High-Throughput medição e classificação de P orgânico em amostras ambientais

O objetivo geral deste procedimento é classificar o fósforo orgânico hidrolisado enzimático em extratos de amostras de solo ou esterco. Isso é feito primeiro extraindo amostras com solução de EDTA de hidróxido de sódio e ajustando o pH dos extratos. Em seguida, incube esses extratos ajustados com duas soluções enzimáticas diferentes.

Em uma placa de 96 poços, a etapa final é medir o ortofosfato liberado pela enzima usando colorimetria azul de molibdênio. Em última análise, a maioria das formas nativas de fósforo monoéster e fósforo diaster de ortofosfato pode ser classificada em amostras de solo ou esterco com base na liberação diferencial de ortofosfato pelo método de hidrólise enzimática. Este método pode ser realizado de forma barata em qualquer laboratório padrão.

A principal vantagem que tem sobre os métodos existentes, como a espectroscopia de ressonância magnética nuclear de fósforo 31, é que pode medir o potencial das enzimas nativas do solo para liberar ortofosfato de compostos orgânicos de ervilha no futuro. Portanto, os dados obtidos por este método podem ajudar a prever a fertilidade do solo ou o potencial do solo para liberar quantidades prejudiciais de ortofosfato disponível para algas. Adicione 30 mililitros da solução de hidróxido de sódio 0,25 molar a dois gramas de amostra úmida ou seca em um tubo cônico de 50 mililitros.

Incubar com agitação durante 16 horas à temperatura ambiente. Centrifugue as amostras 3000 vezes G por 30 minutos e, em seguida, transfira 100 microlitros para um tubo de microcentrífuga de 1,5 mililitro que já contém tampão de acetato. A amostra ajustada tem um volume total de um mililitro e um pH de 5,0.

Prepare duas soluções-mãe contendo 0,5 unidades por mililitro de fosfatase ácida em 10 mililitros de acetato de sódio 0,1 molar recém-preparado pH cinco. Agora adicione nuclease liofilizada reconstituída NP um de Penicillium Citron em um dos tubos de 10 mililitros de estoques de fosfatase ácida a uma concentração final de 2,5 unidades NP um por mililitro suavemente misturado invertendo várias vezes, centrifugue as duas soluções enzimáticas a 3000 vezes G por 30 minutos. Para construir uma curva de calibração, comece adicionando um mililitro de uma solução de estoque de fosfato de potássio milimolar a um tubo de centrífuga de 1,5 mililitro e execute sete diluições de cereais de 0,5 mililitros, descarte o primeiro tubo de modo que a diluição final varie de 20 al a 0,625 nm de fósforo.

Agora transfira os padrões ORTHOPHOSPHATE para as duas últimas colunas da placa, começando com zero NM de ortofosfato na linha A e terminando com 20 nm de ortofosfato na linha H para os três primeiros poços da coluna 10. Adicione 40 microlitros de solução enzimática PP mais GP aos próximos três poços da coluna 10. Adicione 40 microlitros de PP mais GP mais NP uma solução enzimática.

Finalmente, adicione 40 microlitros de tampão de acetato 100 milimolar a todos os seis poços. Agora, cada um dos primeiros seis poços na coluna 10 deve conter 80 microlitros de solução para os próximos dois poços. Adicione 40 microlitros de solução de acetato de sódio contendo 10 M de glicose, seis fosfato e 40 microlitros de PP mais solução enzimática GP.

Para cada amostra que está sendo testada, distribua 40 microlitros de extratos de amostra ajustados ao pH para os poços de um a nove em até oito fileiras após a distribuição de todas as amostras. Use uma pipeta multicanal para distribuir a solução enzimática de PP mais GP para as colunas um a três, PP mais GP mais NP um para as colunas quatro a seis e tampão de acetato de sódio 0,1 molar para a coluna sete a nove. Execute esta etapa rapidamente para garantir que todas as amostras tenham um tempo de incubação equivalente.

Cubra a placa de 96 poços com uma tampa e incube amostras, soluções enzimáticas, controles e curva de calibração exatamente uma hora a 37 graus Celsius em água deionizada. Prepare 50 mililitros de cada uma das quatro soluções de estoque. Um deve ser preparado diariamente usando uma pipeta multicanal rapidamente.

Adicione 25 microlitros de SDS, 100 microlitros de solução a, 20 microlitros de solução B e 50 microlitros de solução C a todos os poços nos 96. Placa de poço, cubra a placa e incube por 30 minutos em temperatura ambiente. Finalmente, meça a absorbância a 850 nanômetros em qualquer leitor de microplacas sintonizável em T usando um aplicativo de planilha.

Primeiro, plote a curva de calibração do fósforo inorgânico com zero a 20 nanomoles de fósforo no eixo x e a média das medições de absorbância duplicadas no eixo Y, faça uma regressão linear e encontre a equação da linha de melhor ajuste. Em seguida, calcule o fósforo inorgânico de fundo calculando a média dos valores nas colunas de um a três e, em seguida, aplicando a curva de calibração ao conjunto de dados. Em seguida, para determinar o fósforo derivado de monoésteres de fósforo hidrolisado, calcular a média dos valores triplicados da amostra das colunas quatro a seis e subtrair a solução enzimática de controlo mais o fósforo inorgânico de fundo.

Em seguida, para calcular o teor de fósforo do fósforo hidrolisado, os DERs calculam a média dos valores da amostra triplicada da coluna sete a nove e subtraem a solução enzimática de controle mais o fósforo inorgânico de fundo mais o fósforo monoéster hidrolisado das colunas quatro a seis. Uma placa típica de 96 poços mostra resultados para oito amostras e uma curva de calibração. Os controles estão na coluna 10.

O aumento da intensidade da cor entre as colunas um a três e quatro a seis é devido ao monoéster hidrolisado Os compostos de fósforo entre as colunas quatro a seis e sete a nove são devidos aos compostos de fósforo hidrolisados. Aqui, o método de hidrólise enzimática de alto rendimento foi usado para analisar com sucesso a distribuição das classes de fósforo em extratos de EDTA de hidróxido de sódio 0,25 molar 0,05 molar de uma amostra de solo de Vermont. Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como medir compostos nativos de ortofosfato, monoéster e ervilha diaster em extratos de solo ou esterco usando hidrólise enzimática.

Essa técnica pode ajudar a abrir caminho para pesquisadores nas áreas de química ambiental e manejo de nutrientes explorarem o comportamento orgânico do P no solo ou nos sistemas de esterco.