Termodinâmica de enovelamento de proteínas de membrana Medido por espectroscopia de fluorescência

O objetivo geral do experimento a seguir é medir a termodinâmica associada ao dobramento de proteínas de membrana. Isso é alcançado primeiramente montando vesículas pequenas de LAR para fornecer um ambiente de dobramento para a proteína de membrana. Uma vez construídas, as vesículas são usadas para preparar amostras contendo proteína e concentrações sistematicamente variadas de ureia.

Em seguida, o espectro fluorescente do triptofano de cada amostra é medido com o objetivo de coletar dados necessários para gerar uma curva de desdobramento de proteína de membrana; os resultados obtidos demonstram como a energia livre de Gibbs do desdobramento de proteína de membrana pode ser determinada com base em curvas de desdobramento geradas a partir de espectros fluorescentes do triptofano. Olá, meu nome é Judy Kim. Sou professora assistente na Universidade da Califórnia em San Diego.

O método que você está prestes a observar revela uma propriedade importante das proteínas de membrana. Especificamente, mostraremos como medir a estabilidade de uma proteína dobrada e inserida em uma bicamada lipídica. Meu nome é Diana Ottinger, e sou aluna de pós-graduação no Departamento de Química da uc, San Diego.

Hoje, demonstraremos este método em uma proteína de membrana representativa. No entanto, esta técnica é geral e pode ser aplicada a outros sistemas biológicos, como peptídeos associados à membrana e proteínas solúveis. Então, vamos começar.

Antes do início deste protocolo, adquira uma solução de um dos dois óleos de DME, SN glicerol, três fosfocolina ou DMPC, lipídio em clorofórmio, e elua em frascos de vidro limpos. Em quantidades de 20 miligramas por frasco, adicione uma camada de gás nitrogênio a cada frasco para prevenir a oxidação do lipídio e feche os frascos. Um único frasco contendo 20 miligramas de lipídio em clorofórmio é utilizado para cada experimento.

Para preparar a solução estoque de vesículas, comece secando o conteúdo do frasco sob um fluxo de gás nitrogênio por uma hora, utilizando um septo de teflon e agulhas, até que nenhum solvente permaneça. Adicione um mililitro de tampão fosfato de potássio 20 milimolar, pH 7,3, aos lipídios secos e ressuspenda por aproximadamente 30 segundos em banho-maria. Transfira a suspensão turva resultante para um tubo plástico de 15 mililitros com fundo cônico usando uma pipeta.

Adicione mais um mililitro de tampão fosfato ao vial de vidro vazio que originalmente continha o lipídio e repita a sonicagem. Adicione a suspensão resultante ao mesmo tubo de 15 mililitros. Repita este processo um total de quatro vezes para obter um volume final de quatro mililitros e uma concentração de lipídio de cinco miligramas por mililitro.

Coloque a suspensão de vesículas lipídicas em um banho-maria aquecido e sonique utilizando uma microponte ultrassônica por uma hora com ciclo de trabalho de 50%. O banho-maria evita que a solução lipídica fique muito quente e mantém a temperatura da solução lipídica aquosa acima da temperatura de transição de fase da bicamada.

Filtre a solução SÔNICA por um filtro de seringa de 0,22 mícrons para remover detritos da ponta do sonicator e deixe a solução filtrada equilibrar durante a noite a 37 graus Celsius. Para preparar a amostra para o desdobramento inicial por fluorescência, prepare uma solução estoque de 10 molar de ureia em tampão fosfato 20 milimolar e uma solução estoque de tampão fosfato 20 milimolar. De acordo com o protocolo escrito, a concentração de ureia deve ser determinada experimentalmente mediante a medição do índice de refração com um refratômetro e comparação com valores conhecidos.

Em seguida, prepare uma solução estoque de proteína desdobrada numa concentração de aproximadamente 200 micromolar de proteína em oito molar de ureia, 20 milimolar de tampão fosfato. Neste vídeo, a proteína de membrana OPA A é utilizada para demonstrar o protocolo; amostras para estudos fluorescentes são preparadas combinando volumes apropriados da solução estoque de proteína, solução estoque de lipídio, solução estoque de 10 molar de ureia e tampão fosfato estoque para produzir amostras contendo aproximadamente quatro micromolar de proteína, um miligrama por mililitro de lipídio e de zero a oito molar de ureia em incrementos de um molar, resultando num volume total de 200 microlitros. Amostras branco são preparadas da mesma maneira.

No entanto, quatro microlitros de uma solução de ureia oito molar são substituídos pela proteína. Esses brancos são preparados para subtrair os sinais de espalhamento e de fundo que aparecem nos espectros de fluorescência da proteína. Incube as amostras de proteína nos brancos a 37 graus Celsius por pelo menos duas horas antes da medição dos espectros de fluorescência.

Para garantir a dobragem completa, ligue o fluorímetro uma hora antes das medições. As proteínas de membrana geralmente se dobram em lipídios sintéticos apenas quando a temperatura está acima da temperatura de transição de fase da bicamada. Portanto, no caso de DMPC, a temperatura do porta-amostras no fluorímetro é ajustada a 30 graus Celsius.

Configure o experimento de fluorescência em um fluorímetro de estado estacionário e meça a fluorescência de triptofano de cada amostra em branco. O comprimento de onda de excitação deve ser ajustado para 290 nanômetros para evitar a excitação de resíduos de tirosina, e a emissão deve ser coletada entre 305 e 500 nanômetros. Utilize uma largura de faixa de passagem de entrada e saída de três nanômetros.

O incremento de comprimento de onda e o tempo de integração podem ser otimizados para a relação sinal-ruído. Os valores típicos para o incremento de comprimento de onda e o tempo de integração são um nanômetro por etapa e 0,5 segundos por etapa, respectivamente. Pipete 200 microlitros da amostra em uma cubeta de microvolume de sílica fundida Q Vet com capacidade de 160 microlitros e coloque a qve no suporte de qve da máquina.

Por fim, as medições de fluorescência podem ser iniciadas: carregue uma planilha de dados XY dos espectros de fluorescência em um software como Igor Pro, MATLAB Origin ou Excel. Para esta demonstração, o Igor Pro será utilizado para remover o fundo de ureia e de vesículas lipídicas, multiplicar o espectro de fluorescência da amostra em branco pelo fator de escala S e subtrair esse valor do espectro de fluorescência bruto da solução proteína-lipídio. Na aba correspondente à concentração de ureia, tabule o comprimento de onda de fluorescência máxima ou lambda máx a partir do espectro corrigido.

Para cada concentração de ureia. Um valor típico para uma proteína de membrana completamente desdobrada é 350 nanômetros. Enquanto que o de uma proteína dobrada é aproximadamente 330 nanômetros, traduza os comprimentos de onda tabelados para fração desdobrada convertendo a faixa de valores de lambda máx para uma faixa entre zero e um, correlacionando o valor de lambda máx à fração da população desdobrada.

Em seguida, construa o gráfico da fração de proteína desdobrada em função da concentração de ureia. O gráfico da fração desdobrada F versus a concentração de ureia C pode ser ajustado a uma equação que assume que a proteína pode existir em um dos dois estados: dobrado ou desdobrado. O coeficiente M corresponde à taxa de variação da energia livre em relação ao desnaturante e à concentração, e CM corresponde à concentração média de ureia na qual a população dobrada é igual à população desdobrada.

R é a constante da lei dos gases, e T é a temperatura em Kelvin. O procedimento de ajuste fornece valores para os coeficientes m e cm.

Esses coeficientes são multiplicados para determinar o delta G, a energia livre de Gibbs da desnaturalização na ausência de ureia. A curva de desdobramento descrita revela a faixa de concentrações de ureia que provoca a maior alteração no lambda máx. Essa faixa é tipicamente pequena e a maior parte do desdobramento ocorre dentro dessa pequena faixa, a fim de determinar com precisão a energia livre de desdobramento.

Amostras adicionais devem ser analisadas nesta região para obter um gráfico que contenha os diversos pontos de dados necessários para um ajuste ideal por mínimos quadrados. Por exemplo, se a proteína se desdobra entre duas e quatro molaridades de ureia, amostras podem ser preparadas entre essas concentrações de ureia em incrementos de 0,2 molar para revelar com maior precisão a forma desta região importante na curva de desdobramento. Um branco deve ser incluído a cada 0,5 molar, no mínimo, e a cada 0,2 molar para melhores resultados.

A energia livre de desdobramento obtida a partir deste gráfico pode diferir ligeiramente daquela obtida na curva original de desdobramento, mas reflete um valor mais preciso. Abaixo estão os espectros fluorescentes de triptofano da proteína de membrana representativa om a que contém um único resíduo de triptofano. O espectro bruto de fluorescência do branco é subtraído dos espectros brutos de fluorescência da proteína conforme descrito no protocolo, resultando no espectro corrigido.

Os espectros fluorescentes corrigidos de triptofano da proteína de membrana para diversas concentrações de ureia são apresentados aqui a partir dos métodos descritos. Nesta demonstração, uma curva de desdobramento foi gerada sob a suposição de que a proteína está ou dobrada ou desdobrada e que não há um estado estável. O parâmetro M reflete a quantidade de polipeptídeo exposta ao solvente após o desdobramento, enquanto CM é um valor importante que descreve o desnaturante e a concentração necessária para atingir uma população igual de formas dobradas e desdobradas.

Valores elevados de CM e M indicam uma proteína estável. A energia livre de Gibbs da desnaturalização foi calculada como sendo 6,2 quilocalorias por mol para OPA a, seguindo este procedimento. Outros métodos de desdobramento, como calor, pH e outros desnaturantes químicos, podem ser utilizados para fornecer informações análogas sobre a termodinâmica da dobragem de proteínas.

Após assistir a este vídeo, você deverá ter uma boa compreensão de como medir a estabilidade de uma proteína com base nas diferentes propriedades de fluorescência dos estados dobrado e desdobrado. Alternativamente, você também poderia gerar uma curva de desdobramento utilizando outros métodos, como circular, dim, desde que o método informe sobre a conformação da proteína, independentemente da ferramenta analítica que você escolher. O método de curvas de desdobramento é versátil e pode ser aplicado a uma ampla variedade de proteínas de membrana e solúveis.