Caracterização fisiológica, morfológica e neuroquímicos de Neurônios Modulada por Movimento
21 de abril de 2011
A técnica é descrita para quantificar a resposta fisiológica em vivo dos neurônios de mamíferos durante o movimento e correlacionar a fisiologia do neurônio com a morfologia neuronal, fenótipo neuroquímico e microcircuitos sináptica.
O objetivo geral deste procedimento é registrar a resposta fisiológica de neurônios individuais durante o movimento e caracterizar ainda mais a morfologia e a neuroquímica desses neurônios. Isso é realizado primeiramente anestesiando e preparando cirurgicamente o animal. O próximo passo é registrar eletrofisiologicamente a resposta intracelular de neurônios individuais durante o movimento.
Após perfundir o animal e processar o cérebro, a etapa final consiste em visualizar e analisar a resposta fisiológica e a morfologia neuronal. Em última instância, as técnicas de gravação neuronal intracelular, imunoquímica e análise combinam-se para demonstrar as modulações no potencial de membrana de neurônios individuais durante o movimento. A principal vantagem desta técnica em relação a métodos existentes, como o cultivo celular, é que as conexões neuronais e as entradas sinápticas são preservadas, e os neurônios não são autotomizados nem colocados em meios artificiais. No dia anterior, o experimento injeta um marcador neuronal, tal como a peroxidase do rábano, em regiões-alvo periféricas para rotulagem retrógrada de neurônios motores.
No dia seguinte, anestesie o rato e coloque-o sobre uma placa aquecida, depile a pele sobre a região posterior do crânio com tesouras para animais utilizando técnica asséptica. Faça uma incisão ao longo da coxa interna, insira uma cânula na veia femoral para administração adicional de anestesia. Insira outra cânula na artéria femoral para monitorar a pressão sanguínea.
Finalmente, insira uma cânula na traqueia. Em seguida, posicione a rata em um estereotáxico. Realize uma craniotomia para expor o cerebelo, tomando cuidado para evitar o seio venoso grande localizado diretamente sob a junção entre os ossos parietais e interparietais.
Em seguida, cubra a superfície do cérebro com óleo mineral aquecido. Agora, cole a mandíbula a uma haste acoplada a um vibrador eletromagnético. O movimento da mandíbula é controlado por sinais de comando enviados ao vibrador a partir de um gerador de sinais.
Em seguida, posicione um eletrodo de aterramento sob a pele adjacente à craniotomia. Para preparar os eletrodos intracelulares, puxe e preencha microeletrodos com uma solução do corante IDE ou tetraetilrodamina. A impedância do eletrodo deve ser de 60 a 80 megaohms para axônios de grande diâmetro e de 80 a 150 megaohms para axônios aferentes pequenos e interneurônios.
Em seguida, posicione o microeletrodo na etapa inicial do eletrometro usando um pequeno telescópio fixado atrás da cabeça do animal. Visualize o microeletrodo através da ocular vermelha 20 x do telescópio. A área-alvo está localizada a aproximadamente 0,5 milímetros do bordo inferior do colículo inferior.
Agora, faça uma pequena abertura na pia-máter para permitir a localização precisa da superfície do cérebro. Supercorrija o feedback de capacitância de modo que, quando o eletrodo tocar o cérebro, um sinal de feedback seja produzido. Avance o eletrodo até que ele entre no cérebro.
O próximo passo é ativar o deslocamento repetido da mandíbula. Em seguida, utilizando um motor de passo, avance o eletrodo para dentro do cérebro. Quando um impalamento neuronal for indicado por uma queda súbita no potencial contínuo e pela atividade sináptica em curso, interrompa o avanço do eletrodo.
Quando a penetração for considerada estável, inicie movimentos rampa e patamar e movimentos sinusoidais da mandíbula. Registre a resposta neuronal e caracterize o neurônio com base em sua resposta. Em seguida, para mapear o campo receptivo do neurônio, use uma sonda romba para explorar a pele ao redor da cabeça e a cavidade intraoral.
Explore a resposta do neurônio a outros estímulos, como contração muscular ou estímulos nocivos. Quando as gravações estiverem concluídas, injete de um a quatro nanoampères de corrente contínua por um tempo total de injeção de 15 a 70 nanoampères-minuto. Monitore a penetração do eletrodo e interrompa a injeção de corrente.
Se o potencial da membrana se tornar mais positivo que menos 30 milivolts, o próximo passo é seccionar o tecido cerebral. Após a eutanásia e a perfusão do animal, remova o cérebro. Em seguida, corte seções de 50 a 100 mícrons em plano frontal, sagital ou horizontal.
Para visualizar a relação entre o neurônio sensorial marcado e uma variedade de neurônios motores, processe o tecido para H-R-P-D-A-B ou Texas red, conforme o tecido; análises adicionais podem ser realizadas com microscópio fluorescente ou confocal ou utilizando software de colocalização quantitativa. Se desejado, pode-se realizar o processamento imunoquímico para sinaptofisina, a fim de localizar com precisão as sinapses dentro dos neurônios marcados. Esta figura mostra um neurônio do tronco encefálico que foi injetado com IDE após a caracterização eletrofisiológica.
Com base na resposta neuronal durante o movimento, este neurônio pode ser identificado como um neurônio aferente do fuso muscular secundário. O contorno marrom indica a localização do núcleo motor do trigêmeo. Esta figura mostra a resposta fisiológica de um neurônio sensorial durante o deslocamento da mandíbula.
A resposta do neurônio é representada como frequência instantânea de disparo. Observe que a resposta imita de perto o deslocamento mandibular, indicando que esse neurônio específico fornece feedback sensorial relacionado à posição da mandíbula. Esta figura mostra um neurônio sensorial que respondeu durante a sondagem muscular.
O neurônio foi corado com ide após o processamento imunoquímico. Os botões sinápticos que aparecem como inchaços vermelhos são vistos co-localizados com a sinaptofisina amarela. O verde é uma coloração fluorescente por marcador.
Esta figura é uma animação de um axônio de um neurônio aferente primário do fuso muscular. Várias seções ópticas do neurônio marcado foram utilizadas para gerar a animação. Após este procedimento, outros métodos como eletromicroscopia, microscopia confocal e marcação neuronal anterógrada ou retrógrada podem ser realizados para responder perguntas adicionais sobre as características ultraestruturais do neurônio, a colocalização de neurotransmissores com terminações sinápticas e a conectividade neuronal.
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Visão Geral
Este artigo descreve uma técnica para quantificar a resposta fisiológica in vivo de neurônios de mamíferos durante o movimento. Ele correlaciona a fisiologia neuronal com a morfologia, o fenótipo neuroquímico e a microcircuitaria sináptica.
Componentes Principais do Estudo
Área da Ciência
- Neurociência
- Eletrfisiologia
- Neuroanatomia
Contexto
- O registro das respostas fisiológicas dos neurônios é fundamental para compreender sua função.
- Os métodos existentes frequentemente interrompem as conexões neuronais.
- Esta técnica preserva o ambiente natural dos neurônios.
- Rastreadores neuronais são utilizados para marcar neurônios específicos para estudo.
Objetivo do Estudo
- Registrar a resposta fisiológica de neurônios individuais durante o movimento.
- Caracterizar a morfologia e a neuroquímica desses neurônios.
- Analisar a relação entre a atividade neuronal e a estrutura.
Métodos Utilizados
- Anestesiar e preparar cirurgicamente o animal.
- Gravação eletrofisiológica de respostas intracelulares durante o movimento.
- Perfundir o animal e processar o cérebro para análise.
- Visualizar e analisar a morfologia neuronal e as respostas fisiológicas.
Resultados Principais
- Demonstrou modulações no potencial de membrana de neurônios durante o movimento.
- Mostrou conexões neuronais e entradas sinápticas preservadas.
- As técnicas combinadas forneceram insights sobre o comportamento neuronal.
- Destacou as vantagens em relação aos métodos tradicionais de cultura celular.
Conclusões
- Essa técnica oferece uma abordagem inovadora para o estudo da fisiologia neuronal in vivo.
- Amplia a compreensão da relação entre a atividade neuronal e a morfologia.
- Estudos futuros podem se basear neste método para explorar diversas funções neuronais.
Perguntas Frequentes
Relevância Executiva para a Indústria
Compreender como neurônios individuais respondem durante o movimento é essencial para reduzir os riscos na validação de alvos na descoberta de fármacos em neurociência. Esta técnica permite insights mecanicistas ao correlacionar atividade fisiológica com morfologia e neuroquímica em circuitos intactos, reforçando a confiança preditiva no engajamento de alvos. Ela preenche uma lacuna importante na pesquisa sensoriomotora onde métodos estáticos ou extracelulares não conseguem capturar a dinâmica funcional durante o comportamento.
Aplicações Estratégicas em P&D de Biotecnologia Farmacêutica
Descoberta Inicial e Validação de Alvo
- Valor Científico: Permite a investigação de hipóteses terapêuticas ao associar padrões de disparo neuronal durante o movimento a tipos celulares e vias específicas.
- Valor Operacional: Apoia a redução de riscos biológicos por meio da observação direta da modulação neuronal em condições fisiologicamente relevantes.
- Valor Preditivo: Aumenta a confiança no alvo ao caracterizar fenótipos neuroquímicos e conectividade sináptica dos neurônios modulados.
Desenvolvimento de Triagem e Ensaios
- Prontidão do Ensaio: Prepara sistemas neuronais validados com respostas fisiológicas quantificadas para triagem de compostos em etapas subsequentes.
- Reprodutibilidade: Padroniza a caracterização morfológica e neuroquímica para garantir leituras consistentes entre experimentos.
- Escalabilidade: Facilita a reutilização da plataforma ao permitir o mapeamento detalhado de neurônios que pode ser combinado com imunoquímica ou microscopia eletrônica para análises multiplexadas.
Pesquisa Translacional e Pré-Clinica
- Continuidade Translacional: Conecta a descoberta e a validação pré-clínica ao preservar a circuitria nativa durante estudos de movimento in vivo.
- Redução de Riscos Mecanísticos: Reduz a ambiguidade na função do alvo ao correlacionar a atividade com características ultraestruturais e entradas sinápticas.
- Avanço com Ajuste de Risco: Orienta decisões de avançar/não avançar por meio de perfis abrangentes de neurônios que apoiam o alinhamento de biomarcadores e a validação de vias.
Integração de Pipeline e Fluxo de Trabalho
Este método integra-se ao continuum de descoberta, desde a validação inicial do alvo até a caracterização pré-clínica, fornecendo dados estruturais e funcionais sobre neurônos ativos durante o movimento.
- Biologia da Descoberta: Apoia a verificação de hipóteses e a elucidação de vias ao registrar respostas intracelulares durante comportamentos motores definidos, como o movimento da mandíbula.
- Triagem: Permite a preparação de ensaios por meio da visualização e quantificação reprodutíveis da morfologia neuronal e da modulação fisiológica.
- Análises: Fornece medidas quantitativas do potencial de membrana e dados de colocalização neuroquímica que permitem a comparação objetiva de estados neuronais.
- Pesquisa Translacional: Conecta-se ao trabalho pré-clínico ao preservar a microcircuitaria sináptica, possibilitando a continuidade da resposta fisiológica até a validação estrutural.
- Reutilização Empresarial: Funciona como uma plataforma de caracterização reutilizável, aplicável a sistemas sensoriais, motores e interneuronais em diversos modelos de doenças.
Impacto Operacional e Empresarial
- Valor Científico: Fornece confiança preditiva ao reduzir ambiguidades mecanicistas por meio da correlação entre fisiologia, morfologia e neuroquímica.
- Valor Operacional: Garante padronização e reprodutibilidade por meio de preparação cirúrgica fixa, protocolos de eletrodos e etapas padronizadas de processamento de tecidos.
- Valor Estratégico: Melhora a eficiência do capital ao permitir a eliminação precoce de riscos em alvos por meio da caracterização abrangente de neurônios in vivo.
- Impacto no Portfólio: Apoia a priorização ajustada ao risco ao fornecer dados multimodais que orientam as decisões de seleção e avanço de alvos.
Considerações sobre a Implementação
- Requer experiência em eletrofisiologia intracelular, preparação cirúrgica e técnicas de injeção de traçadores neuronais.
- Depende de instrumentação especializada, incluindo eletrometros, geradores de sinal, motores de passo e sistemas de microscopia para imagem de luz, elétrons ou confocal.
- Necessita padronização entre equipes dos protocolos de anestesia, métodos de perfusão e corte de tecidos para garantir a consistência dos dados.
- Envolve considerações de adaptação ao aplicar a técnica a diferentes tipos neuronais ou regiões cerebrais além do sistema trigeminal.
- Limitado pelo desafio técnico de manter gravações intracelulares estáveis durante o movimento, o que depende da impedância do eletrodo e da estabilização do cérebro.
