Name: Cromatografia de afinidade lipídica mediada por vesículas com separação de células Magnetic Ativado (LIMACS): um novo método para analisar proteínas lipídios Interação (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-04-26T16:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 33 s
Description: Aprenda a técnica LIMACS para analisar interações proteína-lipídeo em ambiente semelhante a membrana usando vesículas lipídicas e separação magnética. Este método permite purificar e identificar proteínas de ligação a lipídeos com relevância fisiológica superior.

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Este trabalho foi financiado pelo NIH concede R01NS046835 e R01AG034389, ea March of Dimes conceder 6FY08-322. Um agradecimento especial é dedicado a Sra. Eleanor Brown (Miltenyi Biotec, Auburn, CA), que ajudou tremendamente com a sua visão sobre a tecnologia MACS. Miltenyi generosamente forneceu o material utilizado para a demonstração dos experimentos, sem nenhum custo. Agradeço também ao Dr. Guanghu Wang (Medical College of Geórgia / Georgia Health Sciences University, Augusta, GA), que gerou o PKCζ expressar linhas celulares. Apoio por parte do Instituto de Medicina Molecular da Faculdade de Medicina da Geórgia / Georgia Health Sciences University (sob direção do Dr. Lin Mei) também é reconhecido.

1. Introdução A cromatografia de afinidade lipídica mediada por vesículas usando magnético-activated cell sorting (LIMACS) técnica foi desenvolvida em nosso laboratório para isolar complexos ceramida-proteína associada 1-3. Originalmente, as vesículas lipídicas eram feitas de ceramida e fosfatidilserina, o que permitiu a MACS usando partículas magnéticas conjugado com anexina V (altamente afim de fosfatidilserina) para isolar as vesículas e suas proteínas associadas. Temos usado a técnica para o LIMACS na reconstituição in vitro de um complexo de polaridade ceramida-associado eo isolamento de ceramida proteínas de ligação de célula lisados ​​3. LIMACS pode ser modificada usando outros parceiros de interação para o isolamento das vesículas (por exemplo, glicolipídeo-specifc lectinas ou anticorpos lipídica). 2. Procedimentos experimentais Preparação de vesículas lipídicas e Ensaios aPKCBinding <ol><li> Vesículas lipídicas são obtidos a partir de misturas secas de quantidades equimolares de fosfatidilserina (105 mg) e C16-ceramida (85 mcg), seguindo procedimentos modificados para a preparação de lipossomas grandes 1,4-7. </li><li> As misturas de lipídios são, então, ressuspenso e sonicado por 1 h em 100 l de tampão vesícula consistindo de 50 mM Tris / HCl (pH 7,5) e 150 mM NaCl. </li><li> Depois de adicionar 300 ml de tampão vesícula suplementado com 0,1 mM MnCl 2, as amostras são centrifugadas a 12.000 g por 20 min μ a 4 ° C. </li><li> O pellet (vesículas lipídicas grande) é ressuspenso em 100 ul de tampão vesícula e incubadas com 1 nmol de Vybrant CM-dii por 1 hora a 37 ° C para visualizar a fração vesícula após a separação MACS. Vybrant CM-DII é um corante vermelho fluorescente especificamente incorporando em membranas lipídicas. </li><li> Um detergente livres lisado celular é preparado por sonicação / homogeneização das células em 300 ml de tampão hipotônico (10 mM Tris / HCl (pH 7,0) com protease e os inibidores da fosfatase), seguida pela remoção de detritos membranosa por centrifugação. A etapa de centrifugação a 100.000 xg por 1 h deve ser adicionado para evitar a contaminação do lisado celular com membranas endógena contendo fosfatidilserina. </li><li> O lisado limpo é adicionado à suspensão vesícula de lipídios, ea mistura é incubada por 2 horas a 4 ° C. </li><li> A mistura de reação é complementado com 20 l de tampão 20x anexina V vinculativo e 50 ul de uma solução contendo esferas magnéticas conjugadas a anexina V seguido de incubação por 1 hora a 4 ° C. </li><li> MACS é realizada de acordo com as instruções do fabricante (Miltenyi Biotec, Inc.) protocolo. A presença ea quantidade de vesículas lipídicas é determinada através do monitoramento da fluorescência CM-dii Vybrant nas frações de fluxo e eluição utilizando uma leitora de microplacas de fluorescência. </li><li> A correlação linear entre a quantidade de lipídios vesicular e intensidade de fluorescência da vesícula-bound Vybrant CM-dii é verificada pela quantitativa de alto desempenho cromatografia em camada fina (HPTLC) da mistura de lipídios aplicada a anexina V-Macs. </li><li> A especificidade da reação de ligação de proteínas aPKC ou outros, para as vesículas ceramida / fosfatidilserina é verificada por um ensaio de competição de anticorpos usando 1 mg de anticorpo anti-coelho PKCζ policlonais para incubar o lisado celular por 1 hora a 4 ° C antes da incubação com os lipídios vesículas. </li><li> A proteína de ligação a ceramida / fosfatidilserina vesículas no eluato MACS é analisada por SDS-PAGE e immunoblotting. </li></ol> In vitro complexa polaridade lipídios proteínas <ol><li> A reconstituição in vitro de um complexo de proteína-lipídica polaridade é realizada seguindo o procedimento LIMACS como descrito na seção anterior. Em resumo, fosfatidilserina (420 mg) e C16-ceramida (107 mg) é seco a partir de solvente orgânico. </li><li> Os lipídios são secas sob sonicação ressuspenso em 500 mL de tampão vesícula (50 mM Tris / HCl, pH 7,5, 150 mM NaCl). </li><li> Cinco mL de 10 mM MnCl2, 1 ml de Vybrant CM-DII, e 500 ng de PKCζ (recombinante humana) é adicionada ea mistura de reação incubada undergentle agitação por 60 min a 4 ° C. </li><li> Vybrant CM-dii manchada fosfatidilserina / ceramida vesículas são recuperadas por centrifugação a 12.000 xg por 60 min a 4 ° C. </li><li> O pellet (rosa) é ressuspenso em 100 mL tampão Tris e suplementado com γS-GTP (100 mM), o PIB (1 mM), GST-Par6 (100 ng) ou GST-Cdc42 (500 ng) e mais incubadas por 3 h, a 4 ° C (qualquer outra combinação de proteínas recombinantes de interesse pode ser usado aqui). </li><li> Anexina V-tampão (5 mL de uma solução estoque 20x) e anexina V conjugada esferas magnéticas (50 ul) são adicionados a mistura de reação e incubado sob agitação suave por mais 30 min a 4 ° C. </li><li> Anexina V-MACS é realizada seguindo o protocolo do fornecedor, conforme descrito anteriormente. </li> A fração de eluição (1 ml) é suplementado com 10 mg de ovalbumina puro como ajuda de precipitação. A proteína é concentrado por Wessel-Flügge precipitação e analisados ​​por SDS-PAGE/immunoblotting como descrito anteriormente 8. <li> A quantidade de vesículas lipídicas eluída é quantificado pela detecção de Vybrant CM-dii (rosa) na fase orgânica (clorofórmio metanol /) da reação de precipitação Wessel Flügge. A quantidade de proteína analisado é normalizado em quantidades iguais de vesículas lipídicas. </li></ol> 3. Resultados LIMACS purificação de PKCζ-EGFP e do domínio de ligação de ceramida C20ζ-EGFP A lisado detergente livres de células MDCK expressar comprimento total PKCζ C-terminal ligada à proteína verde fluorescente (EGFP-FLζ) ou um domínio de ligação de ceramida no C-terminal de PKCζ (C20ζ-EGFP) foi incubada com fosfatidilserina / vesículas ceramida como descrito em procedimentos experimentais. Após eluição da coluna de MACS, proteína foi analisada através immunoblotting e anticorpos contra PKCζ e EGFP para detecção da proteína eluída 2. <img src="/files/ftp_upload/2657/2657fig1.jpg" alt="Figura 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 1"> Figura 1. LIMACS de EGFP-rotulados PKCζ e seu fragmento C-terminal C20ζ usando fosfatidilserina / ceramida vesículas. Detergente livres de lisados ​​de células MDCK expressando EGFP (como um controle não vinculativo), comprimento total PKCζ-EGFP, ou a ligação de ceramida, C-terminal de fragmento C20ζ-EGFP foram incubadas com fosfatidilserina / vesículas ceramida tal como descrito na seção de procedimentos experimentais . Depois de usar LIMACS, a proteína foi eluída com tampão de amostra SDS e analisadas por SDS-PAGE e immunoblotting. O painel esquerdo mostra que EGFP não se ligam às vesículas retidos com o V-linked anexina esferas magnéticas. O painel do meio e da direita mostra que o comprimento total PKCζ-EGFP e C20ζ-EGFP foram retidos devido à ligação de ceramida.

<ol><li>Wang, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+binding+to+ceramide+activates+protein+kinase+Czeta+before+the+formation+of+a+pro-apoptotic+complex+with+PAR-4+in+differentiating+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Direct binding to ceramide activates protein kinase Czeta before the formation of a pro-apoptotic complex with PAR-4 in differentiating stem cells.</a> J Biol Chem. 280, 26415-26424 (2005).</li>
<li>Wang, G., Krishnamurthy, K., Umapathy, N. S., Verin, A. D., Bieberich, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+carboxyl-terminal+domain+of+atypical+protein+kinase+Czeta+binds+to+ceramide+and+regulates+junction+formation+in+epithelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">The carboxyl-terminal domain of atypical protein kinase Czeta binds to ceramide and regulates junction formation in epithelial cells.</a> J Biol Chem. 284, 14469-14475 (2008).</li>
<li>Chalfant, C. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((De+novo+ceramide+regulates+the+alternative+splicing+of+caspase+9+and+Bcl-x+in+A549+lung+adenocarcinoma+cells.+Dependence+on+protein+phosphatase-1%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">De novo ceramide regulates the alternative splicing of caspase 9 and Bcl-x in A549 lung adenocarcinoma cells. Dependence on protein phosphatase-1.</a> J Biol Chem. 277, 12587-12595 (2002).</li>
<li>Simon, C. G., Holloway, P. W., Gear, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Exchange+of+C%2816%29-ceramide+between+phospholipid+vesicles%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Exchange of C(16)-ceramide between phospholipid vesicles.</a> Biochemistry. 38, 14676-14682 (1999).</li>
<li>Goni, F. M., Contreras, F. X., Montes, L. R., Sot, J., Alonso, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biophysics+%28and+sociology%29+of+ceramides%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem+Soc+Symp%22%5BJournal%5D)">Biophysics (and sociology) of ceramides.</a> Biochem Soc Symp. , 177-188 (2005).</li>
<li>Kumagai, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CERT+mediates+intermembrane+transfer+of+various+molecular+species+of+ceramides%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">CERT mediates intermembrane transfer of various molecular species of ceramides.</a> J Biol Chem. 280, 6488-6495 (2005).</li>
<li>Wessel, D., Flugge, U. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+method+for+the+quantitative+recovery+of+protein+in+dilute+solution+in+the+presence+of+detergents+and+lipids%5BTitle%5D)+AND+%22Anal+Biochem%22%5BJournal%5D)">A method for the quantitative recovery of protein in dilute solution in the presence of detergents and lipids.</a> Anal Biochem. 138, 141-143 (1984).</li>
</ol>

Não há conflitos de interesse declarados.

Para testar a interação específica entre um lipídio e sua proteína de ligação é prejudicada pela incorporação de lipídios na membrana da célula. A membrana celular consiste de uma mistura de lipídios e proteínas diversas e é organizado em microdomínios lipídicos ou jangadas. Portanto, o co-purificação de proteínas microdomínios e não pode distinguir claramente se uma proteína diretamente liga-se a um lipídio ou só é enriquecido em uma estrutura microdomínio. Outros métodos usando lipídios definido revestido em superfíci...

Anexina V conjugada esferas magnéticas e MACS micro e minicolunas foram fornecidos pela Miltenyi Biotec, Inc. (Auburn, CA). Todos os lipídios foram de maior pureza e obtido a partir de Lipídeos Avanti Polar (Alabaster, AL).

cromatografia de afinidade lipídica mediada por vesículas com separação de células magnetic ativado (limacs): um novo método para analisar proteínas lipídios interação

Lipid Vesicle-mediated Affinity Chromatography using Magnetic Activated Cell Sorting (LIMACS): a Novel Method to Analyze Protein-lipid Interaction

A análise de interação proteína lipídica é difícil porque os lipídios são incorporados nas membranas celulares e, portanto, inacessíveis para a maioria dos procedimentos de purificação. Como alternativa, os lipídios podem ser revestidos em superfícies planas como as usadas em lipídios ELISA e ressonância Plasmon espectroscopia. No entanto, lipídios revestimento de superfície não formam estruturas microdomínio, que pode ser importante para as propriedades de lipídios vinculativo. Além disso, estes métodos não permitem a purificação de grandes quantidades de proteínas de ligação a lipídeos seu alvo. Para superar essas limitações dos testes de interação de proteínas lipídios e purificar proteínas de ligação de lipídios foi desenvolvido um novo método denominado de lipídios cromatografia de afinidade vesícula mediada magnética usando-activated cell sorting (LIMACS). Neste método, vesículas lipídicas são preparados com os lipídios alvo e fosfatidilserina como os lipídios âncora para anexina V MACS. Fosfatidilserina é um fosfolipídio de membrana onipresente celular que mostra alta afinidade à proteína anexina V. Usando esferas magnéticas conjugadas a anexina V vesículas lipídicas contendo fosfatidilserina-se ligará à esferas magnéticas. Quando as vesículas lipídicas são incubadas com uma célula lisado a proteína de ligação ao lipídios alvo também será obrigado a as contas e pode ser co-purificado utilizando MACS. Este método também pode ser usado para testar se proteínas recombinantes reconstituir um complexo de proteínas de ligação ao lipídios alvo. Temos utilizado este método para mostrar a interação da PKC atípica (aPKC) com a ceramida sphingolipid e co-purificar resposta a apoptose de próstata 4 (PAR-4), uma proteína de ligação a ceramida associada aPKC. Temos também utilizado este método para a reconstituição de um complexo de ceramidas associados da aPKC recombinante com a célula de polaridade proteínas relacionadas Par6 e Cdc42. Desde vesículas lipídicas pode ser preparado com uma variedade de esfingo ou fosfolipídios, LIMACS oferece um teste versátil para lipídios proteínas de interação em um ambiente de lipídios que se assemelha de perto o da membrana celular. Complexos de proteína adicional de lipídios pode ser identificado através da análise proteômica de proteínas lipídios vinculativo co-purificada com as vesículas lipídicas.

Para testar a interação de uma proteína com o seu alvo de lipídios foi utilizado MACS e anexina V conjugada esferas magnéticas e vesículas de lipídios sintetizados a partir de lipídios alvo e fosfatidilserina anexina V vinculativo. Proteínas vinculado à lipídica alvo são co-purificados e analisados ​​após eluição dos grânulos.

Cromatografia de afinidade lipídica mediada por vesículas com separação de células Magnetic Ativado (LIMACS): um novo método para analisar proteínas lipídios Interação

A análise da interação proteína-lipídio é difícil porque os lipídios estão incorporados nas membranas celulares e, portanto, inacessíveis à maioria dos métodos de purificação...

Este experimento tem como objetivo identificar proteínas ligadoras de lipídios e analisar a interação entre proteínas e lipídios em um ambiente de membrana definido. Proteínas de frações lipídicas de homogeneizado celular são incubadas com vesículas lipídicas recém-preparadas a partir de fosfatidilserina e ceramida. A seguir, a mistura de reação é suplementada com esferas magnéticas conjugadas com Xin V para ancorar as proteínas associadas às vesículas lipídicas nas esferas magnéticas. Em seguida, as vesículas lipídicas ligadas a proteínas são purificadas por meio de separação celular ativada por campo magnético.Para identificar os resultados demonstrados da proteína ligada ao lipídio, utilize eletroforese SDS-PAGE seguida de Western blotting para mostrar a purificação de PKC atípica endógena e recombinante e um domínio específico de ligação à ceramida expresso em células MDCK. A principal vantagem dessa nova técnica em comparação com métodos existentes, como ELISA ou espectroscopia de ressonância de plasmones de superfície para ligação superficial, é que a interação entre lipídio e proteína ocorre em um ambiente semelhante a uma membrana e que as proteínas ligantes podem ser purificadas e analisadas. As implicações dessa técnica estendem-se para a terapia e o diagnóstico de doenças envolvendo lipídios, pois nessas doenças a interação fisiológica entre lipídio e proteína está prejudicada.Para algumas dessas doenças, os alvos proteicos nem sequer são conhecidos e precisam ser identificados. Para projetar uma terapia baseada em lipídios, comece com sles lipídicos preparados a partir de uma mistura seca de quantidades equimolares de fosfatidilserina e ceramida C16 em 100 microlitros de tampão sical. Sonique por uma hora após adicionar 300 microlitros de tampão iCal, suplementado com cloreto de manganês 0,1 milimolar. Centrifugue as amostras a 12.000 ×g por 20 minutos a quatro graus Celsius, depois ressuspenda o pellet de vesículas lipídicas grandes em 100 microlitros de tampão sical. Adicione um nanomolar do corante fluorescente vibrant cm DII e incube a 37 graus Celsius por uma hora para facilitar a visualização da fração de sles após a separação máxima. Recupere um pellet rosa de fosfato marcado com vibrant cm dai, sles de ceramida síria, por centrifugação e ressuspenda em 100 microlitros de tampão tris.Em seguida, para preparar um lisado celular livre de detergente, sonique as células em 300 microlitros de tampão hipertônico contendo 10 milimolares de tris, cloreto de hidrogênio, inibidores de protease e fosfatase, e centrifugue. Para remover detritos membranosos, adicione agora o lisado celular claro à suspensão física de lipídios e incube a mistura por duas horas a quatro graus Celsius. Como os lisados celulares podem conter membranas endógenas com fosfato aerina, recomenda-se limpar o lisado dessas membranas por etapas adicionais de centrifugação.Suplemente a mistura de reação com 20 microlitros de um tampão de ligação XNV e 50 microlitros de uma solução contendo microesferas magnéticas conjugadas ao XNV; incube por uma hora a quatro graus Celsius e realize a separação magnética de células ativadas conforme recomendado pelo protocolo do fabricante. Em seguida, monitore a fluorescência vibrante do CM DII nas frações de fluxo e de eluição utilizando um leitor de fluorescência de microplacas para determinar a presença e quantidade de les lipídicos em um ensaio de competição com anticorpos. Para verificar a especificidade da reação de ligação da PKC A para as vesículas de ceramida fosfo-Serina, incube um micrograma do anticorpo coelho policlonal anti-PKC Zeta com um lisado celular por uma hora a quatro graus Celsius, seguido pela incubação com as vesículas lipídicas.Prossiga com a análise por SDS-PAGE e imunoblotting da ligação proteica ao fosfato de serina ceramida no eluato máximo para a reconstrução in vitro de um complexo de polaridade lipídio-proteína. Inicie com a preparação de um pellet cor-de-rosa de vesículas de fosfato de serina ceramida coradas com CM-DII vibrante, conforme mostrado anteriormente; ressuspenda as vesículas em 100 microlitros de tampão Tris, suplementado com 100 micromolar de GTP-γS, um milimolar de GDP e uma combinação das proteínas recombinantes de interesse. Em seguida, incube a reação a quatro graus Celsius por três horas. A seguir, adicione cinco microlitros de uma solução estoque 20x de um tampão X-in-V e 50 microlitros de microesferas magnéticas conjugadas com X-in-V.Incube a mistura sob agitação suave por mais 30 minutos a quatro graus Celsius. Prossiga com a separação magnética de células NX NV conforme recomendado pelo protocolo do fabricante para facilitar a precipitação. Suplemente a fração de eluição com 10 microgramas de albumina e pura.Concentre as proteínas por precipitação com flúor de weyl. A fase inferior consiste em clorofórmio-metanol com cm dii vibrante enriquecido. A fase intermédia acastanhada contém as microesferas magnéticas e a proteína precipitada.Quantifique as vesículas lipídicas ellu pela detecção de cm dii cor-de-rosa e vibrante na fase orgânica de clorofórmio-metanol da reação weyl flu. Utilize quantidades iguais de vesículas lipídicas para normalizar as quantidades de proteína entre as amostras e analise por eletroforese em gel de SDS. Western blot.Um lisado livre de detergente de células MDCK expressando a PKC Zeta de comprimento completo com a extremidade C ligada a uma proteína verde fluorescente ou a um domínio ligador de ceramida. Na extremidade C da PKC Zeta foi incubado com fosfo serina.Vesículas de ceramida após a elucidação da coluna max, as proteínas foram analisadas por imunoblotagem. O fragmento ligante de ceramida C20 Zeta, EGFP e a PKC Zeta de comprimento completo foram recuperados do EIT da coluna max, consistente com a especificidade e eficácia do procedimento lyx. O controle negativo EGFP, que não se ligou ao fosfato, em nossas vesículas de ceramida sírias, não foi detectável no eit.Quando o Linx é complementado com outros métodos, como eletroforese em gel de poliacrilamida com SDS e western blotting ou análise proteômica, perguntas adicionais podem ser respondidas, como quais proteínas estão no complexo de proteínas ligadoras de lipídios. Após seu desenvolvimento, o LabX abriu caminho para pesquisadores na área de pesquisa de lipídios específicos explorarem a apoptose induzida por ceramida e a polaridade celular em células-tronco neurais e células epiteliais.

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