Medição precisa e simples do pró-inflamatórias IL-1β citocinas usando um ensaio Estimulação Sangue Total

O objetivo geral deste procedimento é medir citocinas pró-inflamatórias produzidas em um ensaio de estimulação de sangue total. Primeiro, os componentes celulares do sangue total são isolados do plasma por centrifugação, e os leucócitos são enumerados utilizando coloração com orangeina. Em seguida, as células são semeadas e estimuladas com LPS, seguido por um TP, para induzir a produção de citocinas por células que expressam receptores de reconhecimento de padrões microbianos. Os sobrenadantes do cultivo são então coletados em pontos temporais específicos após o início da estimulação.

Por fim, as concentrações de citocinas nos sobrenadantes são medidas em um ensaio multiplex em placa de 96 poços. Utilizando este método simples, é possível avaliar rapidamente as variações nas concentrações de citocinas pró-inflamatórias produzidas por células estimuladas de diferentes doadores. Este método é especialmente útil para identificar doenças inflamatórias mediadas por I em pacientes com manifestações patológicas antiinflamatórias, particularmente em situações nas quais o volume de sangue obtido é limitado.

A principal vantagem dessa técnica em comparação com os métodos existentes ao medir concentrações de citocinas é que a tecnologia baseada em Luminex permite a medição simultânea de várias citocinas utilizando apenas um pequeno volume de amostra. Obtenha amostras contendo 10 mililitros ou mais de sangue venoso de indivíduos afetados, bem como de controles saudáveis pareados por idade e sexo, garantindo que as amostras sejam coletadas em tubos de coleta de sangue vacutainer com heparina sódica, e que não sejam adicionadas EDTA ou outros anticoagulantes, pois estes interferirão no ensaio, e processe as amostras o mais rápido possível após a coleta. Se necessário, as amostras podem ser armazenadas por até 24 horas à temperatura ambiente em condições de iluminação reduzida.

Centrifugue as amostras de sangue a 3000 RPM durante 10 minutos à temperatura ambiente com a frenagem desativada. Após a centrifugação, remova o plasma do topo dos tubos tomando cuidado para não perturbar a camada do coágulo branco que contém as células mononucleares. Em seguida, re-suspenda o coágulo branco e o pellet de hemácias subjacente em meio RPMI sem soro à temperatura ambiente para lavar as células, pipetando suavemente a mistura.

Em seguida, transfira as células do tubo de coleta para um tubo cônico de 50 mililitros. Complete o volume até 50 mililitros com RPMI e inverta suavemente cada tubo para homogeneizar. Centrifugue as células mais uma vez a 3000 RPM por 10 minutos.

Em seguida, aspire o sobrenadante, tomando cuidado para não perturbar o pellet celular. Repita este passo de lavagem de duas a quatro vezes para remover contaminantes e eliminar citocinas ligadas às células. Após as células terem sido lavadas, ressuspenda-as em RPMI livre de soro até um volume total de 20 mililitros. Para contar as células, carregue 20 microlitros de uma mistura um para um de amostra e corante orange Aine em uma câmara de contagem descartável. O corante orange Aine, usado numa concentração final de um micrograma por mililitro, corará apenas os leucócitos nucleados, permitindo que sejam diferenciados dos eritrócitos.

Conte apenas as células D positivas após obter a contagem de células. Re-suspenda as amostras em RPMI sem soro para atingir uma concentração final de 2 milhões de células por mililitro. Para cada amostra, rotule poços duplicados de uma placa de 24 poços com as condições experimentais a serem testadas.

Neste caso, as condições são não estimuladas, LPS isolado, um TP isolado e LPS mais um TP. Adicione um mililitro de células diluídas a cada poço e adicione LPS aos poços apropriados numa concentração final de um micrograma por mililitro. Incube as amostras a 37 graus Celsius em uma incubadora com 5% de dióxido de carbono por duas horas e 40 minutos. Após este período inicial de incubação, adicione o TP numa concentração final de dois milimolares nos poços de TP isolado e LPS mais TP. Em seguida, incube as placas por mais 20 minutos a 37 graus Celsius.

Após a conclusão da segunda incubação, transfira as células de cada poço para um tubo microcentrífugo de 1,5 mililitro previamente rotulado, centrifugue as amostras a 10.000 RRP M durante dois minutos à temperatura ambiente e, em seguida, transfira o sobrenadante de cada tubo para um novo tubo EOR previamente rotulado. O sobrenadante pode ser analisado imediatamente quanto a citocinas ou armazenado congelado para avaliar as concentrações de IL-1β ou outras citocinas. Nas amostras, utilizamos o Bio-Plex Pro Human Cytokine X-Plex com o sistema Bio-Plex 200.

De acordo com as instruções do fabricante. Nesta figura, a análise da produção de IL-1β após estimulação de células de sangue total normal com LPS, ATP ou ambos os estímulos juntos mostra uma resposta a LPS mais ATP, cuja magnitude depende do número de células estimuladas. Em contraste com controles saudáveis, ensaios de sangue total de pacientes que apresentam patologias autoinflamatórias revelam produção aumentada de IL-1β após estimulação com LPS, na ausência de ATP exogenamente adicionado. Não se esqueça de que trabalhar com fluidos corporais humanos, como o sangue, pode ser extremamente perigoso, e precauções universais devem sempre ser adotadas ao realizar este procedimento.