Name: Imunocitoquímica: células-tronco neurais (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2007-08-24T00:00:00.000+00:00
Duration: 19 min 41 s
Description: Aprenda a técnica de imunocitoquímica para análise de células-tronco neurais humanas. Este protocolo otimizado demonstra marcação de antígenos com eficiência e economia de anticorpos.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Os autores gostariam de agradecer o Dr. Philip H. Schwartz da Célula de Recursos Humanos Neural Stem Nacional no Hospital da Criança, Orange County Instituto de Pesquisa para a prestação de culturas hNSPC e Dr. Gary Bassell da Universidade de Emory para a instrução inicial na técnica de coloração parafilme.

Dia 1: Células Preparando Lamelas de vidro alemão e Seeding Nota: lamínulas alemães são muitas vezes preferível para cultura primária de células-tronco neurais e neurônios. Nós usamos o protocolo de limpeza a seguir para melhorar a adesão celular e se espalhando. Lamínulas posição em um rack pequeno que permitirá o acesso líquido para ambos os lados da lamela. Primeiro, lamínulas incubar em Liquinox 1% por 10 minutos, seguido de 3 lavagens com água deionizada. Certifique-se que não permaneçam bolhas de sabão. Em seguida, desliza incubar em 1M HCl por 30 minutos, seguido de 3 lavagens com água deionizada. Lamínulas seco a 65 ° C durante a noite. Transferência de lamínulas para um prato de vidro e autoclave para esterilizar. <ol><li> Em uma capa de cultura de tecidos, coloque lamínulas estéreis em uma placa de tamanho apropriado bem. </li><li> Lamínulas casaco com laminina para adesão celular. Lamínulas incubar em 10 mcg / ml poli D-lisina (PDL) em água estéril por 5 minutos em temperatura ambiente. Remover lamínulas PDL e incubar em 20 mcg / ml laminina na EMEM por 4 horas, ou durante a noite, em um 37 ° C de cultura de tecidos incubadora. <ol><li> Nota: Consulte o artigo Neural Stem Passaging Humanos Cells ( <a href="/index/Details.stp?ID=263">https://www.jove.com/index/Details.stp?ID=263</a> ) ea Human Neural Stem Contando artigo Cells ( <a href="/index/Details.stp?ID=262">https://www.jove.com / index / Details.stp? ID = 262</a> ) para aprender a ressuspender e contar hNSPCs. </li></ol></li><li> Enxágüe laminina revestido lamínulas com PBS e as células de semente em cada lamela contendo bem em uma certa densidade (muitas vezes usamos uma densidade inicial de chapeamento 100,000-300,000 células / ml para as células que estamos revestimento para a imunocoloração). </li><li> Colocar a placa em 37 ° C a cultura de tecidos incubadora e permitem que as células a aderir em lamínulas (geralmente um mínimo de 4 horas é necessário). </li></ol> Dia 2: Fixação permeabilização, bloqueio, e adição de anticorpo primário para Células Nota: Usamos o fixador paraformaldeído seguintes 4% para preservar a morfologia das células. A receita inclui uma transição pH para permitir que o paraformaldeído para entrar em solução. Nós preferimos este método ao invés do uso de calor para dissolver paraformaldeído porque as temperaturas mais altas podem levar à geração de ácido fórmico, que pode aumentar coloração de fundo quando se utiliza de fluorescência. Alguns componentes do fixador ajudar a preservar a estrutura do citoesqueleto (MgCl 2 e EGTA), enquanto outros ajudam a manter a morfologia geral (sacarose). Fixadora paraformaldeído 4% para Células <table style="border-collapse: collapse; border: medium none" border="1" cellspacing="0" cellpadding="0"><tbody><tr><td> Reagentes e passos: </td><td> Montante para 100 mL de fixador: </td></tr><tr><td> Água MilliQ </td><td> 75 ml </td></tr><tr><td> Paraformaldeído (pesar na capela) </td><td> 4 g </td></tr><tr><td> NaOH 10N, mexa e adicione algumas gotas até que a solução limpa </td><td> quando necessário </td></tr><tr><td> PBS 10X </td><td> 10 ml </td></tr><tr><td> 1M MgCl 2 </td><td> 0,5 ml </td></tr><tr><td> 0,5 M EGTA </td><td> 2 ml </td></tr><tr><td> Sacarose </td><td> 4 g </td></tr><tr><td> 6N HCl, titular de pH 7,4 </td><td> quando necessário </td></tr><tr><td> Água MilliQ </td><td> trazer para 100 ml </td></tr><tr><td colspan="2"> Armazenar a 4 ° C por até 1 semana. Quente a 37 ° C antes do uso </td></tr></tbody></table><ol><li> No banco, remova a mídia e adicione fixador pré-aquecido. Incubar por 5-15 minutos (dependendo do antígeno a ser detectado, normalmente os usamos 10 minutos). Realizar esta e as etapas a seguir à temperatura ambiente. </li><li> Descartar o fixador para um recipiente adequado, como muitas instituições lidar com paraformaldeído como resíduos perigosos. Lave as células 3 vezes com PBS, 5 minutos de cada vez. Ao remover soluções a partir de células, tenha cuidado que a sucção não seque as células. Além disso, sempre tem a próxima solução na mão para adicionar células antes de remover a solução que reveste-los para as células não são deixados para secar. </li><li> Se o antígeno de interesse é no interior da célula, a membrana celular deve ser feita permeável para permitir a entrada do anticorpo. Para permeabilizar as células, use uma nova solução de 0,3% Triton X-100 em PBS. Pipeta lentamente porque Triton é viscoso, e certifique-se o detergente é completamente dissolvido em PBS antes de adicionar às células. Permeabilizar as células por 5 minutos, seguido de lavagem das células 3 vezes com PBS, 5 minutos de cada vez. </li><li> As células devem ser tratados com um agente de bloqueio para evitar ligações não específicas do anticorpo. Usamos albumina bovina (BSA) como um agente de bloqueio. A solução de bloqueio é feito através da dissolução BSA 5% em PBS (em um balancim ou rotador, porque leva tempo para dissolver), em seguida, filtrar o solution com um filtro de seringa de 0,45 mM. Bloco de células em 5% solução BSA / PBS por 1 hora à temperatura ambiente. </li></ol> Diluir o anticorpo primário (que é quase específico para a proteína de interesse) a uma concentração pré-determinada em 1% BSA / PBS (preparadas por diluição de 5% BSA / PBS). Coloque o anticorpo primário diluído (30 mL por 25 lamela mm, 20 l por 18 lamela mm, 15 mL por 12 lamela mm) em uma placa de vidro coberta com parafilme. Pick up a lamela com células fixas, inverter de tal forma que as células viradas para baixo, e coloque-o sobre a solução de anticorpos para que as células estão em contato com o anticorpo. Coloque uma tira parafilme segundo sobre a construção inteira. Incubar a 4 ° C durante a noite. Dia 3: lavar roupa, incubação com anticorpo secundário, Stain Nuclear e de montagem <ol><li> Remova cuidadosamente a fita parafilme topo e pegar as lamelas, invertê-lo, e colocá-lo de volta para a placa com PBS em cada poço de lava de modo que as células são virados para cima. </li><li> Lave as células 3 vezes com PBS, 5 minutos de cada vez. </li><li> Escolha um anticorpo secundário que irá detectar o anticorpo primário, por exemplo, se o anticorpo primário foi feito em um coelho, o anticorpo secundário devem reconhecer coelho IgG. Tome cuidado também para coincidir com o isotipo de anticorpos (IgG, IgM, etc). Se estiver usando múltiplos anticorpos primários, certifique-se que eles são de diferentes espécies ou isotipos, e plano para detectar com diferentes marcadores ligados aos anticorpos secundários. Por exemplo, você poderia usar um anti-coelho acoplado secundária a um fluoróforo vermelho com um mouse acoplado anti secundária a um fluoróforo verde. Incubar as células na solução de anticorpo secundário diluído para uma concentração adequada em BSA 1% por 2 horas no escuro a temperatura ambiente, usando a mesma técnica para a primária (passos não mostrado no vídeo). O volume de anticorpo secundário necessário para a incubação pode ser ligeiramente maior do que aquele para o anticorpo primário, se o secundário é armazenado como uma solução de glicerol (40 mL por 25 lamela mm, 30 mL por 18 lamela mm, 25 mL por 12 lamela mm) . <ul><li> Nota: Se você estiver usando moléculas fluorescentes para visualizar o anticorpo secundário, a amostra precisa ser protegido da luz uma vez que o anticorpo secundário foi adicionado. Incubar no escuro, ou em uma placa de alumínio coberta. </li></ul></li><li> Remova cuidadosamente as lamelas das parafilme como descrito para o anticorpo primário. Lave as células duas vezes com PBS, 5 minutos cada tempo, seguido por um 1 minuto de incubação de 2 mg / ml nuclear Hoechst mancha diluído em PBS (se um contracorante nuclear é o preferido). Se a mancha é antiga Hoechst eo sinal é muito fraca, você pode aumentar o tempo de incubação e / ou a concentração. Após a incubação com Hoechst, lave uma vez com PBS por 5 minutos. </li><li> As lamelas deve ser montado em um slide com meios de montagem para a visualização em um microscópio. Nos casos em que uma molécula fluorescente é utilizado para visualização do anticorpo secundário, a meios de montagem deve conter agentes para minimizar fotobranqueamento. Usamos Vectashield como uma mídia de montagem para fluorescência. Coloque uma gota de tamanho adequado Vectashield numa lâmina de microscópio (12 mL por 25 lamela mm, 6 mL por 18 lamela mm, 3 mL por 12 lamela mm). </li><li> Com cuidado, pegue a lamínula e lavar as costas com água deionizada para remover os sais (a partir da PBS). Dab o excesso de água em um kimwipe ou toalha de papel, e se lançou a gota de Vectashield com células virada para baixo. Coloque a lamínula sobre em um ângulo e permitir a descer lentamente para evitar bolhas de retenção de ar. Rótulo o slide com a data e as informações da amostra. </li><li> Permitir slides com lamínulas para secar (no escuro) de sucção, em seguida, o excesso de off Vectashield em torno da borda da lamínula. As bordas da lamínula agora pode ser selada com unha polonês, se desejar (especialmente útil se lamínulas serão visualizadas em um microscópio invertido). Costumamos salvar nossos slides em um freezer -20 C °. </li></ol>

<ol><li>Flanagan, L. A., Chou, J., Falet, H., Neujahr, R., Hartwig, J. H., Stossel, T. P., Filamin, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Filamin+A%2C+the+Arp2%2F3+complex%2C+and+the+morphology+and+function+of+cortical+actin+filaments+in+human+melanoma+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Filamin A, the Arp2/3 complex, and the morphology and function of cortical actin filaments in human melanoma cells.</a> J. Cell Biol. 155, 511-518 (2001).</li>
<li>Flanagan, L. A., Rebaza, L. M., Derzic, S., Schwartz, P. H., Monuki, E. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+human+neural+precursor+cells+by+laminin+and+integrins%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci.+Res%22%5BJournal%5D)">Regulation of human neural precursor cells by laminin and integrins.</a> J. Neurosci. Res. 83, 845-856 (2006).</li>
<li>Flanagan, L. A., Ziaeian, B., Palmer, T., Schwartz, P. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immunocytochemical+analysis+of+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22In+Human+Stem+Cell+Manual%3A+A+Laboratory+Guide%22%5BJournal%5D)">Immunocytochemical analysis of stem cells.</a> In Human Stem Cell Manual: A Laboratory Guide. Loring, J. F., Wesselschmidt, R. W., Schwartz, P. H. , Elsevier/Cell Press. (2007).</li>
<li>Marchenko, S., Flanagan, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Passaging+Human+Neural+Stem+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Passaging Human Neural Stem Cells.</a> Journal of Visualized Experiments. 7, (2007).</li>
<li>Marchenko, S., Flanagan, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Counting+Human+Neural+Stem+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Counting Human Neural Stem Cells.</a> Journal of Visualized Experiments. 7, (2007).</li>
</ol>

Este protocolo descreve um procedimento de imunomarcação para hNSPCs que minimiza o volume de anticorpos necessário e dá coloração celular confiável. O procedimento descrito é o melhor para os antígenos intracelulares, mas podem ser modificados para mancha moléculas de superfície celular ou para melhorar a coloração do citoesqueleto.

<table><tbody><tr><td>Lâminas de vidro alemã (Deutsche Spiegelglas)</td><td>Ferramenta</td><td>Carolina Biological</td><td>WW-63-3029</td><td>Lâminas de 12, 15, 18, 22 e 25 mm disponíveis</td></tr><tr><td>Detergente livre de fosfato Liquinox</td><td>Reagente</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Z273279</td><td>muito viscoso</td></tr><tr><td>Poli-D-lisina hidrobrometo</td><td>Reagente</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P7280</td><td></td></tr><tr><td>Laminina, natural de camundongo</td><td>Reagente</td><td>Invitrogen</td><td>23017-015</td><td></td></tr><tr><td>EMEM (1X)</td><td>Reagente</td><td>Mediatech, Inc.</td><td>MT-10-010-CV</td><td>Distribuído pela Fisher com o número de catálogo indicado</td></tr><tr><td>Placa de 24 poços</td><td>Ferramenta</td><td>Fisher Scientific</td><td>08-772-1</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Reagente</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP151-500</td><td>muito viscoso</td></tr><tr><td>Paraformaldeído</td><td>Reagente</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P6148</td><td>potencial carcinógeno, use cautela ao manipulá-lo na forma de pó e solução</td></tr><tr><td>Albumina sérica bovina, livre de IgG</td><td>Reagente</td><td>Jackson ImmunoResearch</td><td>001-000-161</td><td></td></tr><tr><td>H&amp;#8211;chst 33342</td><td>Reagente</td><td>Invitrogen</td><td>H-1399</td><td></td></tr><tr><td>Vectashield</td><td>Reagente</td><td>Vector Laboratories</td><td>H-1000</td><td>viscoso</td></tr></tbody></table>

imunocitoquímica: células-tronco neurais

Immunocytochemistry: Human Neural Stem Cells

Imunocitoquímica é um método muito poderoso e bastante simples para determinar a presença, localização subcelular e abundância relativa de um antígeno de interesse, geralmente uma proteína, em células em cultura. Este protocolo apresenta um fácil de seguir série de passos que vai permitir aos investigadores para conservar anticorpos primário e secundário ao obter alta qualidade, reprodutíveis e qualitativa de dados quantitativos de sua coloração. Há dois aspectos deste protocolo, que contribuirá para a conservação do volume de anticorpos necessário para a coloração. Por um lado, as células são cultivadas em pequenas, lamínulas circulares que são colocados em poços de uma placa de cultura de tecidos. Após a fixação, as células em lamínulas podem ser removidos dos poços da placa. Para a coloração de anticorpos, as lamelas com células é invertido em uma pequena gota de solução anticorpo em parafilme e é coberta com um segundo pedaço de parafilme para evitar a secagem. Usando este método, apenas ~ 25 ml de solução de anticorpo é necessária para cada lamela (ou amostra) a ser manchada. Este protocolo descreve imunocoloração de-tronco neurais humanas / precursor células (hNSPCs), mas pode ser usado para muitos outros tipos celulares.

Imunocitoquímica é um poderoso método para determinar a presença, localização subcelular e abundância relativa de um antígeno de interesse em células em cultura. Este protocolo apresenta um fácil de seguir série de medidas que permitirão uma anticorpos para conservar e tirar o máximo proveito da própria coloração.

Imunocitoquímica: células-tronco neurais

A imunocitoquímica é um método muito poderoso e relativamente simples para determinar a presença, a localização subcelular e a abundância relativa de...

Olá, sou Steve. Eu trabalho no laboratório do Dr. Flanagan no Departamento de Patologia da UC, Irvine. E hoje vou mostrar como fazer imunoquímica de células precursoras neurais humanas.Este protocolo inclui colocar células em lamínulas revestidas e bloquear e incubar células em anticorpos primários durante a noite e, em seguida, fazer vários was e colocar anticorpos secundários e em temperatura ambiente. E, finalmente, a montagem das lamínulas de cobertura em vôos de microscópios. Vamos começar.Então, primeiro vou colocar três lamínulas de vidro alemão estéreis com 12 milímetros de diâmetro em uma placa de 24 poços para revesti-las com laminado. Agora eu tenho minhas lamínulas na placa e, primeiro, vou adicionar uma solução de polilisina PDL e incubar as substituições de cobertura em PDL por cinco minutos em temperatura ambiente. Então, agora, ao final de cinco minutos, vou remover o PDL e colocar laminina, e vou incubar as lamínulas em laminado por pelo menos quatro horas ou mais durante a noite.Então, incubei a placa durante a noite em laminado e agora vou enxaguar as lamínulas com PBS e células precursoras neurais humanas que já contei. Então, acabei de remover as soluções lamin

immunocytochemistry-human-neural-stem-cells

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Suspensão coloração imunocitoquímica de células-tronco pluripotentes humanas (hPSCs) para marcadores da superfície celular (SSEA-3/SSEA-4) foi alcançada com base na utilização de um aparelho cytospin self-made para criar uma monocamada de células para observação e quantificação.

Análise imunocitoquímica de células-tronco humanas pluripotentes usando um Self-Made Aparelho Cytospin

Este protocolo vídeo demonstra como discriminar e enumerar bona fide células-tronco neurais em uma população mista de células precursoras neurais utilizando o ensaio de célula neural formadoras de colônias.

Neurais Colony-Forming Assay Cell: um ensaio para Discriminar Bona Fide células-tronco neurais de células progenitoras neurais

Este vídeo demonstra o procedimento para colorir células-tronco neurais recém-proliferadas em seções de tecido cerebral usando incorporação de EdU, seguida de imunofluorescência para visualizar proteínas específicas, melhorando a compreensão da dinâmica e proliferação celular.

Coloração por imunofluorescência para visualização de células-tronco neurais proliferadas em seções cerebrais de camundongos

Fonte: Becker-Kojić, Z. A., et. al., Geração Livre de GM de Células Neuronais Derivadas do Sangue. J. Vis. Exp. (2021)O vídeo demonstra um protocolo para preparar células neurais derivadas de células do sangue periférico reprogramadas para microscopia de fluorescência, mostrando diferentes tipos de células e estágios de desenvolvimento por meio de imagens de imunofluorescência.

Microscopia de Imunofluorescência de Células Neurais Diferenciadas de Células Derivadas do Sangue Periférico 

Células-tronco neurais colhidas a partir do cérebro de adultos estão aumentando utilizado em aplicações que vão desde a pesquisa básica do desenvolvimento do sistema nervoso para explorar potenciais aplicações clínicas em medicina regenerativa. Isso faz com que o controle rigoroso das condições de isolamento e cultivo utilizados para cultivar essas células críticas a soar os resultados experimentais.

Crescer a partir de células-tronco neurais convencionais e não convencionais Regiões do cérebro adulto de roedores

Fornecemos uma descrição detalhada de um protocolo para análise de citometria de fluxo de antígenos de superfície e/ou antígenos intracelulares em tipos de células neurais. Aspectos críticos do planejamento experimental, procedimentos metodológicos passo a passo e princípios fundamentais da citometria de fluxo são explicados para permitir que os neurobiólogos explorem essa poderosa tecnologia.

Citometria de Fluxo protocolos para a superfície e intracelular Antigen análises de tipos de células neurais

Foi desenvolvido um método para derivar directamente células estaminais neurais humanos a partir de células progenitoras hematopoiéticas enriquecidas de células do sangue periférico.

Indução direta de Neurais Human células-tronco de sangue periférico células progenitoras hematopoéticas

células-tronco neurais (NCCC) referem-se a células que podem auto-renovar e diferenciar em três linhagens neurais. Aqui, descrevemos um protocolo para determinar a freqüência NSC em uma população de células determinado usando neurosphere formação e diferenciação em condições clonais.

Enumeração de células-tronco neurais Usando clonais Ensaios

Este protocolo demonstra as metodologias para um modelo do rato do ferimento de cérebro traumático do abrir-crânio e a transplantação de pilhas células-derivadas pluripotentes induzidas humanas cultivadas no local da lesão. Os testes comportamentais e histologic dos resultados destes procedimentos são descritos igualmente em breve.

Modelo de impacto cortical controlado da lesão cerebral do rato com transplantação terapêutica de células neurais pluripotentes induzidas humanas da pilha de haste

Apresentado aqui é um protocolo para a geração de uma cultura unicelular de células-tronco embrionárias humanas e sua diferenciação subseqüente em células progenitoras neurais. O protocolo é simples, robusto, escalável e adequado para rastreamento de medicamentos e aplicações de medicina regenerativa.

Diferenciação neural eficiente usando a cultura unicelular de células-tronco embrionárias humanas

Este protocolo descreve estratégias para identificar e enriquecer o estado celular em culturas primárias de células-tronco neurais de camundongos adultos por imagem de autofluorescência usando i) um microscópio confocal, ii) um classificador de células ativadas fluorescentes para realizar imagens de intensidade ou iii) um microscópio multifotônico para realizar imagens de fluorescência ao longo da vida.

Classificação do estado de ativação de células-tronco neurais in vitro usando autofluorescência

Aprenda a técnica de imunocitoquímica para análise de células-tronco neurais humanas. Este protocolo otimizado demonstra marcação de antígenos com eficiência e economia de anticorpos.

Imunocitoquímica: células-tronco neurais

Explorar mais vídeos