Name: Alta Sensibilidade de Detecção de 5 hydroxymethylcytosine-in Balb / C Tecido Cerebral (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-02-01T18:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 19 s
Description: Aprenda a analisar e quantificar 5-metilcitosina e 5-hidroximetilcitosina em loci genômicos específicos usando o kit EpiMark com reações enzimáticas e PCR. Este método permite distinguir essas modificações epigenéticas em amostras de tecido cerebral de camundongos Balb/c.

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Sriharsa Pradhan, Shannon Morey Kinney, Hang Chin Gyeong, Jurate Bitinaite, Yu Zheng, Pierre Olivier Esteve, Romualdas Vaisvila, laboratório de Steven E. Jacobsen s, UCLA. Este trabalho foi parcialmente financiado pelo NIH 1R44GM095209-01.

1. Glucosylation DNA e Controle de Reações <ol><li> Em um tubo de reação de 1,5 milímetro no gelo, misture 10/05 microgramas de DNA genômico (para uma concentração final de 30 microgramas / mililitro), 12,4 microlitros de UDP-glicose (para uma concentração final de 80 micromolar), 31 microlitros de NEBuffer 4 e até 310 microlitros nuclease livre de água até que o volume total para 310 microlitros. </li><li> Dividir esta mistura de reação em dois tubos de 155 microlitros cada. </li><li> Em seguida, adicione 30 unidades, ou 3 microlitros, de T4-β-glicosiltransferase de um tubo. Misture bem cuidado pipetando para cima e para baixo. O segundo tubo é a reação controle, então adicione 3 microlitros de água, em vez de T4-BGT. </li><li> Incubar ambos os tubos a 37 graus Celsius por 12 a 18 horas, durante o qual o T4-BGT irá adicionar glicose ao grupo hidroxila de 5-hydroxymethylcytosine grupos na amostra. </li></ol> 2. Digestão enzimática de restrição <ol><li> Rótulo três 0,2 mililitro PCR-strip números tubos de 1 a 3. Alíquota de 50 ul da mistura de reação em cada um. </li><li> Rótulo três 0,2 mililitro PCR-strip números tubos de 4 a 6. Alíquota de 50 ul da mistura de controle em cada. </li><li> Adicionar 100 unidades, ou 1 microlitro, de MspI em tubos 1 e 4. Misture bem cuidado pipetando para cima e para baixo. </li><li> Adicionar 50 unidades, ou 1 microlitro, em tubos de HpaII 2 e 5. Misture bem cuidado pipetando para cima e para baixo. </li><li> Não acrescentar nada aos tubos 3 e 6, como são os controles. </li><li> Incubar todos os tubos de 6 a 37 graus Celsius por pelo menos 4 horas. </li><li> Adicione 1 microlitro de proteinase K em cada tubo e incubar a 40 graus Celsius por 30 minutos. </li><li> Inativar a proteinase K, incubando a 95 graus Celsius por 10 minutos. </li></ol> 3. Analisar DNA por PCR / qPCR Este protocolo usa LongAmp NEB de Taq para ponto final-PCR, que tem se mostrado um bom desempenho. Outros protocolos PCR pode ser substituído. <ol><li> Adicione os seguintes componentes para um tubo de reação 0,2 mililitro PCR em gelo: 10 microlitros de 5X Tampão de reacção LongAmp Taq, 1,5 microlitros de 10 milimolar dNTPs, 1 microlitro de 10 Primer micromolar Forward, 1 microlitro de 10 Primer reverssa micromolar, 3 microlitros de modelo DNA das etapas anteriores, 1 microlitro de LongAmp Taq DNA polimerase e água livre de nuclease até 50 microlitros. Estes volumes podem mudar de acordo com o protocolo de PCR utilizado. </li><li> Misture suavemente a reação. Se necessário, recolher todo o líquido até o fundo do tubo por uma rotação rápida. </li><li> Sobreposição da amostra com óleo mineral se estiver usando um termociclador sem tampa aquecida. </li><li> Transferir os tubos de PCR de gelo para um termociclador com o bloco pré-aquecido a 94 graus Celsius e iniciar o programa de ciclismo. Para uma rotina de 3 passos PCR, deve haver uma etapa de desnaturação inicial a 94 graus Celsius por 30 segundos seguido de 30 ciclos de 94 graus Celsius desnaturação por 15 segundos, 55 a 65 graus Celsius de recozimento para 30 segundos e 65 graus Celsius de extensão por 20 segundos ou 50 segundos por kb. Isto deve ser seguido por uma extensão final a 65 graus Celsius por 5 minutos. PCR em tempo real também pode ser realizada para quantificar quantidades de 5-metilcitosina e 5-hydroxymethylcytosine. Por favor, consulte o manual do produto, encontrado em neb.com para obter informações específicas. </li></ol> 4. Resultados representativos: <img src="/files/ftp_upload/2661/2661fig1.jpg" alt="Figura 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 1"> Figura 1. Comparação de 5-hydroxymethylcytosine quantidades no locus 12 em diferentes amostras do mouse Balb / C tecidos. (A), ponto final-PCR. (B), PCR em tempo real. DNA de quatro tecidos de camundongos foi analisada. Para fins comparativos, PCR em tempo real os dados foram normalizados para DNA uncut. A curva padrão foi utilizado para determinar número de cópias. As amostras poderiam ser normalizado pela divisão do número de cópias de amostras 06/01 Não pelo número de cópia do controle que é digerido (n º 5). Lane gel box mostra a variação em 5-HMC presente.

<ol><li>Sadri, R. Nucleic Acids Res. 24, 4987-4989 (1996).</li>
<li>Mathur, E. J. Gene. 108, 1-6 (1991).</li>
<li>Butkus, V., Petrauskiene, L., Maneliene, Z., Klimasaukas, S., Laucys, V., Janulaitis, A. Nucleic Acids Res. 15, 7091-7102 (1987).</li>
<li>Kriaucionis, S., Heintz, N. Science. 324, 929-930 (2009).</li>
<li>Tahiliani, M., Koh, K. P., Shen, Y., Pastor, W. A., Bandukwala, H., Brudno, Y., Agarwal, S., Lyer, L. M., Liu, D. R. Science. 324, 930-935 (2009).</li>
<li>Huang, Y., Pastor, W. A., Shen, Y., Tahiliani, M., Liu, D. R., Rao, A. PLoS One. 5 (1), e8888-e8888 (2010).</li>
</ol>

Ambos Ted e Romas, os autores deste artigo, são funcionários da NEB; Romas é o principal desenvolvedor do kit, com Ted sendo o Diretor do Departamento de Desenvolvimento de Aplicações e que supervisionou o desenvolvimento deste kit.

Existem várias coisas importantes a considerar aquando da constituição desta experiência. Primeiro, é importante que o glucosylation do DNA genômico prossegue até a conclusão. A especificidade seqüência de T4-BGT não é conhecida, e parece não ter outra opção para a seqüência do substrato. Portanto, em alguns casos, maior tempo de incubação pode ser necessária. Digestão segundo, MspI e HpaII deve ser completa, a fim de evitar sinal de fundo. Para estas enzimas de restrição, recomendamos um período de incubação de quatro horas, mas já incubações podem ser realizadas quando clivagem incompleta é observado. Terceiro, a quantidade de DNA de entrada pode ser ajustada dependendo da disponibilidade, desde 20 ngs de DNA pode ser usado para ponto final-PCR. Finalmente, recomendamos o uso de DNA controle fornecido que pode ser executado em paralelo com o DNA genômico para 5-mC e 5-HMC quantificação.

<table><tbody><tr><td>EpiMark&amp;#8482; Kit de Análise de 5-hmC e 5-mC</td><td>New England Biolabs</td><td>E3317</td><td></td></tr><tr><td>Primer específicos para locus, flanqueando um sítio CCGG de interesse</td><td></td><td></td><td>Personalizado por experimento; fornecido pelo usuário</td></tr><tr><td>LongAmp&amp;#174; &lt;em&gt;Taq&lt;/em&gt; DNA Polimerase</td><td>New England Biolabs</td><td>M0323</td><td></td></tr><tr><td>dNTPs</td><td>New England Biolabs</td><td>N0447</td><td></td></tr><tr><td>água grau biologia molecular</td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

alta sensibilidade de detecção de 5 hydroxymethylcytosine-in balb / c tecido cerebral

High Sensitivity 5-hydroxymethylcytosine Detection in Balb/C Brain Tissue

Hydroxymethylation DNA é uma modificação muito conhecida de DNA, mas recentemente tornou-se um foco em pesquisa epigenética. DNA de mamíferos é enzimaticamente modificado na posição do carbono 5 º da citosina (C) os resíduos a 5-mC, predominantemente no contexto de dinucleotídeos CpG. 5-mC é passível de oxidação enzimática de 5-HMC pela família Tet de enzimas, que são acreditados para ser envolvido no desenvolvimento e na doença. Atualmente, o papel biológico de 5-HMC não é totalmente compreendido, mas está gerando muito interesse devido ao seu potencial como biomarcador. Isto é devido a vários estudos revolucionários identificar 5 hydroxymethylcytosine no tronco embrionárias de camundongos (ES) e células neuronais. Técnicas de pesquisa, incluindo métodos de seqüenciamento bissulfito, são incapazes de distinguir facilmente entre 5-mC e 5-HMC. A protocolos existem poucos que podem medir montantes globais de 5-hydroxymethylcytosine no genoma, incluindo cromatografia líquida acoplada a espectrometria de massa com a análise ou cromatografia em camada delgada de nucleosídeos única digeridos de DNA genômico. Anticorpos que meta de 5-hydroxymethylcytosine também existem, o que pode ser usado para dot blot, imunofluorescência, ou precipitação de DNA hydroxymethylated, mas esses anticorpos não têm disso resolution.In única base, a resolução depende do tamanho do DNA e para immunoprecipitated experimentos de microarray, depende do projeto da sonda. Uma vez que se sabe exatamente onde 5-hydroxymethylcytosine existe no genoma ou o seu papel na regulação epigenética, novas técnicas são necessárias que podem identificar hydroxymethylation locus específico. O EpiMark 5-HMC e 5-mC Análise Kit fornece uma solução para a distinção entre essas duas modificações em loci específicos. O EpiMark 5-HMC e 5-mC Análise Kit é um método simples e robusto para a identificação e quantificação de 5-metilcitosina e 5 hydroxymethylcytosine dentro de um lócus específicas de DNA. Esta abordagem utiliza a sensibilidade enzimática metilação diferencial do MspI isoschizomers e HpaII em um protocolo de 3 passos simples. DNA genômico de interesse é tratado com T4-BGT, adicionando um moeity glucose a 5-hydroxymethylcytosine. Esta reação é seqüência independente, portanto todos os 5-HMC será glucosylated; sem modificações ou 5-mC DNA contendo não será afetado. Este glucosylation é seguida por digestão endonuclease de restrição. MspI e HpaII reconhecer a mesma seqüência (CCGG), mas são sensíveis aos estados de metilação diferentes. HpaII cliva apenas um site totalmente modificado: qualquer modificação (5-mC, 5-HMC ou 5-ghmC) em ambos os blocos de clivagem citosina. MspI reconhece e cliva 5-mC e 5-HMC, mas não de 5 ghmC. A terceira parte do protocolo é o interrogatório do locus por PCR. Tão pouco como 20 ng de DNA de entrada pode ser usado. Amplificação do experimental (glucosylated e digerido) e controle (zombar glucosylated e digerido) DNA alvo com primers flanqueando um site CCGG de interesse (100-200 pb) é executada. Se o site contém 5 CpG-hydroxymethylcytosine, uma banda é detectado após glucosylation e digestão, mas não na reação controle não-glucosylated. PCR em tempo real dará uma aproximação de quanto é hydroxymethylcytosine neste site particular. Neste experimento, vamos analisar a quantidade de 5 hydroxymethylcytosine em uma amostra de cérebro de camundongo Babl / C por ponto final PCR.

O EpiMark 5-HMC e 5-mC Kit de análise podem ser usados ​​para analisar e quantificar 5-metilcitosina e 5-hydroxymethylcytosine dentro de um locus spe específicos. O kit distingue 5 de 5 mC-HMC pela adição de glicose para o grupo hidroxila de 5-HMC através de uma reação enzimática utilizando β-glicosiltransferase (T4-BGT). Quando 5-HMC ocorre no contexto de CCGG, esta modificação converte um site MspI clivável para um site não-clivável.

Alta Sensibilidade de Detecção de 5 hydroxymethylcytosine-in Balb / C Tecido Cerebral

A hidroximetilação do DNA é uma modificação do DNA conhecida há muito tempo, mas tornou-se recentemente um foco na pesquisa epigenética. O DNA de mamíferos é enzimaticamente...

O objetivo geral do experimento a seguir é analisar e quantificar cinco metilcitosinas e cinco hidroxietilcitosinas dentro de um locus específico do DNA genômico. Isso é alcançado por meio do bloqueio do grupo hidroxila da cinco hidroxietil aina, o que converte um sítio clivável de MSP um em um sítio não clivável. Como segundo passo, o DNA genômico é digerido pelas enzimas de restrição MSP um e HPA dois, que utilizam suas sensibilidades diferenciais à metilação para identificar sítios de cinco hidroxietilcitosina relacionados à glicose.Em seguida, a PCR é utilizada para investigar o locus. São obtidos resultados que mostram a presença de cinco hidroxietil citosina em um locus específico. A PCR quantitativa pode ser usada para quantificar a quantidade de cinco metil citosina e cinco hidroxietil citosina.A principal vantagem desta técnica em relação a outros métodos, como o sequenciamento com bisulfito, é que você pode discriminar entre cinco metilamina e cinco hidroxietilamina. Realizando os experimentos de hoje, Romas Vice Villa, Romas foi um dos principais desenvolvedores deste kit na New England Biolabs. Antes do início deste protocolo, purificou-se o DNA genômico a partir de tecido cerebral de B. Sea, conforme descrito no procedimento escrito, em um tubo de reação de 1,5 mililitro. Misture o DNA genômico, UDP-glicose, tampão NEB 4 e água livre de nucleases suficiente para completar o volume total até 310 microlitros.Divida esta mistura de reação em dois tubos de 155 microlitros cada. Em seguida, adicione 30 unidades ou três microlitros de transferase de glucosil beta T4 a um tubo. Misture bem pipetando suavemente para cima e para baixo.Não adicione o T four BGT ao segundo tubo, pois trata-se da reação controle, mas certifique-se de adicionar três microlitros de água. Incube ambos os tubos a 37 graus Celsius por 12 a 18 horas, período durante o qual a BGT adicionará glicose ao grupo hidroxila de cinco grupos de citosina hidroxietílica na amostra. Para iniciar a digestão com enzima de restrição, alíquota 50 microlitros da mistura de reação em cada um dos três tubos PCR de 0,2 mililitro rotulados de um a três.Em seguida, alíquotas de 50 microlitros da mistura controle em cada um dos três tubos em fita PCR rotulados de quatro a seis. Adicione 100 unidades de msp, uma em cada um dos tubos um e quatro. A seguir, adicione 50 unidades de HPA dois nos tubos dois e cinco e misture bem pipetando suavemente para cima e para baixo.Não adicione nada aos tubos três e seis, pois eles são controles. Incube os seis tubos a 37 graus Celsius por pelo menos quatro horas. Em seguida, adicione um microlitro de proteinase K em cada tubo e incube a 40 graus Celsius por 30 minutos.Por fim, inative a proteinase K incubando a 95 graus Celsius por 10 minutos. Este procedimento é demonstrado utilizando a enzima TAC da NE B'S para PCR em ponto final. No entanto, outros reagentes e procedimentos de PCR podem ser substituídos em um tubo de reação PCR de 0,2 mililitro sobre gelo.Adicione tampão de reação TAC cinco x, dNTPs, primers direto e reverso, o template previamente obtido, DNA, polimerase long AMP T e água livre de nucleases suficiente para atingir um volume final de 50 microlitros. Misture suavemente a reação, se necessário, e recolha todo o líquido ao fundo do tubo mediante uma breve centrifugação. Transfira os tubos de PCR do gelo para um termociclador com o bloco pré-aquecido a 94 graus Celsius e inicie o programa de ciclagem para uma PCR padrão de três etapas.Deve haver uma etapa inicial de desnaturação a 94 graus Celsius por 30 segundos, seguida por 30 ciclos de desnaturação a 94 graus Celsius por 15 segundos, anelamento a 55 a 65 graus Celsius por 30 segundos e extensão a 65 graus Celsius por 20 segundos ou 50 segundos por kb. Isso deve ser seguido por uma extensão final única a 65 graus Celsius por cinco minutos. A PCR em tempo real também pode ser realizada para quantificar as quantidades de cinco metilcitosina e cinco hidroxietilcitosina.Consulte o manual do produto disponível em nb.com para obter informações específicas. Foi realizada uma comparação de cinco quantidades de hidroxietil aina no Locus 12 utilizando PCR de ponto final e PCR em tempo real; quatro amostras diferentes de tecido BSY de camundongo foram analisadas, incluindo cérebro, fígado, coração e baço.A variação na cinco hidroxietil citosina é evidente na faixa da eletroforese em gel destacada em caixa das amostras de PCR final para fins comparativos. Os dados de PCR em tempo real foram normalizados em relação ao DNA não cortado e uma curva padrão foi utilizada para determinar o número de cópias. As amostras foram normalizadas dividindo o número de cópias das amostras pelo número de cópias do controle não digerido.Aqui, a variação na cinco hidroxietil citosina pode ser observada comparando as barras amarelas. Algumas observações sobre a realização da técnica. É fundamental que todas as reações enzimáticas sejam levadas à conclusão. Para a BGT, é importante que você deixe a reação durante a noite para poder isolar completamente todos os sítios de DNA para Ms.P um e HEPA dois; é importante que você deixe as reações por pelo menos quatro horas para garantir que alcancem a conclusão.E, finalmente, fornecemos controles de DNA e controles de iniciadores para que você possa realizar reações de controle lado a lado.

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Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neurociência

Descrita é um processo de rotulagem em duas etapas usando β-glicosiltransferase (β-GT) para transferir uma azida de glucose para 5 HMC, seguido por química do clique para transferir de um ligante de biotina para o enriquecimento fácil e densidade independente. Este método de marcação eficiente e específico permite o enriquecimento de 5 HMC com fundo extremamente baixo e de alto rendimento de mapeamento epigenômico via sequenciamento de última geração.

Captura selectivo de 5-hydroxymethylcytosine a partir de DNA genómico

Este vídeo descreve a técnica de dot-blot para determinar o nível de metilação do DNA em condrócitos humanos in vitro por meio do blotting de amostras de DNA em uma membrana de náilon e a visualização subsequente usando anticorpos monoclonais. Isso ajuda a determinar o fenótipo dos condrócitos em vários estágios da cultura.

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qPCR é um método sensível e rápido para detecção de DNA por citomegalovírus em formalina-fixo, tecido da biópsia de parafina-embedded

Aqui descrevemos um método imunoquímico sensível para mapear a distribuição espacial de derivados de oxidação de 5mC com base no uso de anticorpos secundários conjugados com peroxidase e amplificação de sinal de tiramida.

Detecção de formas modificadas da citosina Utilizando imunohistoquímica Sensível

Recém descoberto formas oxidadas de 5-metilcitosina (oxi-mCs), 5-Hidroximetilcitosina (5hmC), 5-formylcytosine (5-fC) e 5-carboxylcytosine (5caC) pode representar modificações de DNA distintas com funções únicas funcionais. Aqui, um fluxo de trabalho semi-quantitativa para visualização da distribuição espacial de oxi-mCs, perfis de intensidade de sinal e colocalization é descrito.

Immunostaining para modificações do DNA: análise computacional de imagens Confocal

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