Name: Caracterização fisiológica, morfológica e neuroquímicos de Neurônios Modulada por Movimento (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-04-21T11:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 4 s
Description: Aprenda a registrar respostas fisiológicas de neurônios mamíferos durante o movimento usando gravação intracelular in vivo. Esta técnica preserva conexões sinápticas naturais e permite correlacionar atividade elétrica com morfologia e neuroquímica celular.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Agradeço Anthony Taylor para a formação inicial em gravação no intracelular vivo e A Maxwell e David Brown para ajudar com o desenvolvimento inicial da técnica de coloração intracelular. Agradeço M. Prata ajuda com a macro collocalization. Muitos estudiosos com quem tenho colaborado desde insight para o desenvolvimento desta técnica, incluindo R. Donga, Moritani M., P. Luo, Ambalavanar R.. Esta técnica foi desenvolvida com o apoio considerável de NIH concede DE10132, DE15386 e RR017971.

1. Preparação dos animais <ol><li> Anestesiar ratos com pentobarbital sódico (50mg/kg IP) e coloque sobre uma almofada de aquecimento. Raspar a pele que recobre o crânio posterior com clippers animal. Verifique o animal para assegurar que um nível cirúrgica do nível de anestesia foi obtida por meio de testes para a ausência de um reflexo de retirada e vocalização quando os dedos são comprimidos, bem como a ausência de reflexo palpebral. Verificar o nível de anestesia a cada 15 minutos e manter um nível cirúrgico de anesthetisa por injeções de pentobarbital sódico 15mg/kg a cada 45 minutos. </li><li> Use uma técnica asséptica e fazer uma incisão na região inguinal imediatamente distal à prega formada pelo abdômen e parte interna da coxa e inserir uma cânula (1mm de diâmetro, Clay Adams) na veia femoral e da artéria femoral. Faça uma incisão mediana na região submandibular, refletem os músculos infra-hióideos. Fazer uma pequena incisão na traquéia e inserir uma cânula (2mm de diâmetro) para permitir a ventilação. Tye uma sutura em torno do trachael cannual para fixá-lo na pressão arterial sistêmica place.Monitor sistólica e diastólica através da cânula arterial. Além de monitorar a retirada e reflexo palpebral agora monitor de pressão arterial para avaliar o nível de anestesia. Administrar anestesia adicionais quando necessário através da cânula venosa. </li><li> Coloque o rato em uma moldura estereotáxica e realizar uma craniotomia para expor o cerebelo. Anexar a cânula traqueal a um ventilador de roedores. Ventilar o animal com um volume de 2 cm 3 a uma taxa de 100/min com ar umidificado. A pressão expiratória final positiva de 1 cm H 2 O deve ser mantida para evitar o colapso do pulmão. A cada 15 minutos hyperinflate dos pulmões para prevenir atelectasias. Em seguida, cobrir a superfície do cérebro com óleo mineral aquecido (30 ° C). Tenha cuidado para evitar o seio venoso grande localizado diretamente sob a junção entre o parietal e ossos interparietal. </li><li> Aplique cola de cianoacrilato a uma haste acoplada a um vibrador eletromagnético e anexar a vara no diastema da mandíbula. Mover a mandíbula sinais de comando usando o vibrador de qualquer um A saída do computador / D ou um gerador de sinal. </li><li> Coloque um siliver-prata cloreto de eletrodo de aterramento sob a pele adjacente à craniotomia. </li></ol> 2. Preparação do eletrodo <ol><li> Fabricar microeletrodos de vidro de quartzo ou de alumínio usando um extrator de microeletrodos horizontal. </li><li> Preencher o microeletrodo com biotinamide 5-10% dissolvido em 0,25 m e KCl 0.5M Tris HCl (pH 7,6) ou tetramethlyrhodamine 2% em solução salina (pH 6). Verificação da impedância eletrodo com um testador de eletrodo. Para gravar a partir de axônios de grande diâmetro tornar eletrodos com uma impedância de 60-80M Ω, por axônios de pequeno e interneurônios fazer eletrodos com impedância de 80 150MΩ. </li><li> Coloque o microeletrodo no palco cabeça do eletrômetro. Visualize o eletrodo através de um pequeno telescópio (20x com retículo em anexo) que é fixado na posição atrás da cabeça do animal. Usando o telescópio é importante porque permite que os eletrodos para ser stereotaxically posicionados com grande precisão. </li></ol> 3. Gravação eletrofisiológicos e coloração intracelular <ol><li> Faça uma pequena abertura na pia-máter e compensar o feedback capacitância de modo que quando o eletrodo toca o cérebro um sinal de realimentação é produzida. Isto permite a localização exata da superfície do cérebro. </li><li> Produzir repetido deslocamento mandibular e avançar o eletrodo no cérebro com um motor de passo. </li><li> Reconhecer impalements neuronal por quedas bruscas no potencial DC e identificar intrassomáticas impalements neuronal pela atividade sináptica em curso. Zumbindo o eletrodo com uma sobrecompensação dos capacitância ou tocando raramente produzem uma penetração celular de sucesso. Devido à alta impedância dos eletrodos, as respostas neuronal raramente são observados antes da penetração. </li><li> Depois de empalar um neurônio ea penetração é considerado estável, caracterizar a resposta neuronal usando rampa e segurar e movimentos da mandíbula sinusoidal. 5 Mapa do campo receptivo do neurônio sondando a pele ao redor da cabeça e cavidade oral intra com uma sonda não-condutor como um palito de madeira. Se relevantes para o estudo, examinar a resposta do neurônio para outro funcionalmente estímulos relevantes, tais como a contração muscular e estímulos nocivos. Aferentes nociceptivos primários seis receptores neuronais responder a estímulos nociceptivos. Anesthesetics geral, tais como pentobarbital sódico não bloqueio da condução axonal em neurônios aferentes primários, mas sim diminuir a transmissão sináptica. Assim condução axonal no axônio aferente primário neuronal é preservada. </li><li> Injetar corrente contínua (DC, 1-4NA) para um tempo de injeção total de 15 70nA minutos. Monitorar a penetração do eletrodo durante a injeção de corrente e interromper o potencial de membrana se torna mais positivo do que-30mV.</li></ol> 4. Processamento de tecidos <ol><li> Eutanásia do animal por overdose de pentobarbital (140mg/kg IV) e perfundir com um enxágüe vascular (0,9% NaCl 38 ° C, contendo 500 unidades de heparina e 1 ml de xilocaína 2% seguido de paraformaldeído 4% em tampão fosfato 0,1 M (pH 7,4) . </li><li> Remover o cérebro e seção, em 50-100μm usando um vibratome em qualquer plano, frontal sagital ou horizontal. Secions são coletados livre flutuação em 25 ° C PBS. </li><li> Processo do cérebro para DAB, incubando em soro de cabra normal e 1-2% 1% Triton X-100 em PBS 0,01 M seguido de incubação em avidina biotina (1:50 Elite Vectastain). Reagir seções usando níquel DAB com H 2 O 2. Ao processo de Texas Red, seções incubar no complexo avidina-biotina (1:50) em PBS overnight a 4 ° C e incubar em 4% Texas Red avidina DCS em PBST a 4 ° C durante a noite. Contracoloração seções com uma fluorescente Nissl mancha (NeuroTrace) 20min a 23 ° C. </li><li> Se neurônio foi injetado com rodamina, visualize o neurônio injetado diretamente com um microscópio de fluorescência (Ex 545nm). </li></ol> 5. Combinando com o método de rotulagem retrógrada, imunocitoquímica, imagem confocal, análise quantitativa co-localização O sucesso de combinar esta técnica com outros métodos, é em grande parte dependente de rotulagem intracelular bom. <ol><li> O método visualizadas aqui podem ser facilmente combinados com rotulagem neuronal retrógrada. 7-10 Para fazer isso, anestesiar o animal e utilizando uma técnica asséptica, injetar um traçador neuronal, tais como peroxidase (20% peroxidase. Sigma VI, Sigma) e 1% gérmen de trigo aggultinated peroxidase (Sigma) em regiões-alvo periféricos, tais como o músculo masseter. Este marcador neuronal será retomada em axônios periféricos e transportados através de transporte axonal ao somata motoneurônio. Para o músculo masseter, 15μl de traçador é injetado no músculo, utilizando uma micro microlitro estéril 10. Os animais são então colocados em uma almofada de aquecimento e monitorado até a recuperação anestésica e, em seguida, colocados em suas gaiolas para a recuperação. Após 24h, anestesiar animais e caracterizar fisiologicamente neurônios e intracelularmente manchá-las. Então perfundir o animal, como descrito acima e cortes de tecidos processo para a presença de HRP utilizando tetrametilbenzidina (TMB) como o Chromagen e tungstato de sódio como estabilizador e intensificou-se com cobalto. Seções lugar no tungstato de sódio a 1% dissolvida em 0,1 M PBS (pH 6,5) e TMB 0,0007% dissolvida em etanol absoluto e acetona a 15 ° C por 20 min. Então reagir cortes de tecidos, adicionando 1,0 ml de 0,3% H 2 O 2 por 100 ml de solução de incubação por 60 min. Enxaguar tecido em 0,1 M PBS (pH 6,5) e coloque em diaminobenzidina 0,05% (pH 7,4), cobalto 0,02% e 0,01% H 2 O 2 0,1 M em PBS (pH 7,4) por 10 min. a 37 ° C. Processo o tecido para a visualização do neurônio injetados com biotinamide como descrito e visualizar as relações entre o neurônio sensorial rotulados e uma variedade de motoneurônios. </li><li> A técnica mostrada aqui também pode ser facilmente combinada com immnocytochemistry. 6 Como exemplo, immunocytochemically processo do cérebro para sinaptofisina para localizar com precisão as sinapses nos neurônios marcados (Fig. 3). Para fazer isso, incubar seções do cérebro do rato em anticorpos anti-sinaptofisina (1:10.000) para 2 dias a 4 ° C e incubar em anti-camundongo FITC (1:400) por 1h a 23 ° C. </li><li> Neurônios marcados com marcadores fluorescentes ou processados ​​para imagens fluorescentes são ideais para imagens confocal. Figura 3 é um exemplo de uma secção óptica obtidos por microscopia confocal através de um bouton axônio. (Fig. 3). Gerar animações de neurônios rotuladas através da aquisição de várias secções ópticas através do neurônio rotulada (Fig. 4). </li><li> Neurônios marcados com este método pode ser usado para a análise de co-localização quantitativa. Para fazer isso, use uma macro software disponíveis publicamente em conjunto com o NIH Imagem (encontrado em http://phy.ucsf.edu/ ° IDL / colocalization.htm). Localize sinaptofisina dentro de terminais de axônio único, combinando rotulagem intracelular com imunocitoquímica sinaptofisina 6. </li></ol> 6. Resultados representativos: Uma visão geral dos resultados representativos que podem ser obtidos através deste método são ilustrados na Figura 1. Este único neurônio do tronco cerebral foi eletrofisiologicamente registrados durante o movimento da mandíbula e, como pode ser visto claramente, a resposta deste neurônio (Figura 1 inferior esquerdo, azul claro) foi modulada durante o movimento. Este neurônio foi injetado com biotinamide após caracterização eletrofisiológica e posteriormente processadas para visualização. O neurônio reconstruído (Figura 1 médio, verde) pode ser realted de um marco anatômico, neste caso, o núcleo motor do trigêmeo designado (contorno vermelho). Com base na resposta neuronal durante o movimento ea reconstrução deste neurônio pode ser identificado como um neurônio secundário do fuso muscular aferentes. A figura 2 ilustra um exemplo representativo da resposta fisiológica de um neurônio durante o deslocamento da mandíbula. A resposta do neurônio é representado como frequência de disparo instantâneo. Note-se que a resposta neuronal imita o deslocamento mandibular, indicando que esse neurônio particular oferece feedback sensorial relacionado à posição mandibular. Figura 3 é uma imagem de alta ampliação de um axônio intracelularmente manchada combinado com coloração para sinaptofisina e uma mancha de Nissl. Observe a co-localização de sinaptofisina (amarelo) dentro da bouton axônio. Figura 4 é uma animação de um neurônio único, caracterizado fisiologicamente e intracelularmente rotulados. <img src="/files/ftp_upload/2650/2650fig1.jpg" alt="Figura 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 1"> A Figura 1. Visão geral do método. Superior esquerdo: deslocamento mandibular. Gravação Intracelular meio (verde) de único neurônio (amarelo). A morfologia deste neurônio foi reconstruída após a gravação intracelular e injeção. Contorno vermelho indica a localização do núcleo motor do trigêmeo. Canto inferior esquerdo: resposta fisiológica deste neurônio durante o movimento da mandíbula. <img src="/files/ftp_upload/2650/2650fig2.jpg" alt="Figura 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 2"> Figura 2. Resposta fisiológica Representante de um neurônio único músculo sensoriais gravadas in vivo durante o movimento da mandíbula. Observe a semelhança da resposta neuronal com deslocamento da mandíbula. <img src="/files/ftp_upload/2650/2650fig3.jpg" alt="Figura 3" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 3"> Figura 3. Terminal arborização axonal com boutons sináptica (inchaços vermelhos) de um neurônio sensorial intracelularmente manchada que responderam durante muscular sondagem. Processamento imunocitoquímicos subseqüentes para sinaptofisina mostra localização de sinaptofisina no bouton axonal (amarelo). Verde é uma mancha fluorescente Nissl. Figura 4. Animation do músculo axônio neurônio fusiforme aferentes primários cuja resposta fisiológica foi gravado in vivo durante o movimento mandibular, o axônio foi então intracelularmente manchadas e processados ​​para visualização. <a href="/files/ftp_upload/2650/collateral4.avi">Download de um vídeo de alta resolução da Figura 4 aqui</a> <a href="/files/ftp_upload/2650/medres.mov">Download de um vídeo de média resolução Figura 4 aqui</a>

<ol><li>Cuellar, C. A., Tapia, J. A., Juarez, V., Quevedo, J., Linares, P., Marinez, L., Manjarrez, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Propagation+of+sinusoidal+electrical+waves+along+the+spinal+cord+during+a+fictive+motor+task%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Propagation of sinusoidal electrical waves along the spinal cord during a fictive motor task.</a> J. Neurosci. 29, 798-810 (2010).</li>
<li>Frigon, A., Gossard, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evidence+for+specialized+rhythm-generating+mechanisms+in+the+adult+mammalian+spinal+cord%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Evidence for specialized rhythm-generating mechanisms in the adult mammalian spinal cord.</a> J. Neurosci. 30, 7061-7071 (2010).</li>
<li>Wang, W., Chan, S. S., Heldman, D. A., Moran, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Motor+cortical+representation+of+hand+translation+and+rotation+during+reaching%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Motor cortical representation of hand translation and rotation during reaching.</a> J. Neurosci. 30, 958-962 (2010).</li>
<li>Ma, C., He, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+method+for+investigating+cortical+control+of+stand+and+squat+in+conscious+behavioral+monkeys%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci.+Meth%22%5BJournal%5D)">A method for investigating cortical control of stand and squat in conscious behavioral monkeys.</a> J. Neurosci. Meth. 192, 1-6 (2010).</li>
<li>Dessem, D., Donga, R., Luo, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Primary-+and+secondary-like+jaw-muscle+spindle+afferents+have+characteristic+topographic+distributions%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurophysiol%22%5BJournal%5D)">Primary- and secondary-like jaw-muscle spindle afferents have characteristic topographic distributions.</a> J. Neurophysiol. 77, 2925-2944 (1997).</li>
<li>Dessem, D., Moritaini, A., Ambalavanar, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nociceptive+craniofacial+muscle+primary+afferent+neurons+synapse+in+both+the+rostral+and+caudal+brain+stem%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurophysiol%22%5BJournal%5D)">Nociceptive craniofacial muscle primary afferent neurons synapse in both the rostral and caudal brain stem.</a> J. Neurophysiol. 98, 214-223 (2007).</li>
<li>Luo, P., Dessem, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inputs+from+identified+jaw-muscle+spindle+afferents+to+trigeminothalamic+neurons+in+the+rat%3A+a+double-labeling+study+using+retrograde+HRP+and+intracellular%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Comp.+Neurol%22%5BJournal%5D)">Inputs from identified jaw-muscle spindle afferents to trigeminothalamic neurons in the rat: a double-labeling study using retrograde HRP and intracellular.</a> J. Comp. Neurol. 353, 50-66 (1995).</li>
<li>Dessem, D., Luo, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Jaw-muscle+spindle+afferent+feedback+to+the+cervical+spinal+cord+in+the+rat%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Comp.+Neurol%22%5BJournal%5D)">Jaw-muscle spindle afferent feedback to the cervical spinal cord in the rat.</a> J. Comp. Neurol. 128, 451-459 (1999).</li>
<li>Luo, P., Wong, R., Dessem, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Projection+of+jaw-muscle+spindle+afferents+to+the+caudal+brainstem+in+rats+demonstrated+using+intracellular+biotinamide%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Comp.+Neurol%22%5BJournal%5D)">Projection of jaw-muscle spindle afferents to the caudal brainstem in rats demonstrated using intracellular biotinamide.</a> J. Comp. Neurol. 358, 63-78 (1995).</li>
<li>Luo, P., Dessem, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ultrastructural+anatomy+of+physiologically+identified+jaw-muscle+spindle+afferent+terminations+onto+retrogradely+labeled+jaw-elevator+motoneurons+in+the+rat%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Comp.+Neurol%22%5BJournal%5D)">Ultrastructural anatomy of physiologically identified jaw-muscle spindle afferent terminations onto retrogradely labeled jaw-elevator motoneurons in the rat.</a> J. Comp. Neurol. 406, 384-401 (1999).</li>
<li>Hassani, O. K., Henny, P., Lee, M. G., Jones, B. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((GABAergic+neurons+intermingled+with+orexin+and+MCH+neurons+in+the+lateral+hypothalamus+discharge+maximally+during+sleep%5BTitle%5D)+AND+%22Eur.+J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">GABAergic neurons intermingled with orexin and MCH neurons in the lateral hypothalamus discharge maximally during sleep.</a> Eur. J. Neurosci. 32, 448-457 (2010).</li>
<li>Inokawa, H., Yamada, H., Matsumoto, N., Muranishi, M., Kimura, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Juxtacellular+labeling+of+tonically+active+neurons+and+phasically+active+neurons+in+the+rat+striatum%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Juxtacellular labeling of tonically active neurons and phasically active neurons in the rat striatum.</a> Neuroscience. 168, 395-404 (2010).</li>
</ol>

Experimentos em animais foram realizados de acordo com o guidlines e regulação estabelecidas no Guia para o Cuidado e Uso de Animais de Laboratório (NIH Publication No. 86-23, revisado em 1985) e da Universidade de Maryland Animal Care e Use Comitê.

O método ilustrado aqui é uma poderosa técnica que fornece informação importante sobre a função dos neurônios individuais e como a resposta de neurônios individuais contribui para circuitos neuronais. 9 Este conhecimento é fundamental para a compreensão da função sensório-motor. A maior força desta técnica é que permite a determinação é de um grande número de parâmetros sobre um neurônio, incluindo a fisiologia, a morfologia ea morfologia e distribuição sináptica. Quando combinado com outras técnicas, como in...

<table border="1"><tbody><tr><th> Nome do reagente ou equipamento </th><th> Companhia </th><th> Número de catálogo </th><th> Comentários </th></tr><tr><td> vibrador eletromagnético </td><td> Ling Dynamic Systems </td><td> V101 </td><td></td></tr><tr><td> gerador de sinal </td><td> Sistemas de Medição </td><td> PFG605 </td><td> capaz de produzir o sinal de saída trapezoidal </td></tr><tr><td> eletrodo de vidro </td><td> Sutter Instruments </td><td> AF100-68-10 </td><td> com filamento </td></tr><tr><td> extrator eletrodo </td><td> Sutter Instruments </td><td> Modelo P-2000 ou P-80 </td><td></td></tr><tr><td> biotinamide </td><td> Vector Laboratories </td><td> SP-1120 </td><td> armazenados a 4 ° C </td></tr><tr><td> Texas Red avidina DCS </td><td> Vector Laboratories </td><td> A-2016 </td><td></td></tr><tr><td> tetramethlyrhodamine </td><td> Sondas moleculares </td><td> D-3308 </td><td> 3000 o peso molecular, lisina fixable </td></tr><tr><td> rato de anticorpos anti-sinaptofisina </td><td> Chemicon </td><td> MAB5258 </td><td></td></tr><tr><td> fluorescentes mancha Nissl </td><td> Neurotrace, Molecular Probes </td><td> N-21480 </td><td></td></tr><tr><td> testador de eletrodo </td><td> Winston Eletrônica </td><td> BL-1000-B </td><td> para medir a impedância do eletrodo </td></tr><tr><td> eletrômetro </td><td> Axon Instruments </td><td> Axoprobe 1A, 2B Axoclamp </td><td></td></tr></tbody></table>

caracterização fisiológica, morfológica e neuroquímicos de neurônios modulada por movimento

Physiological, Morphological and Neurochemical Characterization of Neurons Modulated by Movement

O papel dos neurônios individuais e sua função nos circuitos neuronais é fundamental para a compreensão dos mecanismos neuronais das funções sensoriais e motoras. A maioria das investigações de mecanismos sensório-motor dependem, quer o exame de neurônios ao mesmo tempo um animal é 1,2 estática ou atividade neuronal registro extracelular durante um movimento. 3,4 Embora esses estudos forneceram a base fundamental para a função sensório-motor, que não quer avaliar as informações funcionais que ocorre durante um movimento ou estão limitados na sua capacidade de caracterizar plenamente o fenótipo anatomia, fisiologia e neuroquímica do neurônio. A técnica é mostrada aqui, que permite a caracterização extensa de neurônios individuais durante um em movimento vivo. Esta técnica pode ser usada não só para estudar neurônios aferentes primários, mas também para caracterizar os motoneurônios e interneurônios sensório-motor. Inicialmente, a resposta de um único neurônio é gravado usando métodos eletrofisiológicos durante vários movimentos da mandíbula seguido por determinação do campo receptivo para o neurônio. Um traçador neuronal é, então, intracelularmente injetado no neurônio e do cérebro é processada de modo que o neurônio pode ser visualizado com microscopia de luz, elétron ou confocal (Fig. 1). A morfologia detalhada do neurônio é caracterizado depois reconstruída de modo que a morfologia neuronal pode ser correlacionada com a resposta fisiológica do neurônio (Figs. 2,3). Nesta comunicação detalhes importantes e dicas importantes para a implementação bem sucedida dessa técnica são fornecidos. Informações adicionais valiosas pode ser determinada para o neurônio em estudo através da combinação deste método com outras técnicas. Rotulagem neuronal retrógrada pode ser utilizada para determinar os neurônios com que as sinapses dos neurônios rotuladas, permitindo assim a determinação detalhada dos circuitos neuronais. Imunocitoquímica pode ser combinado com este método para examinar neurotransmissores no neurônio rotulados e para determinar os fenótipos químicos de neurônios com que as sinapses dos neurônios marcados. O neurônio marcado também podem ser processados ​​para microscopia eletrônica para determinar as características ultra-estruturais e micro circuitos do neurônio rotulados. Geral esta técnica é um método poderoso para caracterizar completamente os neurônios durante em movimento vivo, permitindo assim uma visão substancial sobre o papel do neurônio em função sensório-motor.

A técnica é descrita para quantificar a resposta fisiológica em vivo dos neurônios de mamíferos durante o movimento e correlacionar a fisiologia do neurônio com a morfologia neuronal, fenótipo neuroquímico e microcircuitos sináptica.

Caracterização fisiológica, morfológica e neuroquímicos de Neurônios Modulada por Movimento

O papel de neurônios individuais e sua função em circuitos neuronais é fundamental para a compreensão dos mecanismos neuronais sensoriais e motores...

O objetivo geral deste procedimento é registrar a resposta fisiológica de neurônios individuais durante o movimento e caracterizar ainda mais a morfologia e a neuroquímica desses neurônios. Isso é realizado primeiramente anestesiando e preparando cirurgicamente o animal. O próximo passo é registrar eletrofisiologicamente a resposta intracelular de neurônios individuais durante o movimento.Após perfundir o animal e processar o cérebro, a etapa final consiste em visualizar e analisar a resposta fisiológica e a morfologia neuronal. Em última instância, as técnicas de gravação neuronal intracelular, imunoquímica e análise combinam-se para demonstrar as modulações no potencial de membrana de neurônios individuais durante o movimento. A principal vantagem desta técnica em relação a métodos existentes, como o cultivo celular, é que as conexões neuronais e as entradas sinápticas são preservadas, e os neurônios não são autotomizados nem colocados em meios artificiais. No dia anterior, o experimento injeta um marcador neuronal, tal como a peroxidase do rábano, em regiões-alvo periféricas para rotulagem retrógrada de neurônios motores.No dia seguinte, anestesie o rato e coloque-o sobre uma pl

physiological-morphological-neurochemical-characterization-neurons

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neurociência

Nós descrevemos um protocolo que permite imagens de mitocôndrias na vida neurônios através de microscopia de fluorescência durante muito tempo. Imagem por longos períodos é realizado através de lentivírus mediada expressão de uma proteína fluorescente mitochondrially alvo e uso de uma infra-top estágio incubadora que foi projetada e construída em nosso laboratório.

Neuromodulação e Transportes mitocondrial: Imagens ao vivo em neurônios do hipocampo durante muito tempo

Numerosos estudos recentes identificaram mutações em proteínas sinápticas associada a patologias cerebrais. Primários cultivados neurônios corticais oferecem grande flexibilidade para examinar os efeitos destas proteínas doenças associadas na morfologia e motilidade espinha dendrítica.

Análise de Morfologia Spine dendríticas em neurônios cultivados CNS

Morfogênese neuronal ea migração são eventos cruciais subjacentes ao desenvolvimento do cérebro. Aqui, descrevemos os métodos para manipular geneticamente cultivadas neurônios granulares do cerebelo e do cerebelo em desenvolvimento para a avaliação da morfologia e características migratórias dos neurônios.

Manipulação genética de Cerebelar Granule Neurônios<em&gt; In Vitro</em&gt; E<em&gt; In Vivo</em&gt; Estudar Neuronal Morfologia e Migração

Este protocolo usa tridimensional (3D) de imagem e análise técnicas para visualizar e quantificar mitocôndrias nervo específico. As técnicas são aplicáveis a outras situações onde um sinal fluorescente é usado para isolar um subconjunto de dados de outro sinal fluorescente.

Imagem tridimensional e análise de mitocôndrias dentro as fibras nervosas intraepidérmicas humana

A investigação do tráfico de membranas é crucial para a compreensão das funções neuronais. Aqui, introduzimos um método para quantificar a motilidade vesicular nos neurónios. Este é um método conveniente que pode ser adaptado para a quantificação do tráfico de membrana no sistema nervoso.

Quantificação de Endosome e Moosidades de Lisosoma em Neurônios Cultivados Usando Sondas Fluorescentes

Este protocolo oferece uma digitalização de porções de tarefas clínicas tradicionais comumente usadas para medir a cognição e o controle motor na doença de Parkinson. As tarefas clínicas são digitalizadas enquanto os ritmos biofísicos são coregistados a partir de diferentes níveis funcionais dos sistemas nervosos, variando de voluntários, espontâneos, automáticos a autonômicos.

Biomarcadores digitais dinâmicos da função motora e cognitiva na doença de Parkinson

Transporte mitocondrial prejudicado e morfologia estão envolvidos em várias doenças neurodegenerativas. O protocolo apresentado usa neurônios cerebrais derivados de células-tronco pluripotentes induzidas para avaliar o transporte mitocondrial e a morfologia em paraplegia espástica hereditária. Este protocolo permite a caracterização do tráfico mitocondrial ao longo de axônios e análise de sua morfologia, o que facilitará o estudo de doenças neurodegenerativas.

Analisando o Transporte Mitocondrial e a Morfologia em neurônios derivados de células-tronco pluripotentes induzidos por humanos em Paraplegia Espástica Hereditária

Monitoramento dos movimentos oculares (ou eye tracking) revela que no espaço os olhos linger, quando e por quanto tempo. Aqui, demonstramos como o rastreamento dos olhos pode ser usada para investigar a integridade da memória em populações participante múltiplos, sem a necessidade de relatos verbais, ou de outra forma explícita,.

Monitoramento Eye Movement of Memory

O efeito de leveza e hipergravidade em ambos os processos hemodinâmicos e eletrofisiológicos no cérebro vai ser seguido durante o vôo parabólico por técnicas de EEG e NIRS. Um estudo de viabilidade de um experimento mais complexo, que está prevista a realização de, durante o vôo espacial de médio e longo prazo.

Coerência entre a função cerebral cortical e Desempenho neurocognitiva durante condições de gravidade mudou

Neurônios receptores olfativos (ORNs) converter sinais de odor primeiro em um receptor de corrente que por sua vez desencadeia potenciais de ação que são transmitidos para os neurônios de segunda ordem no bulbo olfativo. Aqui, descrevemos a técnica da pipeta de sucção para gravar simultaneamente o receptor de odorante induzida atual e os potenciais de ação de ORNs mouse.

Odorante induzidas respostas registradas a partir de neurônios receptores olfativos utilizando a técnica de sucção da pipeta

Aprenda a registrar respostas fisiológicas de neurônios mamíferos durante o movimento usando gravação intracelular in vivo. Esta técnica preserva conexões sinápticas naturais e permite correlacionar atividade elétrica com morfologia e neuroquímica celular.

Caracterização fisiológica, morfológica e neuroquímicos de Neurônios Modulada por Movimento

Explorar mais vídeos