Name: A observação direta de Fagocitose e NET-formação por neutrófilos em pulmões infectados usando dois fótons Microscopia (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-06-02T12:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 50 s
Description: Aprenda a visualizar fagocitose e formação de NETs por neutrófilos em pulmões infectados usando microscopia de dois fótons. Este método permite observar respostas imunes in vivo com alta resolução.

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Os autores gostariam de agradecer ao Dr. Lars Philipsen para ajudar com a otimização dos filmes intravital, Dr. Jonathan Lindquist para ler cuidadosamente o manuscrito, e todos os membros do laboratório Gunzer para discussões úteis e comentários durante o desenvolvimento do método. Este trabalho foi financiado por concessões do Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG, SFB 854) para MG

1. Infecção <ol><li> Conídios inchados de Aspergillus fumigatus (ATCC 46645) são gerados por pré-incubação em RPMI 1640 (Biochrom AG, Berlin, Alemanha), suplementado com 5% FCS (v / v). 2x10 7 conídios de descanso são ressuspendido em 5 ml de meio e incubados em uma placa de cultura de tecidos bem-6 (TPP AG; Trasadingen, Suíça, catalogo 92.006) por 7h a 37 ° C. </li><li> Após o período de inchaço, os esporos são fluorescente etiquetado, adicionando 10 ml de solução estoque calcofluor branco (Sigma Aldrich, Deisenhofen, Alemanha, catalogo F3543; [25 mg / ml] em DMSO) a cada um contendo Aspergillus bem no 6-bem placa, atingindo uma concentração calcofluor final de 50 mcg / ml RPMI. Após a mistura suave, os esporos são incubados por um adicional de 15 min a 37 ° C. </li><li> Na próxima etapa, os esporos são colhidas por filtração através de um filtro de 70 mM de células (BD Biosciences, Heidelberg, Alemanha). Depois de lavar uma vez com 10 ml de PBS (centrifugue a 900xg por 5 min à temperatura ambiente), o pellet é ressuspendido em 2 ml de PBS, eo número total de conídios inchados determinada contando com uma câmara de Neubauer. Finalmente, a suspensão de esporos é girada para baixo em 900xg por 5 min à temperatura ambiente, o sobrenadante é cuidadosamente removido eo pellet ressuspenso para a concentração final de 1x107 esporos por 100 mL de PBS. </li><li> Para a infecção, 100 ml de solução de esporos é aplicada intratraqueal em camundongos fêmeas (C57/BL6, 8-10 semanas de idade, Harlan, Alemanha). Se os neutrófilos são a serem observados, bem como, o uso de Lys-EGFP ratos, levando EGFP sob o promotor lisozima 1 é recomendado. Comece por anestesiar o animal com uma injeção única de 150 ip solução cetamina / Rompun mL (Inresa Arzneimittel GmbH, Freiburg, Alemanha (cetamina) e Bayer Vital GmbH, Leverkusen, Alemanha (Rompun), 1 ml cetamina [50 mg / ml] + 0,5 ml Rompun [2%] + 3,5 ml estéril NaCl [0,9%]). 5 minutos mais tarde o rato anestesiado pode ser fixado com um elástico pelos seus dentes para a rampa de acesso (ou seja, uma superfície inclinada) para facilitar a intubação (suplementar figura 1). Utilizando uma pinça, a língua é puxada para um lado e um cateter venoso 22G habitação (B. Braun AG, Melsungen, Alemanha, Vasofix Braunüle) pode ser gentilmente inserido na traquéia sob iluminação permanente com uma lâmpada no pescoço de ganso. A inserção bem sucedida do cateter é verificada pela observação movimento regular do tórax do animal com a freqüência do ventilador mecânico. Quando a intubação sucesso foi confirmado, 100 mL de suspensão de esporos é aplicado utilizando uma micropipeta 100 ul. Este volume deve ser inaladas pelo animal, sem qualquer ajuda adicional em 1-2 s. Uma distribuição maior de partículas de fungos dentro do pulmão é conseguido através de ventilação mecânica do animal infectado por 2 minutos com um respirador para pequenos animais (MiniVent, Hugo Sachs, March-Hugstetten, Alemanha) a uma taxa de 250 respirações por minuto e um volume de inalação de 300 mL por respiração (suplementar figura 2). Após a infecção os animais são devolvidos às suas gaiolas e observados a cada 5 minutos até ambulatorial novamente. Camundongos não mostram qualquer evidência de dor ou sofrimento durante o período de incubação seguinte. </li></ol> 2. Preparação de pulmão <ol><li> 7 h após a infecção com os esporos, o animal é sacrificado por uma overdose de isoflurano (Baxter GmbH, Unterschleiβheim, Alemanha), até os movimentos ea respiração cessaram há mais de 30 segundos. Esta é seguida por toracotomia como um método secundário para garantir a morte clínica e permita a visualização e acesso da traquéia e pulmões. Em seguida, o peito é cuidadosamente abriu para expor o pulmão e do trato respiratório superior. Em seguida, outro cateter venoso 22G habitação é inserido na traquéia a partir da epiglote expostos. Através deste túbulo os pulmões são preenchidos com 1 ml pré-aquecido baixa temperatura de fusão agarose (2% w / v, Promega, Mannheim, Alemanha), utilizando uma seringa de 1 ml Omnifix (B. Braun). Assim como os pulmões estão cheios da traquéia é amarrado com um pequeno pedaço de fio de costura e todo o animal é colocado em um refrigerador a 4 ° C. </li><li> 15 min depois, quando a agarose solidificou, todo o pulmão é extirpado início da traquéia. Usando um par de tesouras afiadas pontas, o lobo do pulmão direito é posteriormente removido, a superfície inferior é brevemente secos em uma folha de papel de seda e, em seguida, o lobo inteiro está colado ao bloco de preparação de um (Campden Instruments, Reino Unido, vibratome 752M Vibroslice ), utilizando uma gota de cola de tecido para fixação (Carl Roth GmbH, Karlsruhe, Alemanha, Roti-Coll 1). Após 1 min o bloco é instalado na câmara de corte do vibratome, que é preenchido com pré-refrigeradas (4 ° C) PBS. O vibratome é definida como uma vibração mid-range (5 out of 10 max.) E também a velocidade moderada (5 out of 10 max.) Tal que uma seção transversal horizontal dade pulmão é produzido. A metade superior do órgão é então transferido para uma pequena placa de Petri de plástico (5 cm de diâmetro) onde ele é invertido e fixada com uma máquina de lavar self-made plana (1 cm de diâmetro interno) que é coberta por um conjunto de fios de nylon paralelos, cada 1 mm de distância (figura suplementar 3). Finalmente a placa de Petri é preenchido com 10 ml de PBS suplementado com 10 ml do corante DNA Sytox Orange [mM 5] (Invitrogen, Alemanha), resultando em uma concentração final de 5 mM de corante. </li></ol> 3. 2-fótons microscopia a laser <ol><li> Placa de Petri contendo a amostra de pulmão é, então, instalado sob a objetiva do microscópio para que o buffer pode ser aquecido a 37 ° C por um sensor de temperatura controlada aquecedor (suplementar figura 4). 2-fótons de microscopia é então realizada sobre a superfície de corte inteira usando um microscópio Zeiss LSM 710 NLO em uma posição vertical estágio Examiner Axio equipada com uma lente de água 20xNA1.0 dipping (Zeiss, Jena, Alemanha). Para geração de imagens, diferentes áreas ao longo da seção são digitalizados para 400 M de profundidade usando um comprimento de onda de 800 nm iluminação detectar verde (530 nm) e vermelho (580 nm) de fluorescência, bem como a geração de segundo harmônico (SHG) de sinal eo azul calcofluor fluorescência (emissão de 400-470 nm), com detectores externos não descanned (NDD). Além de 2-D imagens e filmes lapso de tempo (1 imagem a cada 5-10 segundos), único ou repetitivo stacks 3-dimensional da imagem pode ser posteriormente processado como renderings voxel ou simples imagens foco estendido ou 4-D de dados (3D ao longo do tempo), utilizando pacotes de software diferentes. Esta configuração microscópica permite a observação do comportamento celular em um ambiente quase intacta que, uma vez que constitui a porta de entrada para uma variedade de organismos patogênicos, é de relevância imunológica enorme. Motilidade celular, fagocitose e produção endógena NET por neutrófilos após a infecção com o molde Aspergillus fumigatus pode ser facilmente investigada sob essas condições in situ. </li></ol> 4. Resultados representante Se feito corretamente a imagem irá gerar 2 - ou 3 cores slides ou filmes. Apesar de coloração é feita em um procedimento pós-processamento e é, portanto, livremente adaptável, que geralmente selecionar um esquema de cores que reflecte a cor natural do corante / sinal, que é detectado no canal relativa. Assim, os corantes Sytox são retratados em vermelho, o fungo, assim como o sinal de SHG é mostrado em azul e, se presente, EGFP marcado células são coradas em verde. No primeiro exemplo (Fig. 1) o sinal de SHG azul retrata as fibras do tecido de um pulmão de não-infectados e o sinal vermelho Sytox é produzida por núcleos de células do pulmão residente na corte aberto pela vibratome. No segundo exemplo (Fig. 2) um pulmão infectado é mostrado, onde ambas as estruturas, alveolar, assim como massas fúngicas, aparecem em azul, enquanto núcleos e redes são manchados de vermelho. O terceiro exemplo (Fig. 3) é de um animal transgênico Lys-EGFP onde para além das estruturas de azul e vermelho os neutrófilos verde também pode ser visto. A migração de neutrófilos e sua fagocitose de elementos individuais de fungos em sequências de lapso de tempo é mostrado no filme suplementar. <img src="/files/ftp_upload/2659/2659fig1.jpg" alt="Figura 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 1"> Figura 1. A aparência de uma fatia de pulmão de não-infectados em 2 cores-2-fótons microscopia. Uma fatia de pulmão foi preparado a partir de um não-infectados C57/BL6 mouse e fotografada, como descrito no protocolo. Aqui apresentados são o sinal de SHG da estrutura do tecido alveolar (A), o sinal Sytox de núcleos celulares cortado durante a preparação da fatia de pulmão (B), e uma sobreposição dos dois canais (C). A área de box em (C) é visto ampliado em (D). Por favor, anote o tecido fibroso na parte inferior do pulmão fatia em comparação com a organização claramente alveolar nas áreas de respiração ativa do pulmão acima. <img src="/files/ftp_upload/2659/2659fig2.jpg" alt="Figura 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 2"> Figura 2. A aparência de uma fatia de pulmão de um animal do tipo Aspergillus selvagens infectadas em 2 cores-2-fótons microscopia. Uma fatia de pulmão de um rato infectado C57/BL6 7 h antes com A. fumigatus foi preparado e fotografado como descrito no protocolo. Mostrado é a estrutura combinada de fungos e SHG do tecido alveolar (A), o sinal da NET Sytox DNA, bem como núcleos de células cortado durante a preparação da fatia de pulmão (B), e uma sobreposição dos dois canais (C) . A área de box em (C) é visto ampliado em (D). Por favor note, as áreas claramente distintas das massas fúngicas, alvéolos, e NET-estruturas são marcadas com as letras F, A e N, respectivamente. <img src="/files/ftp_upload/2659/2659fig3.jpg" alt="Figura 3" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 3"> Figura 3. A aparência de uma fatia de pulmão de uma pessoa infectada Aspergillus animais Lys-EGFP em 3 cores microscopia 2-fótons. Uma fatia de pulmão de um rato Lys-EGFP infectou 7 h antes comA. fumigatus foi preparado e fotografado como descrito no protocolo. Mostrado é a estrutura combinada de fungos e SHG do tecido alveolar (azul), o sinal Sytox de núcleos celulares e redes (vermelho), bem assim como diversos neutrófilos (verde). <img src="/files/ftp_upload/2659/2659supfig1.jpg" alt="Figura 4" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 4"> Suplementar figura 1. Fixação do mouse para a intubação. Sob cetamina / Rompun anestesia do animal é fixa com um elástico em seus dentes, a fim de facilitar a intubação com cateter 22G habitação venoso. <img src="/files/ftp_upload/2659/2659supfig2.jpg" alt="Figura 5" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 5"> Suplementar figura 2. Ventilação mecânica do mouse. O mouse intubados está infectado por um aplicativo que de 1x10 7 esporos ressuspenso em 100 mL de PBS. Uma distribuição maior de partículas de fungos dentro do pulmão é conseguido através de ventilação mecânica o rato infectado com um respirador para pequenos animais. <img src="/files/ftp_upload/2659/2659supfig3.jpg" alt="Figura 6" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 6"> Suplementar figura 3. Fixação do pulmão do lóbulo. Após a preparação do lobo do pulmão direito o órgão é fixado em uma placa de Petri pelo uso de uma arruela de laboratório feitos plana que é coberto por um conjunto de fios de nylon paralelos. <img src="/files/ftp_upload/2659/2659supfig4.jpg" alt="Figura 6" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 6"> Suplementar figura 4. 2-fótons de configuração de imagem. A placa de Petri contendo o lobo do pulmão direito é instalado sobre um tapete de aquecimento sob o microscópio dois fótons após a adição do corante DNA Sytox Orange. Filme suplementar:. Neutrófilos Os neutrófilos que migram e phagocytosing elementos fúngicos nos pulmões Aspergillus infectados visto por lapso de tempo de 2 fótons de microscopia de um pulmão fatia de vida 7 h após a infecção com o fungo são verdes, elementos fúngicos e SHG são azuis, e núcleos de células como bem como NET-estruturas são representadas em vermelho. O tempo real do experimento é mostrado no canto inferior direito. A barra de escala representa 50 mm. <a href="/files/ftp_upload/2659/5_9_1%20-%20supplemental.mpg">Clique aqui para assistir ao vídeo</a>

<ol><li>Faust, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Insertion+of+enhanced+green+fluorescent+protein+into+the+lysozyme+gene+creates+mice+with+green+fluorescent+granulocytes+and+macrophages%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Insertion of enhanced green fluorescent protein into the lysozyme gene creates mice with green fluorescent granulocytes and macrophages.</a> Blood. 96, 719-719 (2000).</li>
<li>Gunzer, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+spectrum+of+biophysical+interaction+modes+between+T+cells+and+different+antigen+presenting+cells+during+priming+in+3-D+collagen+and+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">A spectrum of biophysical interaction modes between T cells and different antigen presenting cells during priming in 3-D collagen and in vivo.</a> Blood. 104, 2801-2801 (2004).</li>
<li>Mempel, T. R., Henrickson, S. E., von Andrian, U. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((T-cell+priming+by+dendritic+cells+in+lymph+nodes+occurs+in+three+distinct+phases%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">T-cell priming by dendritic cells in lymph nodes occurs in three distinct phases.</a> Nature. 427, 154-154 (2004).</li>
<li>Bousso, P., Robey, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamics+of+CD8%28%2B%29+T+cell+priming+by+dendritic+cells+in+intact+lymph+nodes%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Dynamics of CD8(+) T cell priming by dendritic cells in intact lymph nodes.</a> Nat. Immunol. 4, 579-579 (2003).</li>
<li>Beuneu, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visualizing+the+functional+diversification+of+CD8%28%2B%29+T+cell+responses+in+lymph+nodes%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">Visualizing the functional diversification of CD8(+) T cell responses in lymph nodes.</a> Immunity. 33, 412-412 (2010).</li>
<li>Aimanianda, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Surface+hydrophobin+prevents+immune+recognition+of+airborne+fungal+spores%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Surface hydrophobin prevents immune recognition of airborne fungal spores.</a> Nature. 460, 1117-1117 (2009).</li>
<li>Snelgrove, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Critical+Role+for+LTA4H+in+Limiting+Chronic+Pulmonary+Neutrophilic+Inflammation%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">A Critical Role for LTA4H in Limiting Chronic Pulmonary Neutrophilic Inflammation.</a> Science. 330, 90-90 (2010).</li>
<li>Chou, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lipid-Cytokine-Chemokine+Cascade+Drives+Neutrophil+Recruitment+in+a+Murine+Model+of+Inflammatory+Arthritis%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">Lipid-Cytokine-Chemokine Cascade Drives Neutrophil Recruitment in a Murine Model of Inflammatory Arthritis.</a> Immunity. 33, 266-266 (2010).</li>
<li>Nitschke, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((3-D+and+4-D+imaging+of+immune+cells+in+vitro+and+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Histochem.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">3-D and 4-D imaging of immune cells in vitro and in vivo.</a> Histochem. Cell Biol. 130, 1053-1053 (2008).</li>
<li>Niesner, R. A., Andresen, V., Gunzer, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intravital+2-photon+microscopy+-+focus+on+speed+and+time+resolved+imaging+modalities%5BTitle%5D)+AND+%22Immunol+Rev%22%5BJournal%5D)">Intravital 2-photon microscopy - focus on speed and time resolved imaging modalities.</a> Immunol Rev. 221, 7-7 (2008).</li>
<li>Bruns, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Production+of+Extracellular+Traps+against+Aspergillus+fumigatus+in+vitro+and+in+Infected+Lung+Tissue+is+Dependent+on+Invading+Neutrophils+and+Influenced+by+Hydrophobin+RodA%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Pathog%22%5BJournal%5D)">Production of Extracellular Traps against Aspergillus fumigatus in vitro and in Infected Lung Tissue is Dependent on Invading Neutrophils and Influenced by Hydrophobin RodA.</a> PLoS Pathog. 6, 1000873-1000873 (2010).</li>
<li>Miller, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Autonomous+T+cell+trafficking+examined+in+vivo+with+intravital+two-photon+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Autonomous T cell trafficking examined in vivo with intravital two-photon microscopy.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 100, 2604-2604 (2003).</li>
<li>Brinkmann, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neutrophil+Extracellular+Traps+Kill+Bacteria%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Neutrophil Extracellular Traps Kill Bacteria.</a> Science. 303, 1532-1532 (2004).</li>
<li>Marcos, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CXCR2+mediates+NADPH+oxidase-independent+neutrophil+extracellular+trap+formation+in+cystic+fibrosis+airway+inflammation%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Med%22%5BJournal%5D)">CXCR2 mediates NADPH oxidase-independent neutrophil extracellular trap formation in cystic fibrosis airway inflammation.</a> Nat Med. 16, 1018-1018 (2010).</li>
<li>Clark, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Platelet+TLR4+activates+neutrophil+extracellular+traps+to+ensnare+bacteria+in+septic+blood%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Med%22%5BJournal%5D)">Platelet TLR4 activates neutrophil extracellular traps to ensnare bacteria in septic blood.</a> Nat Med. 13, 463-463 (2007).</li>
<li>Bianchi, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Restoration+of+NET+formation+by+gene+therapy+in+CGD+controls+aspergillosis%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Restoration of NET formation by gene therapy in CGD controls aspergillosis.</a> Blood. 114, 2619-2619 (2009).</li>
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Microscopia em tempo real 2-photon in vivo ou em órgãos intactos ganhou importância profunda em estudos sobre a fisiologia das células do sistema imunológico ao longo dos últimos 10 anos. Foi com esta técnica que os eventos importantes, como a dinâmica de ativação de células T nos gânglios linfáticos primeiro tornou-se visível 2-4. Mais recentemente, os pesquisadores também começaram a analisar funções celulares específicas, como os primeiros passos na geração de células efetoras nos tecidos linfáticos usando essa abordagem 5. No entanto, apesar de uma série de novos conceitos biológicos foram revelados através deste método, ainda há questões importantes e desafiadoras para as quais não existem estudos visualização intravital foram publicados até agora. Isso se aplica principalmente para o pulmão de mamíferos. O aspecto interessante deste órgão, como porta de entrada para uma variedade de organismos patogênicos, torna-se uma das superfícies mais crucial em que processos imunológicos ocorrem no corpo dos mamíferos. Com cada respiração durante a vida inteira, as partículas não desejadas são inalados, alguns dos quais têm o potencial de induzir a infecções fatais 6. É auto-explicativo que em um local tão sensíveis e ameaçadas de uma rede apertada de mecanismos de defesa deve estar presente exibindo todo o repertório de respostas imunes. Por outro lado, é muito importante que a luta induzida imunológico contra agentes patogénicos potenciais em tal lugar &quot;sujo&quot; é rigidamente controlado. Reações exageradas do sistema imunológico têm um alto risco de prejudicar o próprio corpo por maciçamente ferir o tecido do órgão com a estimulação de ações inespecíficas de células imunes 7,8. À luz destes pensamentos que seria extremamente interessante e útil ter a possibilidade de investigar o comportamento das células nos pulmões de mamíferos em verdade, em condições in vivo. No entanto, o fato de que um sistema desse tipo até agora não foi implementado com sucesso aponta claramente para as enormes dificuldades que têm de ser resolvidos na criação de um protocolo de trabalho. O desafio mais exigente, provavelmente, é a estabilidade foco. O pulmão como o órgão responsável pela respiração está sob constante movimento em todas as três direções do espaço para realizar inalação. Esta circunstância por si só causa problemas de imagem grave e pode ser considerado um intravital imagers &quot;pesadelo&quot;. Já um ligeiro movimento para qualquer dimensão no espaço tem um efeito enorme deterioração da visão microscópica, que precisa ser estável com precisão micrométrica, a fim de gerar imagens significativas 9. Dada a sua concentração inerentemente locais apertados 10, microscopia de dois fótons é ainda mais sensível às instabilidades focal, como um deslocamento de uma certa estrutura no intervalo de apenas alguns micrômetros na direção Z é equivalente a uma completa perda de foco e, assim, uma experiência fracassada. O protocolo apresentado neste estudo para a observação de células imunes dentro do pulmão murino ainda não é uma aplicação in vivo, mas sim uma aproximação com a situação em um pulmão funcionalmente intactas 11. Abordagens Ex vivo de linfócitos de imagem, por exemplo, na linfa explantado nós, tem sido demonstrado que produzem resultados equivalentes a verdade em observações in vivo e, portanto, 12 são altamente relevantes 5. O observações in situ em cortes de pulmão, que só são possíveis com a nossa abordagem, realizada em um pulmão infectado logo após excisão. A integridade 3D durante o processo de corte é assegurada pela matriz agarose, um passo essencial para permitir um processo controlado com precisão de corte do pulmão. Embora seja necessário para resfriar o pulmão explantado por um curto período para permitir uma solidificação da matriz de agarose, é possível voltar para perto de condições fisiológicas das células após o corte e reaquecimento do tecido. Isto é claramente demonstrado pelos nossos dados, que demonstram que sob estas condições neutrófilos são muito ativas e exibem todo o seu potencial como fagócitos ágil, que são necessárias para o apuramento efectivo de uma infecção Aspergillus fumigatus. Eles patrulham o tecido pulmonar passando por barreiras epiteliais, a fim de atingir as partes internas dos alvéolos e, além disso eles ativamente assumir esporos de fungos 11. A principal conclusão deste trabalho foi o aparecimento de estruturas semelhantes neutrófilos armadilhas extracelular (NET) no órgão Aspergillus infectados. NET são uma descoberta muito recente de um mecanismo de defesa romance em neutrófilos 13. No entanto, desde sua descrição inicial em 2004, o número de condições fisiológicas ou patológicas em modelos animais ou humanos, onde este fenômeno tem sido observado, ou está faltando foi aumentando explosivamente 14-16. Curiosamente, apesar de tanto trabalho foi gasto nessas estruturas por tantos grupos diferentes, a maioria dos relatórios ainda estão em um nível muito descritivo e não muito ésabe sobre o mecanismo de liberação NET e seu regulamento. Com nosso protocolo pudemos pela primeira vez para mostrar fibras NET em um pulmão infectado. Além disso, conseguimos demonstrar a importância de neutrófilos recém-recrutados, bem como estruturas fúngicas molecular para a sua ocorrência ou inibição 11. Isto mostra claramente o potencial do nosso método para investigar os passos de formação única NET em mais detalhes. Pode-se pensar, por exemplo, usar neutrófilos de camundongos knock-out adequado para observar sua capacidade de formação NET em experimentos de transferência adotiva. Assim, embora a observação directa da imigração de neutrófilos do sangue periférico não é possível com este sistema, devido à falta de fornecimento de sangue depois de explante de órgãos, ainda acreditamos que o nosso protocolo é um método valioso e relativamente fácil de manusear que permite que a imagem de passos cedo ou mais tarde na defesa imunológica contra infecções pulmonares. Este é, portanto, um passo importante para investigar o fenômeno dentro do pulmão de respiração dos animais vivos.

a observação direta de fagocitose e net-formação por neutrófilos em pulmões infectados usando dois fótons microscopia

Direct Observation of Phagocytosis and NET-formation by Neutrophils in Infected Lungs using 2-photon Microscopy

Após o trato gastrointestinal, o pulmão é o segundo maior superfície para a interação entre o corpo de vertebrados e meio ambiente. Aqui, efetiva troca gasosa deve ser mantida, enquanto, ao mesmo tempo evitar a infecção pelos patógenos múltiplos que são inalados durante a respiração normal. Para conseguir isso, um conjunto soberbo de estratégias de defesa humoral e celular combinando mecanismos imunes existe. Uma das medidas mais eficazes para a defesa agudo de pulmão é o recrutamento de neutrófilos, que fagocitam os agentes patogénicos ou inalados ou matá-los, liberando substâncias químicas citotóxicas. A recente adição ao arsenal de neutrófilos é a sua liberação explosiva de DNA extracelular-NET por bactérias ou fungos que podem ser capturados ou inativados, mesmo após a liberação de células NET morreram. Apresentamos aqui um método que permite observar diretamente os neutrófilos, migração dentro de um pulmão recém-infectados, phagocytosing patógenos fúngicos, bem como visualizar a NET extensa que eles têm produzido ao longo do tecido infectado. O método descreve a preparação de espessura de pulmão viável sete horas após a infecção intratraqueal de camundongos com conídios de Aspergillus fumigatus e seu exame pelo multicolor de lapso de tempo de microscopia 2-fótons. Esta abordagem permite investigar diretamente defesa antifúngica no tecido pulmonar nativo e, assim, abre um novo caminho para a investigação detalhada de imunidade pulmonar.

Nós mostramos, como usar dois fótons de microscopia para a observação da dinâmica de granulócitos neutrófilos nos pulmões infectados, enquanto eles fagocitam patógenos ou produzir neutrófilos armadilhas extracelular (NET).

A observação direta de Fagocitose e NET-formação por neutrófilos em pulmões infectados usando dois fótons Microscopia

Após o trato gastrointestinal, o pulmão é a segunda maior superfície de interação entre o corpo dos vertebrados e o ambiente. Aqui, um ...

O objetivo geral deste procedimento é visualizar neutrófilos granulócitos vivos e redes extracelulares de DNA em um pulmão recentemente infectado por um patógeno fúngico. Primeiro, camundongos que são positivos para EGFP na sua população de neutrófilos são infectados com cândida, que também está marcada com fluorescência. Em seguida, a infecção é deixada se desenvolver por sete horas, após o que o animal infectado é sacrificado.Em seguida, os pulmões do animal infectado são preenchidos com ágar de baixo ponto de fusão para facilitar o corte por beome. Finalmente, uma fatia espessa do tecido pulmonar infectado é obtida por meio de viome e neutrófilos pulmonares. Redes de DNA e elementos fúngicos são visualizados.Por fim, é possível obter imagens estáticas de alta resolução ou sequências de vídeo de granulócitos em tecido pulmonar vivo por meio da microscopia de dois fótons com múltiplas cores. A principal vantagem deste método em relação às tecnologias existentes é que as células imunes responsáveis pela eliminação da infecção podem ser observadas diretamente em seu ambiente natural. Isso pode ser feito durante o processo de formação de redes e eliminação fúngica, permitindo, assim, uma análise fisiológica dos neutrófilos muito menos sujeita a artefatos.Inventei esta técnica quando Mathias me incomodou com suas perguntas incisivas sobre a relevância in vivo das minhas descobertas prévias in vitro, e apresentarei esta técnica nos próximos minutos. Para gerar quitídeos inchados do bolor ambiental Aspergillus fumigatus, adicione cinco mililitros de meio a uma placa de cultura celular de seis poços, transfira duas vezes 10 elevado à sétima quitídeos em repouso para a placa e incube os esporos por sete horas a 37 graus Celsius em 5% de dióxido de carbono em uma instalação BSL-2.Após o período de inchaço, marque os esporos com fluorescência adicionando 10 microlitros da solução de calcior white stalk a cada poço, seguindo-se de mistura suave. Incube a placa por mais 15 minutos nas mesmas condições para colher os esporos marcados com fluorescência; coloque um filtro celular de 70 micrômetros sobre um tubo cônico de 50 mililitros. Colete os esporos da placa com uma pipeta e, em seguida, passe a solução do meio através do filtro celular para dentro do tubo.Em seguida, centrifugue as células a 900 Gs durante cinco minutos à temperatura ambiente e descarte o meio. Depois, lave os esporos com 10 mililitros de PBS nas mesmas condições de centrifugação. Re-suspenda o pellet de esporos em dois mililitros de PBS e determine o número total de canídeos inchados por contagem celular, centrifugando novamente a suspensão de esporos nas mesmas condições de centrifugação anteriores e, posteriormente, remova cuidadosamente o sobrenadante resus.Suspenda o sedimento de kedia em uma concentração final de um vezes 10 à sétima células por 100 microlitros de PBS para preparar o camundongo para infecção com a solução de esporos; o animal é anestesiado e a sedação é confirmada pela ausência de resposta ao aperto nos dedos dos pés. Neste vídeo, camundongos lys EGFP, que possuem EGFP sob o promotor da lisozima e, portanto, têm neutrófilos positivos para eeg FP, são utilizados. Cinco minutos após a administração da anestesia e confirmação da sedação, utilize uma tira elástica para suspender o camundongo anestesiado em um bico inclinado pelos dentes, sob uma lâmpada de pescoço de ganso. Use uma pinça para puxar a língua para um dos lados e insira um cateter venoso permanente de calibre 22 na traqueia do animal.Após a inserção bem-sucedida desse tubo, utilize uma micropipeta de 100 microlitros para administrar 100 microlitros da suspensão de esporos. Em seguida, para melhorar a distribuição das partículas fúngicas por todo o pulmão, ventile mecanicamente o animal infectado por dois minutos com um respirador de pequenos animais, a uma frequência respiratória de 250 respirações por minuto e um volume de inalação de 300 microlitros por respiração. Por fim, remova o cateter e devolva o camundongo à sua gaiola por sete horas enquanto a infecção progride.Observe a recuperação do animal a cada cinco minutos até que esteja novamente ambulatório, logo antes do final do período de infecção. Derreta 20 mililitros de ágar de baixo ponto de fusão em banho-maria ou micro-ondas e mantenha aquecido para que o ágar não solidifique antes de ser injetado. Resfrie um frasco de PBS a quatro graus Celsius na geladeira neste momento também.No final do período de infecção, o animal é eutanasiado. Use agulhas para fixar o camundongo em uma placa de preparação de silicone e abra cuidadosamente o tórax com uma tesoura e pinça para expor os pulmões e o trato respiratório superior. A partir da epiglote exposta, insira outro cateter venoso permanente de calibre 22 na traqueia.Usando uma agulha de costura, um fio de costura comum é enrolado ao redor da traqueia como preparação para a etapa subsequente de preenchimento pulmonar com agros. Em seguida, encha uma seringa de um mililitro com o aros pré-aquecido e administre a solução através do cateter para preencher os pulmões. Assim que os pulmões estiverem cheios, amarre a traqueia com o fio de costura preparado enquanto remove o cateter e coloque todo o animal em uma geladeira a quatro graus Celsius por 15 minutos.Após a solidificação do aros, começando pela traqueia, excise todo o pulmão do tórax aberto e lave-o com PBS pré-resfriado usando uma tesoura pontiaguda. Remova o lobo pulmonar direito. Seque brevemente a base do lobo em uma folha de papel-toalha e, em seguida, fixe o lobo a um bloco de preparação para vibram usando uma gota de adesivo para tecidos por um minuto.Em seguida, instale o bloco na câmara de corte do vibrátomo e preencha a câmara com PBS previamente resfriado. Ajuste a lâmina para uma vibração de alcance médio com configuração de avanço medial e corte uma secção transversal horizontal do pulmão. Em seguida, coloque a metade superior do tecido pulmonar cortado virada para baixo em uma placa de Petri plástica de cinco centímetros de diâmetro.Fixe o tecido pulmonar à placa de Petri colocando uma arruela plana sobre ele. Encha a placa com 10 mililitros de PBS e adicione 10 microlitros de corante citotoxina. Por fim, instale a placa contendo o tecido pulmonar sob o objetivo do microscópio para que o tampão possa ser aquecido por um aquecedor controlado por sensor de temperatura a 37 graus Celsius para a aquisição de imagens.Áreas diferentes ao longo da dissecação R são escaneadas até uma profundidade de 400 micrômetros usando um comprimento de onda de iluminação de 800 nanômetros, detectando fluorescência verde em 530 nanômetros e vermelha em 580 nanômetros, bem como o sinal de geração de segundo harmônico ou SHG. Na imagem em azul, a fluorescência no intervalo de emissão de 400 a 470 nanômetros com detectores externos não descanned ou NDD, mostrados aqui em azul, é o sinal SHG da estrutura tecidual alveolar de um pulmão não infectado de um camundongo C57 black six. Observe o tecido fibroso na parte inferior da fatia pulmonar em comparação com a organização claramente alveolar nas áreas ativas da respiração na parte superior do pulmão.Nesta figura, o sinal de citotalk dos núcleos de células pulmonares cortados durante o preparo do corte de pulmão é visualizado em vermelho. Esta figura mostra uma sobreposição dos dois canais com um aumento da área delimitada da região tecidual exibida aqui. O sinal SHG azul indica as estruturas alveolares e fúngicas presentes em um corte de pulmão de um camundongo C57 black six infectado sete horas antes com afu tis.Nesta figura, o sinal vermelho de Cyt talk mostra não apenas os núcleos das células pulmonares cortadas durante o preparo do corte pulmonar, mas também as redes de DNA aqui. Uma sobreposição dos dois canais pode ser vista neste gráfico ampliado da área destacada na figura anterior. Áreas distintas de massas fúngicas, alvéolos e estruturas em rede são indicadas pelas letras FA e N, respectivamente, e a estrutura fúngica combinada com a geração de segundo harmônico (SHG) do tecido alveolar é mostrada em azul.O sinal de citotala de núcleos celulares e redes em vermelho, bem como numerosos neutrófilos infiltrados no pulmão. O verde pode ser visualizado aqui em uma fatia de tecido pulmonar de um camundongo lys EGFP. Sete horas após a infecção com afu deusa, neutrófilos em verde podem ser vistos migrando e fagocitando elementos fúngicos em azul em pulmões infectados por aspergillus, conforme observado por microscopia de lapso de tempo.Microscopia de dois fótons de um corte pulmonar vivo. Sete horas após a infecção, os núcleos celulares e as estruturas da rede são mostrados em vermelho. O tempo real do experimento é exibido no canto inferior direito e a barra de escala indica 50 micrômetros.Agora, este método pode fornecer informações sobre infecções fúngicas. Pode também ser aplicado a outros sistemas, como infecções virais ou bacterianas, e pode igualmente oferecer insights sobre a função de outras células imunes residentes no pulmão.

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Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Imunologia e Infecção

Aqui descrevemos uma técnica baseada em microscópio para visualizar e quantificar as primeiras cascatas de eventos durante a fagocitose de patógenos como os fungos Candida albicans e partículas maiores que 0,5 μm, incluindo zimosana e grânulos revestidos de IgG.

Visualizando os estágios iniciais da fagocitose

Este manuscrito descreve um método simples para medir o pH e phagosomal área, bem como o pH citoplasmática de neutrófilos humanos e de rato utilizando o indicador de medida proporcional seminaphthorhodafluor (SNARF) -1, ou S-1. Isto é conseguido usando microscopia de fluorescência confocal ao vivo de células e análise de imagem.

Imaging o neutrófilos fagossoma e citoplasma utilizando um indicador de pH Ratiometric

Aqui descrevemos os métodos usando microscopia confocal de fiação disco de imagem única fagocíticas eventos por macrófagos peritoneais residente do rato. Os protocolos podem ser estendidos a outras células fagocíticas.

Time-Lapse imagem em 3D da fagocitose por macrófagos de rato

Neste estudo, apresentamos um protocolo para executar dois fotões intravital imagem e célula interação análise na mucosa traqueal murino após infecção com vírus da gripe. O presente protocolo será relevante para pesquisadores estudando a dinâmica de células imunes durante infecções respiratórias.

Interação de célula de imagem latente na Mucosa traqueal durante a infecção de vírus de Influenza usando microscopia Intravital dois fotões

O protocolo introduzido aqui permite a caracterização da capacidade pulmonar localizador de linfócitos humanos primários sob condições inflamatórias em vivo. Infiltração pulmonar de enviaram transferidas células imunes humanas em um modelo do rato da inflamação alérgica pode ser fotografada e quantificada por microscopia de fluorescência de luz-folha de tecido pulmonar quimicamente limpo.

Avançado de imagem do pulmão Homing linfócitos humanos em um Experimental em modelo Vivo de inflamação alérgica baseada em microscopia de luz-folha

As armadilhas extracelulares de neutrófilos (NETs) são estruturas tridimensionais geradas por granulócitos estimulados de neutrófilos. Tornou-se claro nos últimos anos que as redes estão envolvidas em uma grande variedade de doenças. A detecção de redes no tecido pode ter relevância diagnóstica, sendo necessários protocolos padronizados para a rotulagem de componentes NET.

Rotulagem de imunofluorescência de armadilhas extracelulares de neutrófilos humanos e murinos em tecido embebido em parafina

Apresenta-se aqui um protocolo para a indução e análise de armadilhas extracelulares (TNEs) de neutrófilos in vitro . A quantificação do DNA, da catelicidina (LL37) e da atividade enzimática produziu dados que mostram a variabilidade na composição e morfologia dos TNEs induzidos por estímulos microbianos e químicos em condições controladas semelhantes.

Análise morfológica e composicional de armadilhas extracelulares de neutrófilos induzidas por estímulos microbianos e químicos

Armadilhas extracelulares de neutrófilos (NETs) estão associadas a várias doenças, e a imunofluorescência é frequentemente usada para sua visualização. No entanto, existem vários protocolos de coloração e, em muitos casos, apenas um tipo de tecido é examinado. Aqui, estabelecemos um protocolo geralmente aplicável para coloração de NETs em tecido humano e de camundongo.

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Um conjunto de técnicas de triagem para uma rápida visão geral da função dos neutrófilos

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Técnica de Alto Rendimento em Tempo Real para Quantificar a Formação de Armadilhas Extracelulares de Neutrófilos em Neutrófilos Humanos

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Microscopia intravital de dois fótons do pulmão de camundongo transplantado

Aprenda a visualizar fagocitose e formação de NETs por neutrófilos em pulmões infectados usando microscopia de dois fótons. Este método permite observar respostas imunes in vivo com alta resolução.

A observação direta de Fagocitose e NET-formação por neutrófilos em pulmões infectados usando dois fótons Microscopia

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