Caracterização fisiológica, morfológica e neuroquímicos de Neurônios Modulada por Movimento

A técnica é descrita para quantificar a resposta fisiológica em vivo dos neurônios de mamíferos durante o movimento e correlacionar a fisiologia do neurônio com a morfologia neuronal, fenótipo neuroquímico e microcircuitos sináptica.

O objetivo geral deste procedimento é registrar a resposta fisiológica de neurônios individuais durante o movimento e caracterizar ainda mais a morfologia e a neuroquímica desses neurônios. Isso é feito primeiro anestesiando e preparando cirurgicamente o animal. O próximo passo é registrar eletrofisiológico a resposta intracelular de neurônios individuais durante o movimento.

Depois de perfundir o animal e processar o cérebro, a etapa final é visualizar e analisar a resposta fisiológica e a morfologia neuronal. Em última análise, as técnicas de registro neuronal intracelular, imunoquímica e análise combinam-se para mostrar as modulações no potencial de membrana de neurônios individuais durante o movimento. A principal vantagem dessa técnica sobre os métodos existentes, como a cultura de células, é que as conexões neuronais e as entradas sinápticas são preservadas e os neurônios não são autotomizados nem colocados em meios artificiais. No dia anterior, o experimento injetou um marcador neuronal, como o rabanete, a peroxidase nas regiões-alvo periféricas para rotular os neurônios motores retrógrados.

No dia seguinte, anestesiar o rato e colocá-lo em uma almofada de aquecimento, raspar a pele, cobrindo a parte posterior do crânio com tosquiadeiras de animais usando técnica asséptica. Faça uma incisão ao longo da parte interna da coxa, insira uma cânula na veia femoral para anestesia adicional. Insira outra cânula na artéria femoral para monitorar a pressão arterial.

Finalmente, insira uma cânula na traqueia. Em seguida, coloque o rato em um quadro estereotáxico. Realize uma craniotomia para expor o cerebelo, tomando cuidado para evitar o grande seio venoso localizado diretamente sob a junção entre os ossos parietal e interparietal.

Em seguida, cubra a superfície do cérebro com óleo mineral aquecido. Agora cole a mandíbula a uma haste acoplada a um vibrador eletromagnético. O movimento da mandíbula é controlado por sinais de comando para o vibrador a partir de um gerador de sinal.

Em seguida, coloque um eletrodo de aterramento sob a pele adjacente à craniotomia. Para se preparar para os eletrodos intracelulares, puxe os microeletrodos de enchimento com um IDE ou testes de solução de corante Domine de haste de tetraetila. Essa impedância do eletrodo é de 60 a 80 mega ohms para axônios de grande diâmetro e 80 a 150 mega ohms para pequenos axônios aferentes e interneurônios.

Em seguida, coloque o microeletrodo no estágio da cabeça do eletrômetro usando um pequeno telescópio que é fixado na posição atrás da cabeça do animal. Visualize o microeletrodo através do recle fechado de 20 x do telescópio. A área-alvo é de cerca de 0,5 milímetros até a borda inferior do colículo inferior.

Agora faça uma pequena abertura na pia-máter para permitir a localização precisa da superfície do cérebro. Supercompense o feedback de capacitância para que, quando o eletrodo tocar o cérebro, um sinal de feedback seja produzido. Avance o eletrodo até que ele entre no cérebro.

O próximo passo é ativar o deslocamento repetido da mandíbula. Em seguida, usando um motor de passo, avance o eletrodo para o cérebro. Quando um empalamento neuronal é indicado por uma queda repentina no potencial DC e atividade sináptica contínua, pare de avançar o eletrodo.

Quando a penetração for considerada estável, inicie os movimentos de rampa e retenção e mandíbula sinusoidal. Registre a resposta neuronal e caracterize o neurônio com base em sua resposta. Em seguida, para mapear o campo receptivo do neurônio, use uma sonda romba para explorar a pele ao redor da cabeça e da cavidade intraoral.

Explore a resposta do neurônio a outros estímulos, como contração muscular ou estímulos nocivos. Quando as gravações estiverem concluídas, injete de um a quatro nano amp, corrente CC para uma injeção total de 15 a 70 nano amp minutos. Monitore a penetração do eletrodo e interrompa a injeção de corrente.

Se o potencial de membrana se tornar mais positivo do que menos 30 milivolts, o próximo passo é seccionar o tecido cerebral. Depois de sacrificar e perfundir o animal, remova o cérebro. Em seguida, corte seções de 50 a 100 mícrons no plano frontal, sagital ou horizontal.

Para visualizar a relação entre o neurônio sensorial marcado e uma variedade de neurônios motores, processe o tecido para H-R-P-D-A-B ou Texas red, dependendo do tecido, análises adicionais podem ser feitas com um microscópio fluorescente ou confocal ou usando software de colocalização quantitativa. Conforme desejado, o processamento imunoquímico pode ser feito para que a sinaptofisina localize com precisão as sinapses dentro dos neurônios marcados. Esta figura mostra um neurônio do tronco encefálico que foi injetado com IDE após caracterização eletrofisiológica.

Com base na resposta neuronal durante o movimento, esse neurônio pode ser identificado como um neurônio aferente do fuso muscular secundário. O contorno marrom indica a localização do núcleo motor do trigêmeo. Esta figura mostra a resposta fisiológica de um neurônio sensorial durante o deslocamento da mandíbula.

A resposta do neurônio é representada como frequência de disparo instantânea. Observe que a resposta imita de perto o deslocamento mandibular, indicando que esse neurônio em particular fornece feedback sensorial relacionado à posição mandibular. Esta figura mostra um neurônio sensorial que respondeu durante a sondagem muscular.

O neurônio foi corado com ide após o processamento imunoquímico. Os bastões sinápticos que aparecem como inchaços vermelhos são vistos co-localizados com a sinaptofisina amarela. Verde é uma mancha de míssil fluorescente.

Esta figura é uma animação de um axônio de um neurônio aferente primário do fuso muscular. Várias seções ópticas do neurônio marcado foram usadas para gerar a animação. Após este procedimento, outros métodos como eletromicroscopia, microscopia confocal e marcação neuronal de grau anterior ou retrógrado podem ser realizados para responder a perguntas adicionais sobre as características ultraestruturais da colocalização de neurônios de neurotransmissores com bns sinápticos e conectividade neuronal.