Imagens de alta resolução em 3D de Ex-Vivo Amostras Biológicas por Micro CT

Não-destrutivos visualização volumétrica só pode ser alcançada através de técnicas de tomografia, dos quais o mais eficiente é o x-ray tomografia micro computadorizada (TC).

O objetivo geral deste procedimento é realizar microtomografia de raios-x 3D de tecidos mineralizados e não mineralizados. Isso é feito primeiro extraindo as amostras a serem examinadas, depois imobilizando e posicionando as amostras no instrumento de micro CT. A terceira etapa do procedimento é definir parâmetros de aquisição para cada amostra e coletar as imagens.

Por fim, é obtida uma imagem 3D da amostra em alta resolução por meio de tomografia computadorizada de raios-x. A principal vantagem desta técnica de nossas metodologias existentes, como ressonância magnética, ultrassom ou microscopia eletrônica, é que ela fornece informações sobre volumes de carrapatos com resolução de um mícron D. Este método pode fornecer informações sobre muitos tecidos biológicos. Pode ser usado também em eletrônica, ciências dos materiais e arqueologia.

A preparação é diferente para tecidos mineralizados e não mineralizados. Os tecidos mineralizados devem ser selados em recipientes com um ajuste apertado, para que a posição da amostra não mude. Embora sejam feitas medições de alta resolução, a forma do recipiente varia de acordo com a morfologia do tecido.

Por exemplo, um fêmur de camundongo extraído de um embrião de 18,5 D pode caber em uma ponta de pipeta. Comece selando a extremidade estreita de uma ponta de pipeta de poliestireno com cola como resina epóxi. Em seguida, preencha a ponta com um tampão de trabalho.

Neste caso, o PBS agora encaixa a perna com o fêmur exposto firmemente na ponta e coloca a ponta da pipeta em um suporte adequado e sela a outra extremidade com o sacrifício da folha de filme e perfundir o animal conforme descrito no manuscrito que acompanha. Em seguida, extraia os pulmões e o coração manchados e transfira-os para um tubo de ensaio preparado de 50 mililitros. Coloque os órgãos em um pedaço de papel seco.

Coloque as amostras nos tubos de ensaio de medição final na parte inferior do tubo de ensaio é um pano de amortecimento de etanol. Para criar um ambiente saturado de etanol, a amostra deve se encaixar firmemente dentro do tubo. Se a amostra estiver solta, aperte-a com um fio e imobilize-a perto do fundo do tubo logo acima do pano.

Em seguida, cole ou aparafuse o tubo em um suporte do instrumento e prossiga com a configuração da imagem. Parâmetros de aquisição. Comece colocando o suporte de amostra no estágio de rotação do instrumento.

Em seguida, usando valores selecionados arbitrariamente para tensão e corrente, tire uma imagem de raio-x. Se a imagem estiver muito escura. Faça alterações primeiro aumentando gradualmente o número de fótons.

Isso é feito aumentando progressivamente a corrente. Se a imagem não ficar mais brilhante depois de aumentar a corrente para 200 microamperes, faça pequenos aumentos progressivos na energia dos fótons de raios-x aumentando a voltagem. Se a imagem estiver muito brilhante, primeiro diminua a tensão e, em seguida, diminua a corrente até que a imagem seja satisfatória.

Benning também pode ser usado para aumentar o brilho da imagem com o sacrifício da resolução. Um valor de entrada de dois tornará a imagem cerca de quatro vezes mais brilhante com metade da resolução. Depois de definir o brilho ideal, otimize o tempo de exposição da câmera para comprometer o melhor contraste obtido com uma duração razoável do experimento.

O contraste da imagem, especialmente para amostras com alta absorção, pode ser melhorado usando filtros para reduzir o fluxo de fótons de baixa energia. Agora, escolha a ampliação de trabalho entre 0,5 x e 40 x e ajuste o campo de visão para abranger toda a amostra enquanto maximiza a resolução. Para aumentar a resolução, coloque a fonte de raios X mais próxima da amostra.

Para aumentar o campo de view, coloque o detector mais próximo da amostra. Para imagens 3D, a amostra deve caber dentro do campo de visão em qualquer ângulo de rotação, portanto, o eixo de rotação deve ser centralizado. Comece girando a amostra para 20 graus negativos.

Se o volume desejado se deslocou lateralmente, reposicione o eixo de rotação. Prossiga com a captura de imagens em rotações adicionais e continue fazendo correções até que a amostra esteja totalmente visível de 90 a 90 graus positivos, depois prossiga com a medição em todos os ângulos entre 90 e 90 graus negativos. A execução de um programa de imagem pode levar muito tempo, portanto, planeje adequadamente.

Por exemplo, para obter a imagem do maior número de fêmur na ampliação Forex com resolução de oito mícrons, são necessárias 1000 imagens de projeção. Isso leva apenas três horas para ser concluído. No entanto, leva 10 horas para coletar as 2.500 imagens de projeção necessárias para visualizar os pulmões de ratos com ampliação de 0,5x e resolução de 16 mícrons.

Para comparação futura de imagens, é necessário calibrar a imagem tirando imagens de um simulador padrão feito de materiais artificiais que têm absorção de raios-x semelhantes a ossos e água sob as mesmas condições experimentais. Quanto à amostra, após a gravação de todas as imagens de projeção, o volume total é reconstruído. Para calibrar a imagem reconstruída para os valores do fantasma, use o campo hounds ou a escala CT.

Por exemplo, na ampliação Forex, o valor aquoso no fantasma é definido como zero e o valor ósseo é definido como 3000 a partir desse intervalo. Todos os outros valores são interpolados ou extrapolados. As imagens agora podem ser analisadas usando qualquer pacote de software que possa suportar arquivos de 20 gigabytes, como freeware image J ou Fiji.

Esta renderização de volume mostra o fêmur de um camundongo quatro dias após a mineralização óssea ter iniciado a fração mineralizada calculada em 18% e a densidade mineral óssea pode ser comparada aos ossos em outros estágios de desenvolvimento. Esta renderização tomográfica do volume dos pulmões de uma rata nua fêmea de 12 semanas é resolvida para 16 mícrons. A coloração pulmonar é usada para revelar vasos sanguíneos de 20 mícrons de diâmetro.

Nesta análise de seção seriada dos mesmos pulmões. Múltiplos nódulos cancerígenos podem ser vistos como formas cinzentas sólidas dentro de quatro semanas após a implantação de células tumorais. Nesses pulmões, os nódulos cresceram para cobrir 17% do volume dos pulmões.

A maior parte da coloração pulmonar foi encontrada nas áreas periféricas dos tumores. Os vasos sanguíneos também estão presentes dentro dos nódulos, cobrindo cerca de 3% de seu volume. Uma vez dominado, o posicionamento da amostra pode ser feito em 15 a 20 minutos se for realizado corretamente.

O tempo de imagem, incluindo a reconstrução automática do volume, que geralmente não requer a presença de uma pessoa cirúrgica, depende da amostra e pode levar até 50 horas. Não se esqueça de que trabalhar com agentes fixadores e de coloração pode ser extremamente perigoso. Sempre use luvas de laboratório e evite respirar os vapores das amostras.