A β-glucuronidase (GUS) Ensaio Baseado Morte celular

O objetivo geral deste procedimento é usar um sistema repórter Gus para analisar as propriedades potenciais de morte de genes específicos. Os genes de interesse são clonados em um Gus e cultivados nos vetores agrobacterium apropriados sob um promotor de 35 s. Esses vetores são então transformados em cepa de Agrobacterium, LBA 44 0 4, e são misturados com uma cultura contendo um de expressão Gus para se infiltrar nas folhas de Nick Oceana Hamana.

A atividade de Gus pode ser avaliada visualmente por coloração histoquímica ou quantitativamente pelo ensaio de caneca métrica de flúor. A principal vantagem desta técnica sobre os métodos existentes, como escada de DNA ou ensaio de túnel, é comumente usada em sistemas de mamíferos, mas difícil de reproduzir em plantas, é que este é um ensaio transitório sensível e rápido baseado em plantas que aproveita o simples fato de que as células vivas são necessárias para que a expressão do gás ocorra. Demonstrando o procedimento hoje estarão Hua RAOs.

Um pesquisador associado de pós-doutorado em nosso laboratório A infiltração requer folhas saudáveis totalmente expandidas de plantas nicotiana hamana de três a seis semanas cultivadas a 25 graus Celsius. Planeje realizar este protocolo ao longo de oito dias. No primeiro dia, grelhas de sequência com estoques de glicerol de agrobacterium tumor fassan contendo os vetores para o ensaio de morte celular e o vetor com o de expressão Gus também sempre incluem um vetor vazio como controle negativo ou stuffer quando várias combinações de cultura estão sendo testadas.

Incube as placas a 28 graus Celsius por dois dias. No terceiro dia, inocular dois mililitros de LB seletivo com uma única colônia de cada placa. Incubar cada cultura agitando a 28 graus Celsius por 24 horas a 200 RPM até atingir a densidade máxima de crescimento.

Após 24 horas de incubação, ressuspender completamente a cultura pipetando, se houver aglomeração, e aumentar o volume total de cada cultura para 10 mililitros com LB seletivo fresco para induzir genes de virulência de agrobacterium. Adicione acetona a 25 micromolares e incube cada cultura com agitação a 28 graus Celsius por mais 16 horas. O próximo passo é centrifugar cada cultura a 4.000 Gs por 10 minutos em temperatura ambiente e Resus, suspender o pellet em 10 mililitros de meio de infiltração.

Não adicione acetona, centrifugue as culturas novamente, mas agora Resus. Suspenda cada pellet em cinco mililitros de meio de infiltração contendo 100 acetona micromolar. Agora meça o OD em 600 nanômetros.

Concentrações tão baixas quanto 0,1 são aceitáveis, mas se forem maiores que 0,9, dilua para 0,9 com infiltração, meio e acetona antes da infiltração. Incubar as culturas mais uma vez a 28 graus Celsius com agitação por três horas após a incubação. Misture as culturas experimentais e as culturas de controle na proporção de um para um com a cultura que contém o Gus.

Para cada cultura, use uma seringa sem agulha de um mililitro para se infiltrar no selo ABA ou na parte inferior das folhas recém-emergentes. O volume de infiltração não é importante. Quando uma área de imersão em água se formar o suficiente tiver sido adicionada, infiltre o controle negativo e o gene a ser testado em folhas opostas na mesma planta e, em seguida, infiltre mais duas plantas da mesma maneira.

Portanto, existem plantas triplicadas para cada cultura. Três dias após a infiltração, é hora de coletar as folhas e testar a expressão da proteína gust. Comece a análise histoquímica infiltrando a vácuo toda a folha com substrato xlu até que esteja completamente encharcada.

Agora, incube as folhas na escuridão em temperatura ambiente durante a noite ou até que uma coloração azul distinta apareça quando a coloração azul for evidente. Lave as folhas em água destilada e incube-as em etanol a 70% durante a noite até que a clorofila seja removida. No dia seguinte, enxágue as folhas e a água destilada e avalie os níveis de expressão de GUS.

Para quantificar a expressão de Gus, uma caneca de substrato é convertida em um produto fluorescente mu, que pode ser medido começando pela moagem de discos de folhas infiltradas em uma argamassa usando nitrogênio líquido. Em seguida, adicione 100 microlitros de tampão de extração GUS, mantendo a amostra no gelo. Agora centrifugue a suspensão a 14.000 GS por cinco minutos a quatro graus Celsius e colete o sobrenadante contendo as proteínas solúveis totais, que inclui Gus.

Meça a concentração total de proteína solúvel usando um NanoDrop e ajuste a concentração para 100 microgramas de proteína total para cada amostra no tampão de extração Gus. Agora, adicione substrato de caneca no tampão de extração Gus a cada amostra até uma concentração final de dois milimolares caneca. Um volume total de 100 microlitros por amostra deve ser suficiente misturado por pipetagem e incubar a reação por uma hora a 37 graus Celsius.

Após uma hora, pare a reação adicionando 800 microlitros de rajadas de tampão de parada. Para quantificar o mu, 100 microlitros de cada amostra são carregados em uma placa de microtitulação, que é analisada em um leitor de placas, fluorescência a 365 nanômetros de excitação, 455 nanômetros de comprimentos de onda de emissão são medidos e, em comparação com uma curva padrão, a atividade de Guss pode então ser relatada como M de mu por micrograma de proteína solúvel total por minuto de reação. Vários níveis de rajada são detectados dependendo da construção usada quando o de expressão GUS é co-infiltrado com um regulador negativo de morte celular ou um gene anti-morte.

Altos níveis de rajadas são observados em comparação. Os níveis de Gus no controle vetorial vazio são muito mais baixos. Por outro lado, quando um regulador positivo de morte celular ou um gene pró-morte é usado, uma redução de mercado na expressão de Gus é observada em comparação com o controle de vetor vazio.

Uma vez dominada, essa técnica pode ser feita em aproximadamente uma semana. Ao tentar este procedimento, é importante lembrar que esta técnica é usada como um passo inicial para determinar o potencial de genes específicos. Trabalho adicional precisa ser feito para confirmar esses resultados iniciais e determinar o tipo de célula envolvida.