Name: Glicanos imagem em embriões Zebrafish por Labeling Metabólica e Química Clique Bioorthogonal (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-06-06T15:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 46 s
Description: Aprenda a rotular glicanos em embriões de zebrafish usando química de clique bioortogonal. Este método permite imagem dinâmica in vivo de glicanos fucosilados durante o desenvolvimento embrionário.

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Este trabalho foi parcialmente financiado pelo National Institutes of Health (GM093282 para PW; 3U54AI057158-06S1 a RDS) e fundos de inicialização do Albert Einstein College of Medicine.

1. Coleta de ovos e Dechorionation <ol><li> Coletar e transferir os ovos zebrafish a 35mm placa de Petri, remova tanta água quanto possível e então adicione 1 E Pronease mg / ml em meio embrião E3 (5 mM NaCl, 0,17 mM KCl, 0,33 mM CaCl 2 · 2H 2 O, 0,33 mM MgSO 4, pH = 7,4) para digerir o córion. </li><li> Depois de 3-5 minutos, fundir o prato em um copo cheio de água de peixe (60 mg "Ocean instantânea" por litro destilada H 2 O), e gentilmente transferir os ovos para o copo e deixe os ovos para "cair" na água. </li><li> Lave os ovos com peixes de água três vezes. A maioria dos ovos serão liberados de suas córion. </li><li> Usando um fogo-de vidro polido Pasteur pipeta, transferir os ovos para dechorionated pratos agarose revestidas de petri preenchida com meio embrião E3. </li></ol> 2. Microinjeção com o PIB-FucAl <ol><li> Prepare os pratos injeção seguindo o protocolo relatados 7. </li><li> Transferência de ovos dechorionated em pratos cheios de injeção médio embrião E3. </li><li> Preparar a agulha, e carregar com 2 mL de solução de injeção. Esta solução contém 20 mM PIB FucAl sintetizado chemoenzymatically 8 e tanto Alexa Fluor 594-dextran (5% w / v) como um marcador ou corante vermelho de fenol de carga (0,1% w / v) em 0,2 M KCl. Como controle negativo, substitua-FucAl PIB com o PIB-fucose em solução de injeção. </li><li> Quebrar a agulha e ajustar a pressão de injeção e duração para produzir um 1 gota nL 9. </li><li> Injetar os ovos com 1 nL de uma solução. </li><li> Transferir os ovos em pratos agarose revestidas de petri preenchida com meio embrião E3. </li><li> Incubar os ovos a 28 ° C e remover os ovos não fertilizados dentro de três a quatro horas após a fertilização. </li></ol> 3. BTTES-Cu (I)-Reacção catalisada Clique Química <ol><li> Quando os embriões atingem desejado estágios de desenvolvimento (estádio atrasado, por exemplo, a segmentação dos tecidos e larva precoce), revestimento a base de uma placa de 96 poços com agarose. </li><li> Adicionar 92 mL de médio embrião E3 a cada poço, seguido por adição de 4 Alexa Fluor-488 mL de azida (a partir de um estoque de 2,5 mM em H 2 O), 2 mL BTTES-CuSO 4 06:01 complexo, e agitar suavemente para misturar. </li><li> Transferência de embriões no poço contendo o reagente química do clique utilizando um fogo-de vidro polido Pasteur pipeta. Cada poço deve conter menos de cinco embriões. </li><li> Adicionar 2,5 mL de ascorbato de sódio preparada na hora (de um estoque de 100 mm em H 2 O) para iniciar a reação clique em 3. Concentração final de cada reagente: Alexa Fluor azida-488: 100 mm; CuSO 4: 50 mM; BTTES: 300 mM; ascorbato de sódio: 2,5 mM. </li><li> Após 3 min, adicionar 2 mL bathocuproine sulfonato (50 mM de ações em H 2 O), um quelante de cobre biocompatível, para saciar a reação imediatamente, diluir com 100 mL de médio E3 embrião. </li><li> Transferência dos embriões para uma placa de Petri de vidro e lave os embriões tratados duas vezes com 15 mL de médio embrião E3. </li></ol> 4. Imagem <ol><li> Coloque uma gota de ultralow ponto de fusão agarose (1,2% (w / v) em meio embrião E3) em um copo prato fundo Mattek micropoços, e colocar um embrião para a queda de agarose. </li><li> Posição dos embriões dorsalmente ou lateralmente e colocar o prato no gelo por 5 min para solidificar a queda de agarose. Adicionar médio embrião E3 suavemente para o prato até cobrir a queda de agarose. </li><li> Imagens de fluorescência de campo e brilhantes são adquiridas seqüencialmente usando um microscópio confocal. Todas as imagens de embriões são adquiridos utilizando um intervalo de passo 5 mm. Figuras compostas são preparadas usando software ImageJ. </li></ol> 5. Resultados representante A Figura 1 mostra o fluxo de trabalho da nossa estratégia de rotulagem em duas etapas. A Figura 2 mostra a rotulagem de embriões zebrafish via BTTES mediada CuAAC em 9,5 horas pós-fertilização (hpf). BTTES é um tris (triazolylmethyl) ligand amina-based. Ele acelera drasticamente quando CuAAC coordenação com o in situ Cu gerado (I), e promove a reação de cicloadição rapidamente em sistemas vivos sem toxicidade aparente. Imediatamente após uma reação clique em 3-min, que são capazes de detectar etiquetagem robusta dos embriões PIB FucAl tratadas (Figura 2, os painéis à esquerda). Fluorescência de fundo só é detectado para controle de embriões microinjeções PIB-fucose (Figura 2, os painéis à direita). <img src="/files/ftp_upload/2686/2686fig1.jpg" alt="Figura 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 1"> Figura 1. A estratégia de rotulagem glicanos fucosylated na camada envolvente de embriões zebrafish. <img src="/files/ftp_upload/2686/2686fig2.jpg" alt="Figura 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 2"> Figura 2. Na geração de imagens in vivo de glicanos fucosylated durante a embriogênese zebrafish via BTTES-Cu (I)-catalisada química do clique. Uma célula-embriões zebrafish estágio são microinjeção com uma dose única do PIB-FucAl e permitiu a develop para 9,5 hpf. Os embriões são, então, reagiu com Alexa Fluor 488 azida-catalisada pela BTTES-Cu (I). Embriões reagiu são gravadas através de microscopia confocal. Máxima intensidade z projeção de imagens de Alexa Fluor 488 fluorescência (painel superior); campo Bright (painel inferior). Barra de escala: 100 mm. Solução de problemas <table border="1"><tbody><tr><td> Problema </td><td> Causa </td><td> Remédio </td></tr><tr><td> Os embriões olhar insalubres </td><td> A solução microinjeção contém contaminantes </td><td> A pureza dos açúcares nucleotídeos deverá ser superior a 85%. Verifique a sua fonte. </td></tr><tr><td> Não há rotulagem após a reação </td><td> Concentração de cobre é inferior a 30 mM </td><td> Tenha cuidado para não diluir a solução reacção adicionando médio de embriões em excesso E3 ao adicionar os embriões, como a velocidade da reação diminui significativamente quando a concentração de cobre é abaixo de 30 mM. </td></tr><tr><td> Os embriões morrem após a reação </td><td> Manuseio inadequado dos embriões </td><td> Verifique se a pipeta é fogo-polido eo vaso de reação é revestido com uma camada muito fina de agarose 0,5%. </td></tr><tr><td> As imagens parecem irregular </td><td> Os reagentes não são devidamente misturados antes de acrescentar os embriões </td><td> Seguir a ordem recomendada de adição para os reagentes, e certifique-se que os reagentes química do clique foram devidamente misturados antes de acrescentar os embriões. </td></tr><tr><td> As imagens mostram os embriões sejam danificados </td><td> Agitação vigorosa danos os embriões durante a reação </td><td> Agite suavemente para menos de 10 segundos, uma vez que os embriões são a solução. </td></tr><tr><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

<ol><li>Laughlin, S. T., Bertozzi, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+the+glycome%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.+S.+A%22%5BJournal%5D)">Imaging the glycome.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 106, 12-17 (2009).</li>
<li>Baskin, J. M., Bertozzi, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bioorthogonal+click+chemistry%3A+Covalent+labeling+in+living+systems%5BTitle%5D)+AND+%22Qsar+Comb.+Sci%22%5BJournal%5D)">Bioorthogonal click chemistry: Covalent labeling in living systems.</a> Qsar Comb. Sci. 26, 1211-1219 (2007).</li>
<li>Soriano del Amo, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biocompatible+copper%28I%29+catalysts+for+in+vivo+imaging+of+glycans%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Am.+Chem.+Soc%22%5BJournal%5D)">Biocompatible copper(I) catalysts for in vivo imaging of glycans.</a> J. Am. Chem. Soc. 132, 16893-16899 (2010).</li>
<li>Chang, P. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Metabolic+labeling+of+sialic+acids+in+living+animals+with+alkynyl+sugars%5BTitle%5D)+AND+%22Angew.+Chem.+Int.+Ed%22%5BJournal%5D)">Metabolic labeling of sialic acids in living animals with alkynyl sugars.</a> Angew. Chem. Int. Ed. 48, 4030-4033 (2009).</li>
<li>Laughlin, S. T., Baskin, J. M., Amacher, S. L., Bertozzi, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+imaging+of+membrane-associated+glycans+in+developing+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">In vivo imaging of membrane-associated glycans in developing zebrafish.</a> Science. 320, 664-667 (2008).</li>
<li>Baskin, J. M., Dehnert, K. W., Laughlin, S. T., Amacher, S. L., Bertozzi, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visualizing+enveloping+layer+glycans+during+zebrafish+early+embryogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.+S.+A%22%5BJournal%5D)">Visualizing enveloping layer glycans during zebrafish early embryogenesis.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 107, 10360-10365 (2010).</li>
<li>Kemp, H. A., Carmany-Rampey, A., Moens, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generating+chimeric+zebrafish+embryos+by+transplantation%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Generating chimeric zebrafish embryos by transplantation.</a> J. Vis. Exp. , (2009).</li>
<li>Wang, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chemoenzymatic+synthesis+of+GDP-L-fucose+and+the+Lewis+X+glycan+derivatives%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.+S.+A%22%5BJournal%5D)">Chemoenzymatic synthesis of GDP-L-fucose and the Lewis X glycan derivatives.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 106, 16096-16101 (2009).</li>
<li>Rosen, J. N., Sweeney, M. F., Mably, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microinjection+of+zebrafish+embryos+to+analyze+gene+function%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Microinjection of zebrafish embryos to analyze gene function.</a> J. Vis. Exp. , (2009).</li>
<li>Westerfield, M. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aWesterfield%2C+M+%22THE+ZEBRAFISH+BOOK%2C+A+guide+for+the+laboratory+use+of+zebrafish+%28Danio+rerio%29%22">THE ZEBRAFISH BOOK, A guide for the laboratory use of zebrafish (Danio rerio)</a>. , 5th Edition, University of Oregon Press. Eugene. (2007).</li>
<li>Kimmel, C. B., Warga, R. M., Schilling, T. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Origin+and+organization+of+the+zebrafish+fate+map%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Origin and organization of the zebrafish fate map.</a> Development. 108, 581-594 (1990).</li>
</ol>

Não há conflitos de interesse declarados.

<p class="jove_content"&gt; Biomoléculas de imagem<em&gt; In vivo</em&gt; Fornece uma visão crítica de suas atividades biológicas em seus ambientes nativos. Neste vídeo, demonstramos como a rotulagem dos glicanos fucosylated na camada envolvente de embriões zebrafish é realizado por microinjecting embriões de uma célula palco com PIB FucAl e uma conjugação fluoróforo segunda etapa via BTTES mediada CuAAC biocompatível<sup&gt; 3</sup&gt;. Etiquetagem robusta pode ser conseguido dentro de 2-3 minutos, e os glicanos rotulados são detectáveis ​​log...

<table border="1"><tbody><tr><td> Nome do reagente </td><td> Companhia </td><td> Número de catálogo </td></tr><tr><td> Cobre pentahidratado sulfato (II) </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> 203165 </td></tr><tr><td> Alexa Fluor 488 azida </td><td> Invitrogen </td><td> A10266 </td></tr><tr><td> dextran, Alexa Fluor 594 </td><td> Invitrogen </td><td> D-22913 </td></tr><tr><td> (+) De sódio-L-ascorbato </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> A7631 </td></tr><tr><td> Bathocuproinedisulfonic ácido </td><td> Acros Organics </td><td> 164060010 </td></tr><tr><td> Prato fundo de vidro micropoços </td><td> Mattek </td><td> P35G-1.5-14-C </td></tr></tbody></table>

glicanos imagem em embriões zebrafish por labeling metabólica e química clique bioorthogonal

Imaging Glycans in Zebrafish Embryos by Metabolic Labeling and Bioorthogonal Click Chemistry

Glicanos de imagem in vivo foi recentemente ativado usando uma estratégia repórter bioorthogonal química por tratar células ou organismos com azida ou alcino marcadas monossacarídeos 1, 2. Os monossacarídeos modificado, processados ​​pela máquina biossintética glicano, são incorporados glicoconjugados de superfície celular. As tags bioorthogonal azida ou alcino então permitir a conjugação covalente com sondas fluorescentes para a visualização, ou afinidade com sondas para o enriquecimento e análise glycoproteomic. Este protocolo descreve os procedimentos normalmente utilizados para imagem não invasivos de glicanos fucosylated em embriões de peixe-zebra, incluindo: 1) microinjeção de um celular em embriões em estágio com o PIB-5-alkynylfucose (PIB FucAl), 2) rotulagem glicanos fucosylated na camada envolvente de embriões zebrafish com azida conjugada fluoróforos via Cu biocompatível (I)-catalisada cicloadição azida-alcino (CuAAC), e 3) de imagens por microscopia confocal 3. O método descrito aqui pode ser facilmente estendido para visualizar as outras classes de glicanos, glicanos por exemplo, contendo ácido siálico 4 e N-acetilgalactosamina 5, 6, em zebrafish em desenvolvimento e em outros organismos vivos.

Um método baseado em clique química que permite a rotulagem, rápida não invasiva, e robusta de alcino com tags glicanos em embriões de peixe-zebra é descrito. Glicanos Fucosylated na camada envolvente de embriões zebrafish na fase final de gastrulação foram fotografadas neste estudo.

Glicanos imagem em embriões Zebrafish por Labeling Metabólica e Química Clique Bioorthogonal

A imagem de glicanos in vivo tornou-se recentemente possível utilizando uma estratégia de repórter químico bioortogonal, tratando células ou organismos com azida ou...

A demonstração recente de imagem in vivo de glicanos utiliza uma estratégia de marcador químico bioortogonal que consiste em tratar células ou organismos com monossacarídeos marcados com alcino ou azida. Os monossacarídeos modificados, processados pela maquinaria biossintética de glicanos, são incorporados aos glicoconjugados da superfície celular, exibindo marcas bioortogonais de alcino ou azida. Isso permite então a conjugação covalente com sondas fluorescentes para visualização ou com sondas de afinidade para enriquecimento e análise glicoproteômica.Este método baseado em química click permite a marcação rápida, não invasiva e robusta de glicanos alquinos ou azidos em embriões de peixe-zebra e pode ser facilmente estendido para visualizar outras classes de glicanos em organismos em desenvolvimento. A principal vantagem desta técnica em relação a métodos existentes, como a detecção de glicanos baseada em lectinas ou anticorpos, é que ela pode ser aplicada à imagem dinâmica in vivo. Os métodos de imagem baseados em lectinas ou anticorpos fornecem apenas um instantâneo dos glicanos em um determinado momento.Eles são difíceis de implementar no contexto de estudos dinâmicos. Além dis

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Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Relata-se o desenvolvimento de um sistema automatizado para geração de imagens e análise de zebrafish embriões transgênicos em placas de vários poços. Isso demonstra a capacidade de medir os efeitos dose-dependente de uma pequena molécula, BCI, na expressão do gene Fator de Crescimento de Fibroblastos repórter e fornecer tecnologia para o estabelecimento de high-throughput telas química zebrafish.

Desenvolvimento de imagem automatizada e análise química para as telas de zebrafish.

Chave para a compreensão dos processos morfogenéticos que forma o embrião precoce é a capacidade de células de imagem em alta resolução. Descrevemos aqui uma técnica para a rotulagem células isoladas ou pequenos aglomerados de células em embriões de peixe-zebra inteira com membrana-alvo Proteína Fluorescente Verde.

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Um ensaio de captação de anticorpos para sinalização de entalhe / DeltaD de imagem em progenitores de glia radial de peixe-zebra

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Monte Preparação Plano de observação e análise de amostras de embriões Zebrafish manchado por inteiro Monte<em&gt; Em situ</em&gt; Hibridização

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Visualização da Sialilação Intracelular com Química Click e Microscopia de Expansão

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Marcação de fluorescência para visualizar proteínas de baixa expressão em peixe-zebra

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Dois fótons axotomia e lapso de tempo de imagem confocal em embriões de peixe-zebra ao vivo

Aprenda a rotular glicanos em embriões de zebrafish usando química de clique bioortogonal. Este método permite imagem dinâmica in vivo de glicanos fucosilados durante o desenvolvimento embrionário.

Glicanos imagem em embriões Zebrafish por Labeling Metabólica e Química Clique Bioorthogonal

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