Cromatografia de afinidade lipídica mediada por vesículas com separação de células Magnetic Ativado (LIMACS): um novo método para analisar proteínas lipídios Interação

Este experimento tem como objetivo identificar proteínas ligadoras de lipídios e analisar a interação entre proteínas e lipídios em um ambiente de membrana definido. Proteínas de frações lipídicas de homogeneado celular são incubadas com vesículas lipídicas recém-preparadas a partir de fosfatidilserina e ceramida. A seguir, a mistura de reação é suplementada com anticorpo Xin V conjugado a esferas magnéticas para ancorar as proteínas associadas às vesículas lipídicas nas esferas magnéticas. Em seguida, as vesículas lipídicas ligadas a proteínas são purificadas por meio de separação celular ativada por campo magnético.

Para identificar a proteína ligada ao lipídio demonstrada nos resultados, utilize eletroforese em gel de poliacrilamida com SDS seguida de Western blotting para demonstrar a purificação de PKC atípica endógena e recombinante e de um domínio específico de ligação à ceramida expresso em células MDCK. A principal vantagem dessa técnica inovadora em relação a métodos existentes, como ELISA ou espectroscopia de ressonância de plasmones de superfície para ligação, é que a interação entre lipídio e proteína ocorre em um ambiente semelhante a uma membrana e que as proteínas ligantes podem ser purificadas e analisadas. As implicações dessa técnica estendem-se para a terapia e o diagnóstico de doenças envolvendo lipídios, porque nessas doenças a interação fisiológica entre lipídios e proteínas está prejudicada.

Para algumas dessas doenças, os alvos proteicos nem sequer são conhecidos e precisam ser identificados. Para projetar uma terapia baseada em lipídios, comece com sles lipídicos preparados a partir de uma mistura seca de quantidades equimolares de fosfatidilserina e ceramida C16 em 100 microlitros de tampão sical. Sonique por uma hora após adicionar 300 microlitros de tampão iCal, suplementado com cloreto de manganês 0,1 milimolar, centrifugue as amostras a 12.000 ×g por 20 minutos a quatro graus Celsius e, em seguida, reconstitua o pellet de vesículas lipídicas grandes em 100 microlitros de tampão sical. Adicione um nanomolar do corante fluorescente vibrant cm DII e incube a 37 graus Celsius por uma hora para facilitar a visualização da fração de sles após a separação máxima. Recupere um pellet rosa de fosfato marcado com vibrant cm dai, sles de ceramida siriana, por centrifugação e reconstitua em 100 microlitros de tampão tris.

Em seguida, para preparar um lisado celular livre de detergente, sonique as células em 300 microlitros de tampão hipertônico contendo 10 milimolares de tris, cloreto de hidrogênio, inibidores de protease e fosfatase, e centrifugue. Para remover detritos membranosos, adicione agora o lisado celular claro à suspensão física de lipídios e incube a mistura por duas horas a quatro graus Celsius. Como os lisados celulares podem conter membranas endógenas com fosfato aerina, recomenda-se remover o lisado dessas membranas por etapas adicionais de centrifugação.

Suplemente a mistura de reação com 20 microlitros de um tampão de ligação XNV e 50 microlitros de uma solução contendo microesferas magnéticas conjugadas ao XNV; incube por uma hora a quatro graus Celsius e realize a separação magnética de células ativadas conforme recomendado pelo protocolo do fabricante. Em seguida, monitore a fluorescência vibrante do CM DII nas frações de fluxo e de eluição utilizando um leitor de fluorescência de microplacas para determinar a presença e quantidade de les lipídicos em um ensaio de competição com anticorpos. Para verificar a especificidade da reação de ligação da PKC A para as vesículas de ceramida fosfo-serina, incube um micrograma do anticorpo coelho policlonal anti-PKC Zeta com um lisado celular por uma hora a quatro graus Celsius, seguido pela incubação com as vesículas lipídicas.

Prossiga com a análise por SDS-PAGE e imunoblotting da ligação proteica ao fosfato de serina de ceramida no eluato máximo para a reconstituição in vitro de um complexo de polaridade lipídio-proteína. Comece com a preparação de um pellet cor-de-rosa de vesículas de fosfato de serina de ceramida coradas com CM-DII vibrante, conforme mostrado anteriormente; ressuspenda as vesículas em 100 microlitros de tampão Tris, suplementado com 100 micromolar de GTP-γS, um milimolar de GDP e uma combinação das proteínas recombinantes de interesse. Em seguida, incube a reação a quatro graus Celsius por três horas. Depois, adicione cinco microlitros de uma solução estoque 20x de um tampão X-in-V e 50 microlitros de microesferas magnéticas conjugadas com X-in-V.

Incube a mistura sob agitação suave por mais 30 minutos a quatro graus Celsius. Prossiga com a separação magnética de células NX NV conforme recomendado pelo protocolo do fabricante para facilitar a precipitação. Suplemente a fração de eluição com 10 microgramas de albumina e pura.

Concentre as proteínas por precipitação com flúor de weyl. A fase inferior consiste em clorofórmio-metanol com cm dii vibrante enriquecido. A fase intermédia acastanhada contém as microesferas magnéticas e a proteína precipitada.

Quantifique as vesículas lipídicas ellu pela detecção de cm dii cor rosa vibrante na fase orgânica de clorofórmio-metanol da reação weyl flu. Use quantidades iguais de vesículas lipídicas para normalizar as quantidades de proteína entre as amostras e analise por SDS page. Western blotting.

Um lisado livre de detergente de células MDCK expressando a PKC Zeta de comprimento completo ligada, na extremidade C-terminal, a uma proteína verde fluorescente ou a um domínio ligador de ceramida. No extremo C-terminal da PKC Zeta foi incubado com fosfo serina.

Vesículas de ceramida após a elucidação da coluna max, as proteínas foram analisadas por imunoblotagem. O fragmento ligante de ceramida C20 Zeta, EGFP e a PKC Zeta de comprimento completo foram recuperados do EIT da coluna max, consistente com a especificidade e eficácia do procedimento lyx. O controle negativo EGFP, que não se ligou ao fosfato, em nossas vesículas de ceramida sírias não foi detectável no eit.

Quando o Linx é combinado com outros métodos, como eletroforese em gel de poliacrilamida com SDS e western blotting ou análise proteômica, é possível responder a perguntas adicionais, como quais proteínas estão presentes no complexo de proteínas ligadoras de lipídios. Após seu desenvolvimento, o LabX abriu caminho para pesquisadores na área de pesquisa de lipídios individuais explorarem a apoptose induzida por ceramida e a polaridade celular em células-tronco neurais e células epiteliais.