Alta Sensibilidade de Detecção de 5 hydroxymethylcytosine-in Balb / C Tecido Cerebral

O objetivo geral do experimento a seguir é analisar e quantificar cinco metilcitosinas e cinco hidroxietilcitosinas dentro de um locus específico do DNA genômico. Isso é alcançado por meio do bloqueio do grupo hidroxila da cinco hidroxietil aina, o que converte um sítio clivável de MSP um em um sítio não clivável. Como segundo passo, o DNA genômico é digerido pelas enzimas de restrição MSP um e HPA dois, que utilizam suas sensibilidades diferenciais à metilação para identificar sítios de cinco hidroxietilcitosina relacionados à glicose.

Em seguida, a PCR é utilizada para investigar o locus. São obtidos resultados que mostram a presença de cinco hidroxietil citosina em um locus específico. A PCR quantitativa pode ser usada para quantificar a quantidade de cinco metil citosina e cinco hidroxietil citosina.

A principal vantagem desta técnica em relação a outros métodos, como o sequenciamento com bisulfito, é que você pode discriminar entre cinco metilamina e cinco hidroxietilamina. Realizando os experimentos de hoje, Romas Vice Villa, Romas foi um dos principais desenvolvedores deste kit na New England Biolabs. Antes do início deste protocolo, purificou-se o DNA genômico a partir de tecido cerebral de B. Sea, conforme descrito no procedimento escrito, em um tubo de reação de 1,5 mililitro. Misture o DNA genômico, UDP-glicose, tampão NEB 4 e água livre de nucleases suficiente para completar o volume total até 310 microlitros.

Divida esta mistura de reação em dois tubos de 155 microlitros cada. Em seguida, adicione 30 unidades ou três microlitros de transferase de glucosil beta T4 a um tubo. Misture bem pipetando suavemente para cima e para baixo.

Não adicione o T four BGT ao segundo tubo, pois trata-se da reação controle, mas certifique-se de adicionar três microlitros de água. Incube ambos os tubos a 37 graus Celsius por 12 a 18 horas, período durante o qual a BGT adicionará glicose ao grupo hidroxila de cinco grupos de citosina hidroxietílica na amostra. Para iniciar a digestão com enzima de restrição, alíquota 50 microlitros da mistura de reação em cada um dos três tubos PCR de 0,2 mililitro rotulados de um a três.

Em seguida, alíquotas de 50 microlitros da mistura controle em cada um dos três tubos em fita PCR rotulados de quatro a seis. Adicione 100 unidades de msp, uma em cada um dos tubos um e quatro. A seguir, adicione 50 unidades de HPA dois nos tubos dois e cinco e misture bem pipetando suavemente para cima e para baixo.

Não adicione nada aos tubos três e seis, pois eles são controles. Incube os seis tubos a 37 graus Celsius por pelo menos quatro horas. Em seguida, adicione um microlitro de proteinase K em cada tubo e incube a 40 graus Celsius por 30 minutos.

Por fim, inative a proteinase K incubando a 95 graus Celsius por 10 minutos. Este procedimento é demonstrado utilizando a enzima TAC da NE B'S para PCR em ponto final. No entanto, outros reagentes e procedimentos de PCR podem ser substituídos em um tubo de reação PCR de 0,2 mililitro sobre gelo.

Adicione tampão de reação TAC cinco x, dNTPs, primers direto e reverso, o template previamente obtido, DNA, polimerase long AMP T e água livre de nucleases suficiente para atingir um volume final de 50 microlitros. Misture suavemente a reação, se necessário, e recolha todo o líquido ao fundo do tubo mediante uma breve centrifugação. Transfira os tubos de PCR do gelo para um termociclador com o bloco pré-aquecido a 94 graus Celsius e inicie o programa de ciclagem para uma PCR padrão de três etapas.

Deve haver uma etapa inicial de desnaturação a 94 graus Celsius por 30 segundos, seguida por 30 ciclos de desnaturação a 94 graus Celsius por 15 segundos, anelamento a 55 a 65 graus Celsius por 30 segundos e extensão a 65 graus Celsius por 20 segundos ou 50 segundos por kb. Isso deve ser seguido por uma extensão final única a 65 graus Celsius por cinco minutos. A PCR em tempo real também pode ser realizada para quantificar as quantidades de cinco metilcitosina e cinco hidroxietilcitosina.

Consulte o manual do produto disponível em nb.com para obter informações específicas. Foi realizada uma comparação de cinco quantidades de hidroxietil aina no Locus 12 utilizando PCR de ponto final e PCR em tempo real; quatro amostras diferentes de tecido BSY de camundongo foram analisadas, incluindo cérebro, fígado, coração e baço.

A variação na cinco hidroxietil citosina é evidente na faixa da eletroforese em gel destacada em caixa das amostras de PCR final para fins comparativos. Os dados de PCR em tempo real foram normalizados em relação ao DNA não cortado e uma curva padrão foi utilizada para determinar o número de cópias. As amostras foram normalizadas dividindo o número de cópias das amostras pelo número de cópias do controle não digerido.

Aqui, a variação na cinco hidroxietil citosina pode ser observada comparando as barras amarelas. Algumas observações sobre a realização da técnica. É fundamental que todas as reações enzimáticas sejam levadas à conclusão. Para a BGT, é importante que você deixe a reação durante a noite para poder isolar completamente todos os sítios de DNA para Ms.P um e HEPA dois; é importante que você deixe as reações por pelo menos quatro horas para garantir que alcancem a conclusão.

E, finalmente, fornecemos controles de DNA e controles de iniciadores para que você possa realizar reações de controle lado a lado.