High-Throughput medição e classificação de P orgânico em amostras ambientais

O objetivo geral deste procedimento é classificar o fósforo orgânico hidrolisado por enzima em extratos de amostras de solo ou esterco. Isso é realizado primeiramente extrai as amostras com solução de hidróxido de sódio e EDTA e ajustando o pH dos extratos. Em seguida, incubar esses extratos ajustados com duas soluções enzimáticas diferentes.

Em uma placa de 96 poços, a etapa final consiste em medir o ortofosfato liberado pela enzima utilizando colorimetria com azul de molibdênio. Em última análise, a maioria das formas nativas de fósforo monoéster de ortofosfato e de fósforo diéster pode ser classificada em amostras de solo ou de esterco com base na liberação diferencial de ortofosfato pelo método de hidrólise enzimática. Este método pode ser realizado de forma econômica em qualquer laboratório padrão.

A principal vantagem que possui em relação a métodos existentes, como a espectroscopia de ressonância magnética nuclear de fósforo-31, é que pode medir o potencial de enzimas nativas do solo para liberar ortofosfato a partir de compostos orgânicos de extrato de ervilha no futuro. Portanto, os dados obtidos por este método podem ajudar a prever a fertilidade do solo ou o potencial do solo de liberar quantidades prejudiciais de ortofosfato disponível para algas. Adicione 30 mililitros da solução de hidróxido de sódio 0,25 molar a dois gramas da amostra úmida ou seca em um tubo cônico de 50 mililitros.

Incube com agitação por 16 horas à temperatura ambiente. Centrifugue as amostras a 3000 ×g por 30 minutos, depois transfira 100 microlitros para um tubo de microcentrífuga de 1,5 mililitro que já contenha tampão acetato. A amostra ajustada tem um volume total de um mililitro e pH de 5,0.

Prepare duas soluções estoque contendo 0,5 unidades por mililitro de fosfatase ácida em 10 mililitros de acetato de sódio 0,1 molar recém-preparado, pH cinco. Adicione agora nuclease liofilizada reconstituída NP um de Penicillium Citron a um dos tubos de 10 mililitros da solução estoque de fosfatase ácida até uma concentração final de 2,5 unidades de NP um por mililitro, misturando suavemente por inversão várias vezes, e centrifugue as duas soluções enzimáticas a 3000 ×g durante 30 minutos. Para construir uma curva de calibração, comece adicionando um mililitro de solução estoque de fosfato de potássio um milimolar a um tubo de centrífuga de 1,5 mililitro e realize sete diluições seriadas de 0,5 mililitro, descartando o primeiro tubo, de modo que a faixa final de diluição varie de 20 µL a 0,625 nm de fósforo.

Agora transfira os padrões de ORTOFOSFATO para as duas últimas colunas da placa, começando com zero nm de ortofosfato na linha A e terminando com 20 nm de ortofosfato na linha H para os três primeiros poços da coluna 10. Adicione 40 microlitros de solução de enzima PP mais GP aos próximos três poços da coluna 10. Adicione 40 microlitros de solução de enzima PP mais GP mais NP uma.

Finalmente, adicione 40 microlitros de tampão acetato 100 milimolar a todas as seis poças. Agora, cada uma das primeiras seis poças da coluna 10 deve conter 80 microlitros de solução nas próximas duas poças. Adicione 40 microlitros de solução de acetato de sódio contendo 10 M de glicose, seis fosfato e 40 microlitros de solução enzimática PP mais GP.

Para cada amostra em teste, distribua 40 microlitros de extratos de amostra com pH ajustado nos poços de um a nove em até oito linhas após a distribuição de todas as amostras. Use uma pipeta multicanal para distribuir a solução enzimática PP mais GP nas colunas um a três, PP mais GP mais NP nas colunas quatro a seis e tampão de acetato de sódio 0,1 molar nas colunas sete a nove. Realize este passo rapidamente para garantir que todas as amostras tenham tempo de incubação equivalente.

Cubra a placa de 96 poços com uma tampa e incube as amostras, soluções enzimáticas, controles e curva de calibração exatamente por uma hora a 37 graus Celsius em água desionizada. Prepare 50 mililitros de cada uma das quatro soluções estoque. A solução A deve ser preparada diariamente usando uma pipeta multicanal rapidamente.

Adicione 25 microlitros de SDS, 100 microlitros da solução A, 20 microlitros da solução B e 50 microlitros da solução C a todas as cavidades da placa de 96 poços. Tampe a placa e incube por 30 minutos à temperatura ambiente. Por fim, meça a absorbância em 850 nanômetros em qualquer leitor de microplacas com ajuste de comprimento de onda, utilizando um aplicativo de planilha eletrônica.

Primeiro, plote a curva de calibração do fósforo inorgânico com zero a 20 nanomols de fósforo no eixo X e a média das medidas duplicadas de absorbância no eixo Y, realize uma regressão linear e determine a equação da reta de melhor ajuste. Em seguida, calcule o fósforo inorgânico de fundo fazendo a média dos valores nas colunas um a três e, então, aplique a curva de calibração ao conjunto de dados. Para determinar o fósforo derivado de ésteres mono de fósforo hidrolisados, faça a média dos valores triplicados das amostras das colunas quatro a seis e subtraia a solução controle de enzima mais o fósforo inorgânico de fundo.

Em seguida, para calcular o teor de fósforo a partir do fósforo hidrolisado, os DERs fazem a média dos valores das triplicatas das amostras das colunas sete a nove e subtraem a solução controle de enzima, além do fósforo inorgânico de fundo e do fósforo de monoéster hidrolisado das colunas quatro a seis. Uma placa típica de 96 poços mostra os resultados de oito amostras e uma curva de calibração. Os controles estão na coluna 10.

O aumento da intensidade da cor entre as colunas um a três e quatro a seis é devido a compostos de fósforo monoéster hidrolisados; entre as colunas quatro a seis e sete a nove, é devido a compostos de fósforo diéter hidrolisados. Aqui, o método de hidrólise enzimática de alto rendimento foi utilizado para analisar com sucesso a distribuição das classes de fósforo em extratos de uma amostra de solo do Vermont contendo hidróxido de sódio 0,25 molar e EDTA 0,05 molar. Após assistir a este vídeo, você deverá ter uma boa compreensão de como medir ortofosfato nativo, compostos de monoéster e diéster de fósforo em extratos de solo ou de esterco utilizando hidrólise enzimática.

Essa técnica pode ajudar a abrir caminho para pesquisadores nas áreas de química ambiental e manejo de nutrientes explorarem o comportamento do fósforo orgânico em sistemas de solo ou de esterco.