Imunocitoquímica: células-tronco neurais

Olá, sou Steve. Eu trabalho no laboratório do Dr. Flanagan no Departamento de Patologia da UC, Irvine. E hoje vou mostrar como fazer imunoquímica de células precursoras neurais humanas.

Este protocolo inclui colocar células em lamínulas revestidas e bloquear e incubar células em anticorpos primários durante a noite e, em seguida, fazer vários was e colocar anticorpos secundários e em temperatura ambiente. E, finalmente, a montagem das lamínulas de cobertura em vôos de microscópios. Vamos começar.

Então, primeiro vou colocar três lamínulas de vidro alemão estéreis com 12 milímetros de diâmetro em uma placa de 24 poços para revesti-las com laminado. Agora eu tenho minhas lamínulas na placa e, primeiro, vou adicionar uma solução de polilisina PDL e incubar as substituições de cobertura em PDL por cinco minutos em temperatura ambiente. Então, agora, ao final de cinco minutos, vou remover o PDL e colocar laminina, e vou incubar as lamínulas em laminado por pelo menos quatro horas ou mais durante a noite.

Então, incubei a placa durante a noite em laminado e agora vou enxaguar as lamínulas com PBS e células precursoras neurais humanas que já contei. Então, acabei de remover as soluções laminadas e agora vou controlar as lamínulas com PBS. Então agora vou remover o PBS e colocar a solução de mídia.

E, finalmente, estou pronto para ver as células. Então, vou ver as células em cem mil células por moinho, o que significa que para uma placa de 24 poços vou adicionar 50.000 células por poço, porque, como cada poço contém meio mililitro. Então, vou inclinar a placa de um lado para o outro para garantir que as células se espalhem uniformemente na superfície da lamínula.

E agora vou colocá-los na incubadora por pelo menos 24 horas para deixá-los se acalmar e se espalhar para imunoquímica. Então, as células estão crescendo há 24 horas e eu olhei para elas e elas estão presas e bem espalhadas. Então, agora vou corrigi-los com 4% de altura por cinco minutos.

Mas primeiro vou remover a mídia e não quero deixar as células secarem. Então, vou remover a mídia e adicionar fixador ao mesmo tempo. Por isso, é chamada de técnica de duas mãos.

Então agora vou incubar as células no fixador por cinco minutos em temperatura ambiente. Então, já se passaram cinco minutos. Vou remover o PFA e colocá-lo no recipiente de resíduos de PFA e adicionar PBS ao mesmo tempo em que removo o PFA para que as células não sequem.

Então, vou usar uma dessas pipetas de sucção de plástico para puxar o PFA e vou ajustar o cronômetro para cinco minutos. Então, enquanto minhas células estão em lavagem PBS, vou preparar uma solução de visualização permanente usando Triton X 100. É um detergente não iônico e é muito, muito viscoso.

Portanto, é importante esperar até que toda a solução entre na pipeta. Então, vou preparar uma solução de 0,3% em PBS, vou adicionar 10 mils de PBS. E a esses 10 mils de PBS, vou adicionar 30 microlitros de tri nos próximos 100.

Então, vou adicionar 30 microlitros de tri nos próximos 100 a 10 mils de PBS. Então, vou adicionar cerca de 10 segundos para permitir que toda a solução entre na ponta. Então, eu tenho aqui minha solução de utilização permanente.

Coloquei-o no rotador por 10 minutos e depois o coloquei em vórtice para garantir que o tritton viscoso se dissolvesse completamente. Então, agora estou pronto para fazer a etapa de visualização permanente. E então eu vou, por cinco minutos em temperatura ambiente.

Então, já se passaram cinco minutos. Vou fazer agora três lavagens de PBS de cinco minutos para ter certeza de lavar todo o tritão. Então, mais uma vez, vou ajustar o relógio para cinco minutos.

Então, acabei de terminar todas as minhas etapas de lavagem, então estou pronto para fazer a etapa de bloqueio. Então, para a etapa de bloqueio, preparei uma solução de 5% BSA em PBS. E, assim como em todas as lavagens, vou remover o PBS e adicionar a solução de bloqueio ao mesmo tempo.

E a etapa de bloqueio vai durar uma hora em temperatura ambiente. Então, enquanto minhas células estão em bloqueio, vou preparar a placa para a incubação primária de anticorpos. Então, vou começar com essa placa de vidro e cortar um pedaço de filme paralímpico desse tamanho.

E o que vou fazer é enrolá-lo e preciso de um pouco de fita, então vou precisar de quatro pedaços de fita. Então, vou preparar todos eles. Então, vou pegar esse pedaço de filme paralímpico e endireitá-lo para que a superfície fique bonita e lisa.

E, então, vou pegar cada extremidade e colá-la na parte de trás da placa de vidro. Então, agora vou puxar isso para a outra extremidade para garantir que as superfícies fiquem retas e vou prender a outra extremidade na parte de trás. Então agora eu preciso de outro filme de par do mesmo tamanho que o primeiro.

E basicamente eu vou fazer a mesma coisa. Então eu colei um segundo pedaço de filme para em cima do primeiro, assim como o primeiro, exceto que deixei uma extremidade do segundo pedaço de perfil solto porque vou colocar a solução de anticorpos e depois deslizar a energia no primeiro pedaço. E então eu vou colocar a segunda peça em cima dela que está fazendo um sanduíche.

Mas agora, vou rotular o local onde vou colocar a solução de anticorpos e cobrir. Então, as células estão na solução de bloqueio há uma hora, e vou colocar as lamínulas nas gotículas de anticorpo primário para incubação durante a noite agora. Então, vou colocar uma gota de 35 microlitros de anticorpo primário e terei muito cuidado para não expelir todo o líquido, pois isso pode criar bolhas e as bolhas podem interferir na ligação do anticorpo ao antígeno.

Então, quero tentar evitar bolhas na gota, todas as três gotas de anticorpo primário, e estou pronto para, para colocar a tampa, cobrir lamínulas com células nessas gotas. Então, o que vou fazer agora é pegar uma folha de segurança. Então, primeiro vou mover a lamínula para o lado e tentar levantá-la suavemente com a pinça aberta.

Assim que eu sentir que segurei a lamínula, vou fechar lentamente a pinça e levantar suavemente a lamínula para fora do poço. Portanto, as células agora estão em cima da lamínula. Então, o que vou fazer é inverter invertido e tocar suavemente a gota e colocá-la lentamente em cima da gota sem criar bolhas.

E então vou repetir o mesmo procedimento com a segunda e a terceira lamínulas. E o passo final é colocar o segundo pedaço de filme paralímpico em cima. E a maneira como vou fazer isso é colocá-lo em um movimento como esse.

Quero tentar evitar me mover, movendo-o de um lado para o outro. E, finalmente, vou prendê-lo no fundo da placa com outro pedaço de fita adesiva. E agora, finalmente, as células estão prontas para serem incubadas a quatro graus durante a noite, e este é o fim do primeiro dia da imunoquímica.

Este é o segundo dia de imunoquímica, e vou lavar as lamínulas em PB S3 vezes por cinco minutos. E então vou incubar em anticorpo secundário por duas horas em temperatura ambiente. Primeiro, vou cortar o filme paralímpico assim para que eu possa remover as lamínulas.

E eu vou levantar a parte superior do filme paralímpico lentamente para que as lamínulas permaneçam na parte inferior do filme paralímpico de cuidado. Então, removi a primeira peça e tenho a placa com a solução de lavagem PBS pronta. Então, vou levantar cada sopa de cobertura e colocá-la no poço para, para lavar qualquer anticorpo primário restante que não tenha se ligado ao epítopo.

Então, para levantar a lamínula, primeiro vou segurá-la assim com uma lâmina de barbear e tentar pegá-la com cuidado. E como as células estão, estamos enfrentando a solução de anticorpos, vou virá-las para que fiquem no topo agora e colocá-las no poço para que ainda permaneçam no topo. E vou repetir o procedimento para os deslizamentos de energia restantes.

E então eles vão ser lavados por cinco minutos. Então, já se passaram cinco minutos. Vou substituir a solução PBS.

Vou adicionar que os ganchos morrem. Agora vou incubá-lo por cinco minutos. Então, a incubação dos ganchos está concluída, e agora estou pronto para montar os sos da tampa e olhar para eles.

Então, primeiro vou usar o escudo vetorial quádruplo, que ajuda a evitar que as moedas fluorescentes sejam branqueadas. Eu vou, bem, primeiro vou rotular o slide com o, com o número de lamínulas, e depois vou colocar 10 microlitros de escudo vetorial. O escudo vetorial é um óleo e é muito viscoso, então também é importante esperar um pouco até que tudo entre na ponta.

Então coloquei um escudo vetorial na lâmina do microscópio e agora estou pronto para colocar as lamínulas na lâmina do microscópio. Então, o que vou fazer primeiro é pegar uma lamínula e enxaguar a parte de trás da lamínula com água deionizada, porque se eu não fizer isso, quando secar, o sal que estava no PBS vai cristalizar e vai interferir nas propriedades ópticas das matrizes fluorescentes. Então eu vou, eu tenho minha água deionizada pronta.

E então eu vou pegar a lamínula e enxaguar a parte de trás dela com água deionizada. E então eu vou tocar no lenço umedecido para secá-lo. E então eu vou invertê-lo novamente para que o lado da célula seja invertido e desça para a lâmina do microscópio.

E, assim como antes, vou tocar na gota do escudo vetorial e abaixá-la lentamente sem prender nenhuma bolha. E vou repetir o mesmo, o mesmo procedimento, para todos os lançamentos de carga. E agora vamos dar uma olhada.

Este é um exemplo do que você pode obter depois de fazer imunoquímica e obter suas fotos e fazer sobreposições e tal. Então, nesta imagem, esta é uma imagem de células-tronco neurológicas do hipocampo isoladas de dent gys em camundongos pós-natais. Hoje eu mostrei a vocês como fazer imunoquímica de células precursoras neurais humanas.

E se você notar, essa técnica permite que você salve o reagente de anticorpos expansivo. Usamos um volume muito pequeno de anticorpo primário e secundário, colocando uma pequena gota em um perfil e invertendo a lamínula com as células em cima dela. Então continue, faça química de imunoterapia e obrigado por me assistir.