Name: Preparação e Uso de HIV-1 infectados CD4 + T-Primária células como as células-alvo em Ensaios Natural Killer Celular citotóxicos (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-03-14T11:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 7 s
Description: Aprenda a avaliar a resposta citotóxica de células NK contra células T CD4+ infectadas pelo HIV-1 usando ensaios de liberação de cromo e citometria de fluxo. Este método permite estudar interações receptor-ligante importantes na imunidade antiviral.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

<ol><li>Ruscetti, F. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+effector+mechanisms+against+HTLV-I-+and+HTLV-III%2FLAV-infected+lymphoid+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol%22%5BJournal%5D)">Analysis of effector mechanisms against HTLV-I- and HTLV-III/LAV-infected lymphoid cells.</a> J Immunol. 136, 3619-3624 (1986).</li>
<li>Zheng, Z. Y., Zucker-Franklin, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Apparent+ineffectiveness+of+natural+killer+cells+vis-a-vis+retrovirus-infected+targets%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol%22%5BJournal%5D)">Apparent ineffectiveness of natural killer cells vis-a-vis retrovirus-infected targets.</a> J Immunol. 148, 3679-3685 (1992).</li>
<li>Ferrari, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Clade+B-based+HIV-1+vaccines+elicit+cross-clade+cytotoxic+T+lymphocyte+reactivities+in+uninfected+volunteers%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Clade B-based HIV-1 vaccines elicit cross-clade cytotoxic T lymphocyte reactivities in uninfected volunteers.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 94, 1396-1401 (1997).</li>
<li>Shankar, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Impaired+function+of+circulating+HIV-specific+CD8%28%2B%29+T+cells+in+chronic+human+immunodeficiency+virus+infection%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Impaired function of circulating HIV-specific CD8(+) T cells in chronic human immunodeficiency virus infection.</a> Blood. 96, 3094-3101 (2000).</li>
<li>Ward, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((HIV-1+Vpr+triggers+natural+killer+cell-mediated+lysis+of+infected+cells+through+activation+of+the+ATR-mediated+DNA+damage+response%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Pathog%22%5BJournal%5D)">HIV-1 Vpr triggers natural killer cell-mediated lysis of infected cells through activation of the ATR-mediated DNA damage response.</a> PLoS Pathog. 5, e1000613-e1000613 (2009).</li>
<li>Ward, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((HIV+modulates+the+expression+of+ligands+important+in+triggering+natural+killer+cell+cytotoxic+responses+on+infected+primary+T-cell+blasts%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">HIV modulates the expression of ligands important in triggering natural killer cell cytotoxic responses on infected primary T-cell blasts.</a> Blood. 110, 1207-1214 (2007).</li>
<li>Bonaparte, M. I., Barker, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Killing+of+human+immunodeficiency+virus-infected+primary+T-cell+blasts+by+autologous+natural+killer+cells+is+dependent+on+the+ability+of+the+virus+to+alter+the+expression+of+major+histocompatibility+complex+class+I+molecules%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Killing of human immunodeficiency virus-infected primary T-cell blasts by autologous natural killer cells is dependent on the ability of the virus to alter the expression of major histocompatibility complex class I molecules.</a> Blood. 104, 2087-2094 (2004).</li>
<li>Stinchcombe, J. C., Griffiths, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Secretory+mechanisms+in+cell-mediated+cytotoxicity%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Cell+Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Secretory mechanisms in cell-mediated cytotoxicity.</a> Annu Rev Cell Dev Biol. 23, 495-517 (2007).</li>
<li>O'Doherty, U., Swiggard, W. J., Malim, M. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+immunodeficiency+virus+type+1+spinoculation+enhances+infection+through+virus+binding%5BTitle%5D)+AND+%22J+Virol%22%5BJournal%5D)">Human immunodeficiency virus type 1 spinoculation enhances infection through virus binding.</a> J Virol. 74, 10074-10080 (2000).</li>
<li>Alter, G., Malenfant, J. M., Altfeld, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CD107a+as+a+functional+marker+for+the+identification+of+natural+killer+cell+activity%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol+Methods%22%5BJournal%5D)">CD107a as a functional marker for the identification of natural killer cell activity.</a> J Immunol Methods. 294, 15-22 (2004).</li>
<li>Fogli, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lysis+of+endogenously+infected+CD4%2B+T+cell+blasts+by+rIL-2+activated+autologous+natural+killer+cells+from+HIV-infected+viremic+individuals%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Pathog%22%5BJournal%5D)">Lysis of endogenously infected CD4+ T cell blasts by rIL-2 activated autologous natural killer cells from HIV-infected viremic individuals.</a> PLoS Pathog. 4, e1000101-e1000101 (2008).</li>
<li>Tomescu, C., Chehimi, J., Maino, V. C., Montaner, L. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((NK+cell+lysis+of+HIV-1-infected+autologous+CD4+primary+T+cells%3A+requirement+for+IFN-mediated+NK+activation+by+plasmacytoid+dendritic+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol%22%5BJournal%5D)">NK cell lysis of HIV-1-infected autologous CD4 primary T cells: requirement for IFN-mediated NK activation by plasmacytoid dendritic cells.</a> J Immunol. 179, 2097-2104 (2007).</li>
<li>Ward, J. P., Bonaparte, M. I., Barker, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((HLA-C+and+HLA-E+reduce+antibody-dependent+natural+killer+cell-mediated+cytotoxicity+of+HIV-infected+primary+T+cell+blasts%5BTitle%5D)+AND+%22Aids%22%5BJournal%5D)">HLA-C and HLA-E reduce antibody-dependent natural killer cell-mediated cytotoxicity of HIV-infected primary T cell blasts.</a> Aids. 18, 1769-1779 (2004).</li>
</ol>

Não há conflitos de interesse declarados.

Quando feito corretamente os ensaios descritos neste protocolo deve fornecer uma imagem representativa da capacidade das células NK contra a degranulam e lise HIV-1 células infectadas (veja Figura 5). NK degranulação em resposta às células infectadas pelo HIV e as células NK lise células infectadas pelo HIV devem ser diretamente proporcional 10. Resultados confiáveis ​​para os dois ensaios com células NK funcional para medir as respostas citotóxica para células infectadas pelo HIV são dependentes do isolamento de células NK altamente purificado, assim como uma população altamente purificada de células infectadas. Tendo purificado células NK e HIV-1 as células infectadas são críticos para a realização de um efetor bastante precisa para atingir razão entre células. Da mesma forma, a remoção de células mortas e apoptóticas, oriundas de populações de células-alvo é importante antes de 51 Cr rotulagem ou de incubação com as células efetoras. 51 Cr pode ser internalizada pelas células que estão em apoptose como a presença de células mortas ou apoptose durante a etapa de rotulagem isótopo irá resultar em uma liberação espontânea elevada e irá distorcer a lise% calculado específico. Além disso, a presença de células mortas ou apoptose pode desencadear a degranulação das células NK, resultando em níveis anormalmente elevados de expressão CD107a. Pipetagem precisa é necessário ao remover o sobrenadante livre de células após a incubação das células NK e células-alvo nos 51 testes de liberação de Cr, como diferenças no volume de sobrenadante removido cada repetição bem resultará em alto desvio padrão. Modificações podem ser feitas a estes protocolos para avaliar o papel dos receptores específicos NK no desencadeamento de lise de células NK células infectadas pelo HIV incubando a efetores ou alvos antes de co-cultura com anticorpos antagonistas de receptores específicos ou ligantes 6,11. Citocina tratados com células NK (por exemplo, IL-2, IL-15) pode ser usado para avaliar a funcionalidade das células NK estimulado 12. Da mesma forma, o anticorpo dependente ensaios de citotoxicidade de células pode ser realizada utilizando estes protocolos. Anticorpos anti-HIV (por exemplo, anti-gp120) podem ser adicionados às células-alvo de reconhecimento pela célula NK baixa afinidade do receptor Fc CD16 13. Estes ensaios, embora configurado para medir a resposta das células NK citotóxicas para células infectadas pelo HIV, também podem ser modificados para medir a capacidade das células NK a produzir citocinas seguintes infectadas pelo HIV reconhecimento celular. Apesar de termos descritos neste protocolo o uso de células in vitro infectados como células-alvo que recentemente descreveu a geração de células-alvo de pacientes infectados com HIV. Isso requer o isolamento de células CD4 + T-cells seguido de expansão das células ao longo de um período de duas semanas após a estimulação com mitógenos na presença de interleucina-2 11. Após o período de duas semanas de expansão, os protocolos descritos neste artigo são usadas para isolar as células-alvo.

<table><tbody><tr><td>Tubos Vacutainer (Heparina de Sódio)</td><td>BD Biosciences</td><td>367874</td><td></td></tr><tr><td>Kit de Isolamento de Células T CD4+</td><td>Stem Cell Technologies</td><td>15062</td><td></td></tr><tr><td>PBS CMF</td><td>Hyclone</td><td>SH30256.01</td><td></td></tr><tr><td>SFB</td><td>Hyclone</td><td>10437-028</td><td></td></tr><tr><td>Meio de Separação de Linfócitos</td><td>Cellgro</td><td>25-072-CV</td><td></td></tr><tr><td>RPMI-1640</td><td>Hyclone</td><td>SH30096.01</td><td></td></tr><tr><td>Penicilina / Estreptomicina</td><td>Hyclone</td><td>SV30010</td><td></td></tr><tr><td>L-glutamina</td><td>Cellgro</td><td>25-005-Cl</td><td></td></tr><tr><td>Kit de Expansão de Células T</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-091-441</td><td></td></tr><tr><td>HBSS CMF (1x)</td><td>Hyclone</td><td>SH30588.01</td><td></td></tr><tr><td>EDTA 0,5 M</td><td></td><td>46-034-Cl</td><td></td></tr><tr><td>Kit de Isolamento Negativo de Células NK</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-092-657</td><td></td></tr><tr><td>IMDM</td><td>GIBCO, por Life Technologies</td><td>12440-046</td><td></td></tr><tr><td>Kit de Isolamento Positivo CD4+</td><td>Invitrogen</td><td>113.31D</td><td></td></tr><tr><td>Kit de Remoção de Células Mortas</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-090-101</td><td></td></tr><tr><td>Polybrene</td><td>Santa Cruz Biotechnology, Inc.</td><td>sc-134220</td><td></td></tr><tr><td>CD3 PacificBlue</td><td>BD Biosciences</td><td>558117</td><td></td></tr><tr><td>CD14 PacificBlue</td><td>Biolegend</td><td>325616</td><td></td></tr><tr><td>CD20 PacificBlue</td><td>Biolegend</td><td>302328</td><td></td></tr><tr><td>CD56 APC</td><td>Biolegend</td><td>318310</td><td></td></tr><tr><td>CD69 PE</td><td>BD Biosciences</td><td>555531</td><td></td></tr><tr><td>CD107a FITC</td><td>BD Biosciences</td><td>555800</td><td></td></tr><tr><td>&lt;sup&gt;51&lt;/sup&gt;Cromo</td><td>PerkinElmer, Inc.</td><td>NEZ030002MC</td><td></td></tr><tr><td>Tubos para Contador Gama</td><td>PerkinElmer, Inc.</td><td>1270-401</td><td></td></tr><tr><td>Contador Gama Automático 2470</td><td>PerkinElmer, Inc.</td><td>2470-0050</td><td></td></tr><tr><td>FACS Diva</td><td>BD Biosciences</td><td>643629</td><td></td></tr><tr><td>FlowJo</td><td>Tree Star, Inc.</td><td>FJ-9-1YR</td><td></td></tr></tbody></table>

preparação e uso de hiv-1 infectados cd4 + t-primária células como as células-alvo em ensaios natural killer celular citotóxicos

Preparation and Use of HIV-1 Infected Primary CD4+ T-Cells as Target Cells in Natural Killer Cell Cytotoxic Assays

Natural killer (NK) são um componente vital da resposta imune inata de células infectadas por vírus. É importante compreender a capacidade das células NK reconhecer e lise HIV-1 células infectadas por identificar qualquer aberração em função das células NK contra células infectadas pelo HIV pode potencialmente levar a tratamentos que aumentem a sua actividade citolítica. Há a necessidade de utilizar infectadas pelo HIV primária de células T explosões como as células-alvo em vez de infectados-T-cell linhas nos ensaios de citotoxicidade. De células T-lines, mesmo sem infecção, são bastante suscetíveis à lise das células NK. Além disso, é necessário o uso de células autólogas primária para evitar complexo principal de histocompatibilidade classe I descasamentos entre o alvo ea célula efetora que resultarão em lise. Os primeiros estudos avaliando as respostas das células NK citolítica a principal células infectadas pelo HIV não mostrou matando significativa dos 1,2 células infectadas. No entanto, usando HIV-1 infectados primário T-células como as células-alvo em ensaios funcionais de células NK tem sido difícil devido à presença de contaminantes células não infectadas 3. Esta célula infectada para inconsistentes razão entre células não infectadas irá resultar em variação em matar células NK entre as amostras que não pode ser devido à variabilidade em função dos doadores de células NK. Assim, seria benéfico para trabalhar com uma população de células purificadas infectados, a fim de padronizar o efetor para atingir rácios de celular entre experimentos 3,4. Aqui demonstramos o isolamento de uma população altamente purificada de HIV-1 células infectadas por tomar vantagem da capacidade do HIV-1 para down-modular CD4 em células infectadas ea disponibilidade de kits comerciais para remover as células mortas ou moribundas 3-6. A purificada infectados primários de células T explosões podem ser usados ​​como alvos em qualquer degranulação um ensaio citotóxicas ou purificada com células NK como a população efetor 5-7. Uso de células NK como efetores em um ensaio de desgranulação avalia a capacidade de uma célula NK para liberar o conteúdo lítico dos lisossomos especializados 8 chamado &quot;grânulos citolítica&quot;. Através da coloração com um anticorpo conjugado com fluorocromo contra CD107a, uma proteína de membrana lisossomal que se expressa na superfície das células NK, quando os grânulos citolítica fundem à membrana plasmática, podemos determinar qual a porcentagem de células NK degranulam em resposta ao reconhecimento de células-alvo. Alternativamente, a atividade das células NK lítico pode ser avaliada em um ensaio citotóxico que permite a determinação da percentagem de células-alvo lisadas pela liberação de 51 Cr de dentro da célula-alvo, na presença de células NK.

Ensaios de citotoxicidade para medir as respostas das células natural killer lítica de células infectadas pelo HIV é limitada pela pureza das células-alvo. Demonstramos aqui o isolamento de uma população altamente purificada de HIV-1 infectados primários de células T explosões tirando vantagem da capacidade do HIV-1 s para down-modular CD4.

Preparação e Uso de HIV-1 infectados CD4 + T-Primária células como as células-alvo em Ensaios Natural Killer Celular citotóxicos

As células natural killer (NK) são um componente vital da resposta imune inata a células infectadas por vírus. É importante compreender a capacidade das células NK...

O objetivo geral deste procedimento é avaliar a resposta citotóxica das células NK frente a células infectadas pelo HIV-1. Isso é realizado primeiramente isolando e infectando células T positivas para CD4 provenientes de sangue venoso. Em seguida, as células natural killer são isoladas do mesmo doador.Em seguida, linfócitos T CD4 positivos não infectados são isolados separadamente das células infectadas. Por fim, as células infectadas e as células NK são utilizadas como alvos e efetoras, respectivamente, em um dos dois ensaios para avaliar a citotoxicidade das células NK. Em última análise, podem ser obtidos resultados que demonstram que as células NK podem responder a células infectadas pelo HIV-1 por meio da superexpressão de CD107a, cuja expressão é determinada por análise de citometria de fluxo, ou por liberação de cromo-51 detectada por um contador gama.Este método pode responder perguntas fundamentais na área do HIV-1, como, por exemplo, se as células NK respondem a células infectadas pelo HIV-1, quais interações receptor-ligante são importantes nas interações entre células NK e T, e se as proteínas virais do HIV-1 modulam a resposta das células NK a células infectadas pelo HIV-1. Após estimular células T CD4-positivas isoladas do sangue periférico humano e estimuladas por microesferas acopladas ao anti-CD3 e anti-CD28 por 72 horas, conte a população resultante de células T por meio de hemocitômetro e, em seguida, divida a cultura em dois grupos, colocando aproximadamente dois vezes 10 à sexta potência de células T em um tubo cônico de 15 mililitros para uso como grupo controle não infectado, e coloque o restante da suspensão de células T CD4-positivas em um tubo cônico de 50 mililitros para o grupo de infecção.Centrifugue ambos os grupos a 300 G a 22 graus Celsius por 10 minutos e, em seguida, aspire o sobrenadante. Suspender as células T CD4 positivas do tubo de 50 mililitros diretamente em fluidos de cultura contendo vírions e adicione polibrena a uma concentração final de 10 miligramas por mililitro. Em seguida, centrifugue para infectar as células a 1200 vezes G por duas horas a 20-25 graus Celsius.Aqui, as células estão sendo infectadas com DHIV três com uma multiplicidade de cinco. Após a conclusão da infecção por centrifugação, remova o sobrenatante e ressuspenda as células infectadas numa densidade de três vezes 10 elevado a seis por mililitro, em RPMI completo suplementado com 100 unidades por mililitro de IL dois.Em seguida, cultive as células não infectadas e as células recém-infectadas por 72 horas em uma placa de seis poços. Se um vírus com replicação incompetente foi usado para infectar as células, ou por cinco a sete dias se um vírus com replicação competente foi utilizado, colete o sobrenadante contendo as culturas de linfócitos T CD4 positivos infectados e centrifugue as células a 300 ×g por 10 minutos a 22 °C com a frenagem ativada. Aspire o sobrenadante e ressuspenda. Suspenda o pellet em dois mililitros de PBS com 2% de FBS e dois milimolares de EDTA e conte as células em um hemocitômetro utilizando um kit de isolamento de células CD4 positivas.Remova as células T não infectadas CD4 positivas. Siga as instruções do fabricante para o isolamento das células T CD4 positivas, com exceção de que uma razão de um anticorpo anti-CD4 por célula é utilizada. Em seguida, remova as células mortas da população celular purificada que abriga o vírus utilizando um kit de remoção de células mortas.De acordo com as instruções do fabricante, colete a população de células T vivas e centrifugue as células purificadas a 300 G por 10 minutos. Com a frenagem ligada, remova então o sobrenadante, suspenda o pellet. Em um mililitro de RPMI completo, conte as células. As células NK do sangue periférico são primeiramente isoladas do mesmo doador de onde foram obtidas as células T positivas para CD4.Após o cultivo noturno, conte as células NK com um hemocitômetro, centrifugue-as a 300 ×g por 10 minutos com a frenagem ativada e, em seguida, re-suspenda as células em RPMI completo, ajustando a concentração final para 10⁶ células por mililitro. Em seguida, colete e centrifugue as suspensões de linfócitos T purificadas, infectadas e controle não infectadas a 300 ×g por 10 minutos. Com a frenagem ativada, remova o sobrenadante e re-suspenda os pellets.Em RPMI completo a duas vezes 10 elevado a seis células por mililitro para um controle positivo, cerca de duas vezes 10 elevado a seis células suscetíveis à lise por NK da linhagem K-562 são utilizadas. Neste vídeo, centrifugue as células K-562 a 300 ×g durante 10 minutos com a frenagem ativada, então remova o sobrenadante e ressuspenda o pellet em RPMI completo a duas vezes 10 elevado a seis células por mililitro.Após todas as populações celulares terem sido lavadas e ressuspendidas nas suas concentrações experimentais, coloque as células NK juntamente com células K562, células T não infectadas ou células T infectadas com HIV. Em poços individuais de uma placa de fundo em V de 96 poços, apenas uma réplica por tipo de célula-alvo será utilizada para medir a desgranulação inespecífica das células NK. Adicione 100 microlitros de células efetoras NK e 100 microlitros apenas de meio a um poço.Adicione 10 microlitros de anticorpo anti-CD107a conjugado a fluorocromo a cada poço e centrifugue a placa a 20 ×g durante dois minutos com a frenagem ativada a 22 graus Celsius. Em seguida, incube a placa a 37 graus Celsius e 5% de dióxido de carbono por quatro horas após a incubação. Centrifugue a placa a 400 ×g durante cinco minutos com a frenagem ativada a 22 graus Celsius e, então, remova o sobrenadante utilizando uma pipeta aspiradora de dois mililitros equipada com ponteira P200.Em seguida, adicione 100 microlitros de tampão de fluxo a cada poço e, então, marque as células com anticorpos anti-CD3 14 20 Pacific blue e anticorpo anti-CD56 A PC no gelo por 20 minutos. Após as células terem sido marcadas, adicione 200 microlitros de tampão de fluxo a cada poço e centrifugue a placa a 400 ×g por cinco minutos. Com a frenagem a 22 graus Celsius, aspire cuidadosamente o tampão de fluxo de cada poço.Usando uma pipeta aspiradora de dois mililitros equipada com uma ponteira de micropipeta de 200 microlitros, certificando-se de não perturbar o pellet, lave as células novamente e, em seguida, ressuspenda os pellets em 200 microlitros de paraformaldeído a 1% em PBS sem cálcio e sem magnésio. Por fim, transfira as suspensões celulares para tubos de citometria e complete o volume total nos tubos até 300 microlitros, adicionando aproximadamente 100 microlitros de paraformaldeído a 1% em PBS sem cálcio e sem magnésio a cada um. Em seguida, leia duas vezes 10 à quarta eventos de células NK por citometria de fluxo utilizando o software FACSDiva e analise os dados utilizando o software FlowJo. Rotule células T infectadas e não infectadas pelo HIV V1 purificadas com 125 microcuries de cromo-51 em solução salina por 10 à sexta células durante duas horas a 37 graus Celsius e 5% de dióxido de carbono em um tubo cônico de 15 mililitros como controle positivo; rotule também 10 à sexta células K562 com 100 microcuries de cromo-51 durante duas horas.Sob as mesmas condições de cultivo. Utilize RPMI completo para ajustar o volume final da solução de marcação para cada população celular a 500 microlitros. O volume de cromo 51 adicionado às células-alvo é calculado usando o calculador universal de decaimento radioativo disponível no site da PerkinElmer, enquanto as células-alvo estão sendo marcadas.Retire as células NK previamente isoladas do cultivo e conte-as; centrifugue as células NK a 300 G durante 10 minutos com a frenagem ativada e re-suspenda os pellets em RPMI completo; divida as suspensões celulares resultantes em três tubos cónicos de 15 mililitros. Ajuste a densidade celular para 10 à quinta por mililitro no primeiro tubo, 2,5 vezes 10 à quinta por mililitro no segundo tubo e cinco vezes 10 à quinta por mililitro. No terceiro tubo, as células NK serão usadas como células efetoras nas proporções de um para um, 2,5 para um e cinco para um, respetivamente, no ensaio de liberação de cromo 51.Retire as células-alvo agora marcadas do incubador e adicione 4,5 mililitros de RPMI completo a cada tubo. Centrifugue os tubos a 300 ×g por 10 minutos. Em seguida, despeje cuidadosamente o sobrenadante em um recipiente para resíduos líquidos radioativos sem perturbar o pellet.Lave as células-alvo mais duas vezes para remover todo o cromo 51 não absorvido. O sobrenatante da terceira lavagem pode ser descartado em um recipiente para resíduos líquidos não radioativos. Agora, re-suspenda novamente os alvos em RPMI completo até a densidade celular final de 10 à quinta por mililitro, mostrado como exemplo de uma configuração típica para um ensaio de liberação de cromo 51.Observe que cada grupo é feito em alíquotas triplas: adicione 100 microlitros de alvos marcados em cada poço indicado de uma placa de fundo V de 96 poços, para um número final de células-alvo de 10 elevado à quarta potência por poço. Em seguida, adicione 100 microlitros das suspensões de NK às células-alvo nas proporções indicadas de células efetoras para células-alvo. Depois, adicione 100 microlitros de alvos aos poços correspondentes nos quais as células efetoras estão ausentes, para os grupos de liberação máxima e liberação espontânea.Suplemente o grupo de liberação espontânea com mais 100 microlitros de RPMI completo, centrifugue a placa a 20 G durante dois minutos com a frenagem ativada e, em seguida, incube a placa a 37 graus Celsius e 5% de dióxido de carbono por quatro horas. Após a incubação de quatro horas, adicione cinco microlitros de uma diluição de um para 10 de hemácias humanas em RPMI completo a cada poço, exceto aos poços de liberação máxima; então, adicione 100 microlitros de sulfato de sódio ESAL 10% aos poços de liberação máxima e centrifugue a placa a 400 G durante cinco minutos. Para colher as células, rotule um tubo para contador gama para cada um dos poços experimentais e de controle.No plaque de 96 poços, colete 100 microlitros de sobrenadante livre de células de cada poço e coloque o sobrenadante de cada poço em tubos pré-nivelados. Meça a quantidade de cromo 51 em cada tubo em um contador gama automático PerkinElmer 24 70. Os seguintes gráficos de dispersão demonstram uma estratégia típica de seleção citométrica de fluxo para analisar os resultados de um CD 1 0 7.Um ensaio de desgranulação. Primeiro, as células individuais são selecionadas, excluindo agregados ou dupletos em um gráfico de FSCA versus FSCH. Em seguida, a população de células individuais é analisada no gráfico de FSCA versus SSC, sendo selecionada a população de linfócitos, indicada novamente pelo contorno rosa.O portal dos linfócitos é então plotado como CD 3 14 20 versus CD 56, com o enquadramento na população positiva para CD 56 e negativa para CD 3 14 20, conforme indicado pelo oval rosa vertical. Aqui, o GA das NK é plotado como CD 1 0 7 A versus CD 56 para visualizar as células NK que sofreram desgranulação. Nas duas figuras a seguir, são apresentados resultados representativos da avaliação da resposta citotóxica de células natural killer contra células infectadas pelo HIV tipo 1. As células NK foram avaliadas quanto à sua capacidade de desgranular na ausência de alvos e em resposta a células K 5 62, linfócitos T primários positivos para CD 4 e linfócitos T primários infectados pelo HIV, conforme avaliado pelo percentual de células NK que expressam a molécula CD 1 0 7 A na superfície. Os números em cada quadrante representam o percentual de células NK totais nesta figura.As células NK foram avaliadas quanto à sua capacidade de lisar células K562, células T CD4 positivas não infectadas e células T infectadas com HIV-1 em ensaio de liberação de cromo 51 em razões de células efetoras para células-alvo de 2,5:1, 5:1 e 7,5:1 após seu desenvolvimento. Esta técnica ajudou a abrir caminho para pesquisadores na área da biologia do HIV-1 explorarem como as células natural killer respondem às células infectadas com HIV-1 em pacientes infectados pelo HIV.

preparation-use-hiv-1-infected-primary-cd4-t-cells-as-target-cells

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Imunologia e Infecção

Este experimento visualizado é um guia para a utilização de um clone fluorescentes molecular do HIV para viver experiências imagem confocal.

Visualizando transferência de células-célula de HIV usando Clones fluorescente de HIV e Microscopia Confocal ao vivo

Vários aptâmeros 2'Fluoro-RNA contra o HIV-1BA-L gp120 com nanomole afinidade são isolados de uma biblioteca por...

Desenvolvimento de células de tipo específico anti-HIV gp120 aptâmeros para entrega siRNA

Este vídeo demonstra a realização de um ensaio de liberação de lactato desidrogenase para determinar a citotoxicidade das células natural killer (NK) contra as células cancerígenas alvo. O ensaio quantifica a liberação da enzima lactato desidrogenase citoplasmática das células cancerígenas, medindo a absorbância do produto de cor vermelha formado.

Um ensaio in vitro para avaliar a citotoxicidade de células assassinas naturais contra células cancerígenas

As células T reguladoras CD4+ são potentes imunomoduladores e desempenham funções importantes na homeostase imunológica. A escassez dessas células no sangue periférico torna os estudos funcionais desafiadores, especificamente no contexto da infecção pelo HIV-1. Descrevemos aqui um método para isolar e expandir Tregs CD4+ funcionais do sangue periférico de indivíduos infectados pelo HIV-1.

Novas ferramentas para expandir as células T reguladoras de indivíduos HIV-1-infected

Foi desenvolvido um ensaio in vitro para investigar o papel das vias de imunorreguladores na regulação da secreção de citoquinas por células T CD4 + específicas para o HIV.

In Vitro Ensaio para avaliar o impacto da imunorreguladora Pathways on específica para o HIV CD4 T efetoras celular Função

Ao contrário de partículas de HIV-1 livre de células, as células T CD4 + infectadas são eficazmente detectada pelas células dendríticas plasmocitoides (PDCs). Este manuscrito descreve um método em que as células mononucleares do sangue periférico (PBMCs) ou pDCs isoladas são co-cultivadas com o HIV-1 de células T infectadas para avaliar a detecção inata por pDCs como avaliada por libertação de IFN tipo I.

Avaliando a inata Sensing de HIV-1 CD4 Infected<sup&gt; +</sup&gt; As células T por células dendríticas plasmocitóides Usando um<em&gt; Ex vivo</em&gt; Co-cultura do sistema.

O objetivo deste estudo foi a formulação de tecnologias que permitem a transdução de gene bem sucedido na primária natural killer (NK) as células. O dextran-mediada Lentivirus transdução de humanos ou rato primário NK células os resultados, em maior eficiência de expressão do gene. Este método de transdução gene vastamente irá melhorar a manipulação genética de células NK.

Dextran aumenta a eficiência de Lentivirus transdução das células NK primário murino e humano

Um método baseado em citometria de fluxo para determinar quantitativamente a atividade citotóxica de células humanas de assassino natural é mostrado aqui.

Um ensaio de citotoxicidade baseados em citometria de fluxo para a avaliação da atividade das células NK humana

Um método simples para a obtenção de clones NK e células T de pacientes CAEBV foi desenvolvido com alta eficiência, uma pequena quantidade de sangue periférico e uma baixa dose de Il-2.

Um método simples e eficiente para estabelecer linhas de células T de pacientes com infecção crônica ativa vírus Epstein - Barr e NK

Nós descrevemos aqui um ensaio in vivo cytometry-baseado do fluxo da matança que permita a examinação do immunodominance em respostas citotóxicas do linfócito de T (CTL) a um antígeno modelo do tumor. Nós fornecemos exemplos de como este ensaio elegante pode ser empregado para estudos mecanistic e para o teste da eficácia da droga.

Adaptando os ensaios de citotoxicidade in vivo para estudar Imunodominância em respostas de células T CD8+ específicas do tumor

Aqui, descrevemos alguns métodos estabelecidos para determinar o estresse do retículo endoplasmático (ER) e a ativação da resposta proteica desdobrada (UPR), com ênfase particular na infecção pelo HIV-1. Este artigo também descreve um conjunto de protocolos para investigar o efeito do estresse do RE/UPR na replicação do HIV-1 e na infectividade do vírion.

Medindo o estresse do retículo endoplasmático e a resposta da proteína desdobrada em células T infectadas pelo HIV-1 e analisando seu papel na replicação do HIV-1

Aprenda a avaliar a resposta citotóxica de células NK contra células T CD4+ infectadas pelo HIV-1 usando ensaios de liberação de cromo e citometria de fluxo. Este método permite estudar interações receptor-ligante importantes na imunidade antiviral.

Preparação e Uso de HIV-1 infectados CD4 + T-Primária células como as células-alvo em Ensaios Natural Killer Celular citotóxicos (Vídeo) | JoVE Journal

Preparação e Uso de HIV-1 infectados CD4 + T-Primária células como as células-alvo em Ensaios Natural Killer Celular citotóxicos

Explorar mais vídeos