de expressão de GFP e LL sob um microscópio fluorescente.

Normalmente, três a cinco réplicas são examinadas para determinar a reprodutibilidade do padrão de expressão de inversão. O padrão de expressão de flip no flip, uma linha pode ser usada junto com outros transgenes para alterar a forma como o repressor GAL quatro GAL 80 é expresso. Alterar a expressão do repressor GAL 80 é um método eficaz para fazer alterações.

Na expressão de GAL quatro, um método é inverter a expressão de GAL 80 com a expressão do transgene GAL 80 inativa GAL quatro, o que está causando degeneração ocular em todo o olho. O ET flip line hash 6 88 A é usado aqui para avaliar a eficácia da ferramenta de conversão GAL 80 em um subconjunto de fotorreceptores na progênie F1, comparar o fenótipo ocular com o fenótipo ocular das cepas parentais. Qualquer aparência de deformidade ocular ou despigmentação confirma que o padrão de expressão do flip está presente nos fotorreceptores e o flipout do GAL 80 foi bem-sucedido.

Uma estratégia complementar não redundante é inverter a expressão GAL 80 usando a mesma linha de inversão de interesse. Essa estratégia é muito semelhante à outra, mas agora a pigmentação e a degeneração do ID na progênie F1 são suprimidas. No flip X dois.

Expressando fotorreceptores: Uma vez dominado, a dissecção do SNC pode ser feita em aproximadamente cinco minutos para adultos e um minuto para larvas, se for realizada corretamente. Ao tentar este procedimento, é importante usar uma pinça afiada para remover a traqueia e o tecido ao redor do adulto e do Libre C e Ss.It é importante usar um prato sem fixador para dissecação. O Heat shock flip é usado atualmente para gerar clones aleatórios.

Em contraste, o enhancer trap flip permite gerar clones reprodutíveis, facilitando a análise morfológica e comportamental. Outro ponto forte do método do dedo é que se pode restringir ainda mais os quatro padrões de expressão do GAL usando linhas adicionais baseadas em flip de armadilha anan e outras linhas de garotas. Uma fraqueza da configuração da parada de tubulina GAL 80 é que certas combinações de efetores GA quatro e UAS, como LAG quatro e U-A-S-K-I-R, não são compatíveis porque matam as moscas.

Este problema pode ser superado facilmente usando um efetor UAS condicional, como o UAS Shiri Ts, que permite que um comportamento seja examinado em temperaturas restritivas conforme esperado. Nem todas as linhas de lipase de armadilha intensificadora expressarão níveis altos o suficiente de lipase para serem úteis. No entanto, a técnica do dedo descrita aqui fornece uma nova abordagem para os pesquisadores de drosófilas refinarem a análise do mosaico para circuitos de desenvolvimento ou comportamento.