Name: Termodinâmica de enovelamento de proteínas de membrana Medido por espectroscopia de fluorescência (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-04-28T15:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 9 s
Description: Aprenda a medir a termodinâmica de enovelamento de proteínas de membrana usando espectroscopia de fluorescência de triptofano em vesículas LAR. Este método permite calcular a energia livre de Gibbs e analisar a estabilidade proteica.

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Agradecemos a Beijing Wu para uso de seus dados. Este trabalho foi financiado por uma concessão de CARREIRA NSF para Jek

1. Preparação de ~ 50 nm de diâmetro pequenas vesículas Unilamelares (SUVs) para Folding proteína de membrana <ol><li> Uma solução de 1,2-dimiristoil-sn-glicero-3-fosfocolina (DMPC) lipídios em clorofórmio é comprado e aliquotado em frascos de vidro limpo em 20 mg por frasco para armazenamento de quantidades. A camada de gás nitrogênio é adicionado a cada frasco para evitar a oxidação lipídica, e os frascos são selados com tampões e parafilme. Os frascos são armazenados em um freezer -20 ° C até o uso. </li><li> Um único frasco que contém uma alíquota de 20 mg de lipídios em clorofórmio é usado para cada experimento. O conteúdo do frasco são secados usando um fluxo de gás nitrogênio por 1 hora até que não permanece solvente. </li><li> Lipídios secas são ressuspendidos em 1 mL de tampão fosfato 20 mM de potássio (pH = 7.3) usando um sonicador banho-maria durante ~ 30 segundos. Esta solução de lipídios suspenso aparecerá nublado, e é transferido para um tubo de 15 mL de plástico com um fundo cônico. Outra alíquota de 1 mL de tampão fosfato é adicionado ao frasco de vidro vazio que originalmente continha lipídios e sonicação é repetido, a solução é então adicionado ao tubo de 15 mL mesma. Este processo é repetido um total de 4 vezes até que o volume final no tubo é de 4 mL, resultando em uma concentração de lipídios de 5 mg / mL desta solução vesícula estoque. </li><li> O volume de 4 mL de solução vesícula lipídica é colocada num local quente (~ 30 ° C) banho de água e sonicado usando um MICROTIP ultrasonicator por 1 hora em ciclo de trabalho de 50%. A finalidade do banho de água é duplo. Primeiro, ela impede a solução de lipídios de tornar-se demasiado quente devido ao processo de sonicação. Segundo, o banho quente garante que a temperatura da solução aquosa de lipídios permanece acima da temperatura bicamada fase de transição durante sonicação; para DMPC, esta temperatura de transição é de aproximadamente 23 ° C. </li><li> A solução sonicado é passado através de uma seringa 0,22 mM de filtro para remover detritos da ponta sonicador, e esta solução é filtrada equilibrada durante a noite a 37 ° C. </li></ol> 2. Preparação de amostra para Curva de fluorescência inicial Unfolding <ol><li> A solução estoque de 10 M de uréia em 20 mM tampão fosfato (pH 7,3) é feita. É essencial que a água ser adicionado ao sólido (e não vice-versa), pois a grande quantidade de uréia ocupa um volume significativo na solução. Esta solução de uréia pode ser feita pela adição de solutos para uma garrafa limpa e vazia e adicionando água até ao volume final pretendido. Esta solução pode exigir o aquecimento em banho-maria ou em uma chapa quente, mexendo para dissolver o soluto. Uréia é higroscópico e, portanto, a concentração real da solução estoque de uréia deve ser determinada através do índice de refração 1. </li><li> Uma solução tampão estoque de 20 mM de fosfato (pH 7,3) é feita. </li><li> Uma solução estoque de proteína é desdobrada preparado. Esta solução de proteína de ações deve ter uma concentração de proteína M ~ 200 em 8 de uréia M, tampão fosfato 20 mM. </li><li> Amostras para estudos de fluorescência são preparados da seguinte maneira. Volumes adequados de proteína de ações (seção 2.3), a solução estoque de lipídeos (5 lipídica mg / mL, seção 1), estoque 10 solução de uréia M (seção 2.1) e tampão fosfato de estoque (seção 2.2) são combinados para fazer amostras contendo ~ 4 proteína M, 1 mg / mL de lipídios, e 0-8 M de uréia em incrementos de 1 M. O volume total de cada amostra é de 200 mL. Uma planilha exemplo (Tabela 1) está incluído o que volumes listas exigidas usando uma solução de proteína M 200 ações. </li><li> Amostras em branco são feitas conforme descrito na seção 2.4, no entanto, a proteína não é adicionado. No lugar de proteína, 4 mL de uma solução de uréia 8 M podem ser adicionados para as concentrações de outros componentes são idênticos aos do ponto 2.4. Estes espaços são utilizados para subtrair espalhamento e sinal de fundo outra que aparece nos espectros de fluorescência da proteína. </li><li> Amostras de seções 2.4 e 2.5 são autorizados a incubar a 37 ° C por pelo menos 2 horas antes da medição de espectros de fluorescência para garantir dobrar completa e equilíbrio. </li></ol> 3. Medição de espectros de fluorescência Triptofano fluorescência de cada amostra e em branco é medida usando um fluorímetro steady-state. Espectros de fluorescência deve ser gravado com comprimento de onda de excitação de 290 nm para evitar a excitação de resíduos de tirosina, e digitalizados 305-500 nm. Entrada típica e bandpass de saída é de 3 nm. O incremento de comprimento de onda e tempo de integração pode ser otimizada para sinal-ruído. Valores típicos para o incremento de comprimento de onda e tempo de integração são 1 nm / etapa e 0,5 seg / step, respectivamente. Membrana proteínas em geral dobrar em lipídios sintéticos somente quando a temperatura está acima da temperatura bicamada fase de transição. Portanto, neste caso de DMPC, a temperatura da amostra é mantida constante em 30 ° C. A microvolume cubeta de sílica fundida com capacidade de 160 mL é utilizado nestes exexperimentos. 4. Geração de Curve Unfolding inicial e Estimativa da energia livre de Gibbs da proteína de membrana Unfolding <ol><li> Espectros de fluorescência na forma de um conjunto de dados xy são carregados no software, tais como Igor Pro, Matlab, Origin, ou Excel. </li><li> Sinal do fundo da vesícula uréia e lipídeos deve ser subtraído utilizando o seguinte procedimento: Spectrum A = espectro de fluorescência-prima de proteína na presença de vesículas lipídicas e de concentração específicos de uréia. B = espectro espectro primas fluorescência de amostra em branco correspondente que contém vesículas lipídicas e concentração de uréia mesma que no espectro de A; nenhuma proteína nas amostras está em branco. Spectrum Spectrum corrigido = A - C * espectro B. C é um escalar normalmente igual a 1,0. Em alguns casos, C é menor ou maior que 1.0 por causa de problemas de dispersão que causam sobre-ou sub-subtração perto da região nm ~ 305-320. </li><li> O comprimento de onda de máxima de fluorescência, λ max, é tabulados a partir de espectros corrigidos para cada concentração de uréia. Um valor típico para a plena desdobrado proteína de membrana é de 350 nm, enquanto a de proteína dobrada é de aproximadamente 330 nm. Comprimentos de onda tabelados são convertidos em fração desdobrado convertendo o intervalo de valores λ max (~ 330 a ~ 350 nm) para a faixa 0,0-1,0 correlacionar a λ valor máximo a fração da população se desenrolava. Por exemplo, um valor máximo de λ 330 nm corresponde a 0,0, a 350 nm corresponde a 1,0, e 340 nm corresponde a 0,5 em termos de fração desdobrado. Esta fração de proteína é, então, desdobrado plotado contra a concentração de uréia. Como dito acima, a concentração de uréia deve ser determinada experimentalmente através da medição do índice de refração. </li><li> Supomos que a proteína pode existir em um dos dois estados: dobrado ou desdobrado. O enredo da fração desdobrado, f, versus concentração de uréia, C, pode estar em forma para a equação: 2 <img src="/files/ftp_upload/2669/2669eq2.jpg" alt="Equação 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Equação 2"> O coeficiente de m corresponde à taxa de variação da energia livre com respeito à concentração desnaturante e C m corresponde à concentração de uréia no ponto médio em que a população dobrada é igual a população se desenrolava. Estes valores são as variáveis ​​encaixe obtido a partir de ajuste dos mínimos quadrados por dados software de análise. R (0.001987 kcal / mol • K) é a lei do gás constante, e T é a temperatura (303 K). </li><li> Os coeficientes obtidos a partir do ajuste são utilizadas para determinar a energia livre de Gibbs (kcal / mol) de desdobramento, na ausência de uréia: <img src="/files/ftp_upload/2669/2669eq3.jpg" alt="Equação 3" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Equação 3"> . </li></ol> 5. Otimizado Unfolding Curva para medições mais precisas de energia livre de Gibbs de desdobramento. <ol><li> A curva de desdobramento descrito acima revela a gama de concentrações de uréia que faz com que a maior mudança no λ max. Esta gama é normalmente pequeno, ea maioria de desdobramento ocorre dentro desta faixa de pequeno porte. , A fim de determinar com precisão a energia livre de desdobramento, amostras adicionais são analisados ​​nesta região para obter um lote que contém muitos pontos dados necessários para a montagem dos mínimos quadrados otimizado. Por exemplo, se a proteína se desdobra entre 2 e 4 de uréia M, as amostras podem ser feitas que contêm 2-4 M de uréia em incrementos de 0,2 M para revelar mais precisamente a forma desta importante região da curva de desenvolvimento. Não é necessário medir espectros em branco em cada concentração de uréia, é suficiente para medir um espectro em branco a cada passo ~ 0,5 M. </li><li> A energia livre de desdobramento obtido a partir deste enredo pode ser ligeiramente diferente do obtido na curva original desdobramento, mas reflete um valor mais preciso. </li></ol> 6. Resultados representativos: <table border="1"><tbody><tr><td> Amostra </td><td> final [uréia], M </td><td> proteína de ações (mL) </td><td> lipídica de ações (mL) </td><td> estoque 10 M uréia (mL) </td><td> estoque regulador (mL) </td></tr><tr><td> 1 </td><td> ~ 0,16 </td><td> 4 </td><td> 40 </td><td> 0 </td><td> 156 </td></tr><tr><td> 2 </td><td> 1 </td><td> 4 </td><td> 40 </td><td> 20 </td><td> 136 </td></tr><tr><td> 3 </td><td> 2 </td><td> 4 </td><td> 40 </td><td> 40 </td><td> 116 </td></tr><tr><td> 4 </td><td> 3 </td><td> 4 </td><td> 40 </td><td> 60 </td><td> 96 </td></tr><tr><td> 5 </td><td> 4 </td><td> 4 </td><td> 40 </td><td> 80 </td><td> 76 </td></tr><tr><td> 6 </td><td> 5 </td><td> 4 </td><td> 40 </td><td> 100 </td><td> 56 </td></tr><tr><td> 7 </td><td> 6 </td><td> 4 </td><td> 40 </td><td> 120 </td><td> 36 </td></tr><tr><td> 8 </td><td> 7 </td><td> 4 </td><td> 40 </td><td> 140 </td><td> 16 </td></tr></tbody></table> Tabela 1. Volume das soluções de reserva necessária para fazer amostras de fluorescência <img src="/files/ftp_upload/2669/2669fig1.jpg" alt="Figura 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 1"> Figura 1. Triptofano espectros de fluorescência de ~ 5 proteína de membrana M representante que contém um resíduo de triptofano único. (A) Espectros de fluorescência da proteína Raw (Um espectro de 4,2), (B) Raw espectros de fluorescência de branco (espectro B de 4,2), (C) Corrigido espectro de 4,2. <img src="/files/ftp_upload/2669/2669fig2.jpg" alt="Figura 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 2"> Figura 2. Corrigida triptofano espectros de fluorescência da proteína de membrana a partir da Figura 1 para as concentrações de uréia numerosos. <img src="/files/ftp_upload/2669/2669fig3.jpg" alt="Figura 3" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 3"> Figura 3. Unfolding curva obtida a partir de dados na Figura 2, com ajuste para a equação em 4,4. A energia livre de Gibbs é calculado de acordo com a secção 4.5.

<ol><li>Shirley, B. A. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aShirley%2C+BA+%22Protein+Folding+and+Stability%22">Protein Folding and Stability</a>. Shirley, B. A. , Humana Press. 177-190 (1995).</li>
<li>Pace, C. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Determination+and+Analysis+of+Urea+and+Guanidine+Hydrochloride+Denaturation+Curves%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Enzymol%22%5BJournal%5D)">Determination and Analysis of Urea and Guanidine Hydrochloride Denaturation Curves.</a> Methods Enzymol. 131, 266-279 (1986).</li>
<li>Lau, F. W., Bowie, J. U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Method+for+Assessing+the+Stability+of+a+Membrane+Protein%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">A Method for Assessing the Stability of a Membrane Protein.</a> Biochemistry. 36, 5884-5892 (1997).</li>
<li>Burgess, N. K., Dao, T. P., Stanley, A. M., Fleming, K. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((%CE%B2-Barrel+Proteins+that+Reside+in+the+Escherichia+coli+Outer+Membrane+in+Vivo+Demonstrate+Varied+Folding+Behavior+in+Vitro%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">β-Barrel Proteins that Reside in the Escherichia coli Outer Membrane in Vivo Demonstrate Varied Folding Behavior in Vitro.</a> J. Biol. Chem. 283, 26748-26758 (2008).</li>
<li>Booth, P. J., Curnow, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Folding+scene+investigation%3A+membrane+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Opin.+Struct.+Biol%22%5BJournal%5D)">Folding scene investigation: membrane proteins.</a> Curr. Opin. Struct. Biol. 19, 8-13 (2009).</li>
<li>Hong, H., Tamm, L. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Elastic+coupling+of+integral+membrane+protein+stability+to+lipid+bilayer+forces%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Elastic coupling of integral membrane protein stability to lipid bilayer forces.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 101, 4065-4070 (2004).</li>
<li>Sanchez, K. M., Gable, J. E., Schlamadinger, D. E., Kim, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+Tryptophan+Microenvironment%2C+Soluble+Domain%2C+and+Vesicle+Size+on+the+Thermodynamics+of+Membrane+Protein+Folding%3A+Lessons+from+the+Transmembrane+Protein+OmpA%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Effects of Tryptophan Microenvironment, Soluble Domain, and Vesicle Size on the Thermodynamics of Membrane Protein Folding: Lessons from the Transmembrane Protein OmpA.</a> Biochemistry. 47, 12844-12852 (2008).</li>
</ol>

Não há conflitos de interesse declarados.

O protocolo atual descreve a geração de curvas de desdobramento da membrana-associados proteínas e peptídeos que contêm resíduos de triptofano. Aqui, presume-se que a fluorescência de triptofano reflete se a proteína é dobrado e inserido em vesículas lipídicas sintéticas, ou desdobrado em solução. Suposições adicionais, tais como dois estados dobrar e dependência linear de energia livre com a concentração de desnaturante, são feitas no presente relatório;. Modificação destes pressupostos resultado em diferentes equações...

<table><tbody><tr><td>DMPC</td><td>Avanti Polar Lipid, Inc</td><td>850345C</td><td></td></tr><tr><td>Ureia</td><td>MP Biomedicals</td><td>04821527</td><td></td></tr><tr><td>Fosfato de Potássio Dibásico</td><td>Fisher Scientific</td><td>P288</td><td></td></tr><tr><td>Fosfato de Potássio Monobásico</td><td>Fisher Scientific</td><td>P285</td><td></td></tr></tbody></table>

termodinâmica de enovelamento de proteínas de membrana medido por espectroscopia de fluorescência

Thermodynamics of Membrane Protein Folding Measured by Fluorescence Spectroscopy

Enovelamento de proteínas da membrana é um tema emergente com significado fundamental e saúde. A abundância de proteínas da membrana das células está subjacente a necessidade de estudo detalhado da dobragem desta família de proteínas onipresente. Além disso, os avanços na nossa capacidade de caracterizar doenças associadas com proteínas deformadas ter motivado significativos esforços experimentais e teóricos no campo de enovelamento de proteínas. Progresso rápido neste domínio importante é, infelizmente, dificultada pela desafios inerentes associados com proteínas da membrana e da complexidade do mecanismo de dobramento. Aqui, descrevemos um procedimento experimental para medir a propriedade termodinâmica da energia livre de Gibbs de desdobramento, na ausência de desnaturante, Δ G ° H 2 O, por uma proteína de membrana representante integrante da E. coli. Este protocolo incide sobre a aplicação da espectroscopia de fluorescência para determinar as populações dos estados de equilíbrio dobrada e desdobrada em função da concentração de desnaturante. Considerações experimentais para a preparação de vesículas lipídicas sintéticas, bem como etapas fundamentais no processo de análise de dados são realçados. Esta técnica é versátil e pode ser perseguido com diferentes tipos de desnaturante, incluindo temperatura e pH, bem como em vários ambientes de dobramento de lipídios e micelas. O protocolo atual é aquele que pode ser generalizada para qualquer membrana ou proteína solúvel que atenda o conjunto de critérios discutidos abaixo.

Este artigo detalha o procedimento de vídeo experimental para a obtenção da energia livre de Gibbs da dobradura de proteína de membrana por fluorescência de triptofano.

Termodinâmica de enovelamento de proteínas de membrana Medido por espectroscopia de fluorescência

O dobramento de proteínas de membrana é um tópico emergente com significância tanto fundamental quanto relacionada à saúde. A abundância de proteínas de membrana nas células ...

O objetivo geral do experimento a seguir é medir a termodinâmica associada ao dobramento de proteínas de membrana. Isso é alcançado primeiramente montando vesículas pequenas de LAR para fornecer um ambiente de dobramento para a proteína de membrana. Uma vez construídas, as vesículas são usadas para preparar amostras contendo proteína e concentrações sistematicamente variadas de ureia.Em seguida, o espectro fluorescente do triptofano de cada amostra é medido com o objetivo de coletar dados necessários para gerar uma curva de desdobramento de proteína de membrana; os resultados obtidos demonstram como a energia livre de Gibbs do desdobramento de proteína de membrana pode ser determinada com base em curvas de desdobramento geradas a partir de espectros fluorescentes do triptofano. Olá, meu nome é Judy Kim. Sou professora assistente na Universidade da Califórnia em San Diego.O método que você está prestes a observar revela uma propriedade importante das proteínas de membrana. Especificamente, mostraremos como medir a estabilidade de uma proteína dobrada e inserida em uma bicamada lipídica. Meu nome é Diana Ottinger, e sou aluna de pós-graduação no Departamento de Química da uc, San Die

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