Name: Imagens de alta resolução em 3D de Ex-Vivo Amostras Biológicas por Micro CT (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-06-21T12:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 57 s
Description: Aprenda a realizar microtomografia computadorizada de raios X para obter imagens 3D de alta resolução de tecidos mineralizados e não mineralizados. Esta técnica não destrutiva permite visualizar volumes espessos com resolução de um mícron.

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Os estudos foram conduzidos no Irving Moskowitz e Cherna Centro de Nano e Nano Bio-Imagem no Instituto Weizmann de Ciência. Somos gratos a Orna Yeger por sua ajuda na concepção e execução deste protocolo.

1. Preparação de amostras <ol><li> Depois de extrair o tecido que está a ser examinado, tecidos mineralizados pode ser posicionado no instrumento e imagens. Para a imagem do fêmur um rato deve seguir os seguintes passos: <ol><li> Remover pós mortem perna de um embrião C57/Bl6 18,5 postceutus dias (E18.5). </li><li> Selar a parte mais estreita de uma ponteira de poliestireno (2-20 mL) usando resina epóxi ou outra cola, e preencha a ponta com o buffer de trabalho (PBS ou outro). </li><li> Encaixar bem a perna na ponta e selar o outro lado com a folha de parafilme. </li><li> Coloque a ponta da pipeta em um suporte adequado e seguir o protocolo do capítulo 3. Para visualizar o fêmur da perna embrião de rato, o instrumento é definido 40 KV e 200 mA. Para 8μ resolução 1000 imagens de projeção com ampliação de 4x tem que ser adquirida. </li></ol></li><li> Não mineralizado tecidos têm de ser inicialmente fixado e corado, a fim de aumentar a atenuação de raios-X do tecido de interesse, usando um dos muitos protocolos disponíveis 8,9. Para os pulmões de ratos e amostras semelhantes, o protocolo de preparação é: <ol><li> Implantação Orthotopical de carcinoma do pulmão de não pequenas células (NSCLC) NCI-H460 em pulmões de ratos nua </li><li> Nódulos de câncer de pulmão passam a ser detectáveis ​​quatro semanas a partir da implantação </li><li> Sacrificar a ratazana e infundi-la imediatamente com soro fisiológico misturado com heparina </li><li> Injetá-lo com uma solução diluída de Microfil (Flowtech), (2 ml de solução composta, 3 ml de diluente e 0,3 ml de agente de cura) para o ventrículo esquerdo para manchar a circulação brônquica </li><li> Extrair os pulmões eo coração do rato </li><li> Imobilizar a amostra (ver capítulo 2 do protocolo) ajustando-o firmemente em um tubo de 50 ml de plástico teste </li><li> Criar uma atmosfera saturada de etanol, colocando no fundo do tubo de um pano embebido em etanol </li><li> Cola ou parafuso em um tubo do detentor do instrumento </li><li> Prosseguir com a definição dos parâmetros de imagem (capítulo 3). Para a imagem completa dos pulmões de ratos a fonte é de 40KV e 100 mA. A fim de alcançar uma resolução 16μ tem de adquirir 2500 imagens de projeção com uma ampliação de 0.5x. </li></ol></li></ol> 2. Imobilização amostra Em alta resolução, é importante evitar qualquer mudança na posição da amostra durante a medição. Para isso, a amostra é firmemente fixada em um recipiente de plástico que se encaixa o seu tamanho. Dicas de poliestireno pipeta, pipetas Pasteur de plástico especialmente construídos ou titulares de plástico são usados ​​a esse respeito. De acordo com os requisitos experimental, a amostra pode ser examinada no ar ou imersos em soluções de etanol ou tampão. Imobilização típicos e posicionamento final da perna do embrião de rato no instrumento é mostrado na Figura 1. <img src="/files/ftp_upload/2688/2688fig1.jpg" alt="Figura 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 1"> Figura 1. Posicionamento final da perna embrionárias de camundongos no instrumento CT micro. 3. Definição de parâmetros de aquisição: x-ray de tensão e corrente, tempo de exposição CCD <ol><li> Colocado em um suporte, a amostra é colocada na fase de rotação do instrumento </li><li> Uma imagem de raio-x primeiro é tomado com a tensão ea corrente arbitrariamente definida. </li><li> Se a imagem está muito escura, deve-se aumentar o número de fótons primeiro lugar, para aumentar um pouco a corrente. Se isso não for suficiente, deve-se aumentar ligeiramente a energia dos fótons de raios-x, ou seja, a tensão no tubo de raios-x. </li><li> Se a imagem é muito brilhante, deve-se primeiro diminuir a tensão, então a corrente. </li><li> O brilho da imagem pode ser aumentada por binning. Binning de 1 leva em conta a intensidade de cada pixel da imagem, enquanto que binning de 2 leva a soma de cada matriz de pixels 2x2. A imagem será de cerca de 4 vezes mais brilhante do que no caso de binning 1, mas terão metade da resolução. </li><li> Depois de definir a luminosidade ideal, é preciso otimizar o tempo de exposição da câmara de compromisso entre o melhor contraste de um lado e uma duração razoável do experimento em outro lado. </li><li> O contraste das imagens, especialmente das amostras de baixa absorção, pode ser melhorada por meio de filtros, que reduzem o fluxo de fótons, principalmente a dos fótons de energia mais baixos. </li></ol> 4. Posicionamento da amostra <ol><li> Escolha a ampliação de trabalho. Escolhas possíveis são 0.5x, 4x, 10x, 20x e 40x. O campo de visão diminui com a ampliação cada vez maior. </li><li> Obter a melhor resolução e campo de visão, definindo as distâncias entre a fonte de raios-X ea amostra e entre a amostra eo detector. Aumentar a fonte de distância da amostra diminui o campo de visão e aumenta a resolução. Amostra com a distância detector tem o efeito oposto. </li></ol> Todo o campo para ser visto em 3D deve estar presente noprojeção de imagem em todos os ângulos. Deve-se verificar esta girando a amostra em diferentes ângulos e por trazer a amostra o mais perto possível do eixo de rotação. Para isso, deve-se seguir os seguintes passos: <ol start="3"><li> Ter uma imagem a 0 graus, e depois girar a amostra a -20 graus. Se o volume desejado mudou lateralmente, deve-se corrigir a sua posição através do reposicionamento do eixo de rotação. </li><li> Após a correção, a amostra deve ser rodado em outro ângulo e posição corrigida novamente, até que o campo de interesse está dentro da imagem em todos os ângulos de -90 a 90 graus. </li></ol> 5. Tomografia de alta resolução <ol><li> Durante a medição, a amostra é girada por um pequeno ângulo em um momento e em cada imagem de projeção um ângulo é tomada. O número total de imagens é sempre um compromisso entre a resolução desejada de um lado e no momento da medição e do tamanho do arquivo em outro lado. Como mostrado na Fig.2, cada única projeção inclui todas as fatias na amostra sobrepostas uma sobre a outra, e, portanto, não pode revelar a estrutura 3D da amostra. </li></ol><img src="/files/ftp_upload/2688/2688fig2.jpg" alt="Figura 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 2"> Figura 2. Projeção de imagens do pulmão de ratos em 0 ° (A), 45 º (B) e 90 ° de ângulo de rotação (C). <ol start="2"><li> Só depois de tomar imagens de projeção, pelo menos, entre -90 e 90 graus, pode-se proceder à reconstrução do volume da amostra. Reconstrução leva entre 10 minutos e 2 horas, dependendo do software utilizado e do número de projeções. Mais uma vez, a qualidade final da imagem em 3D é um compromisso entre a resolução desejada e do tempo que se quer gastar e do tamanho do arquivo resultante. </li></ol> 6. Calibração da escala de imagem O nível de pixel (valor) em uma imagem reconstruída é exclusivo para essa imagem. A fim de comparar duas imagens diferentes, uma escala de intensidade única tem de ser imposta em cada imagem. Para este <ol><li> Executar uma tomografia com um fantasma padrão, utilizando as mesmas condições experimentais, como para a amostra </li><li> Recalibrar a imagem de exemplo usando os valores obtidos para o fantasma. A escala mais comum é a escala Hounsfield (ou CT). Para ampliação de 4x o valor de fundo de 15 mil (para água ou PBS) foi substituído por 0 eo valor máximo de 35.000 para o osso foi substituído com o valor padrão de Hounsfield 3000. Valores de pixel outras resultaram de interpolação linear ou extrapolação com base nesses limites. </li></ol> 7. Processamento de imagem e análise Depois de obter imagens de alta resolução, deve-se extrair informações relevantes usando software de análise de imagem. O pacote de software a ser utilizado tem que ser projetado para trabalhar com arquivos muito grandes (até 20Gb). 8. Resultados representante A representação de um fémur de um camundongo C57/Bl6 embrionárias no dia 18.5 (E18.5) - quatro dias após o início do processo de mineralização é mostrado na Figura 3. As camadas minerais são claramente visíveis (branco), enquanto os tecidos moles não são visíveis nesta preparação. Pegamos 1000 imagens de projeção com uma ampliação linear de 4x. A resolução final é de 8 microns. Uma análise cuidadosa da prestação de volume mostrado na Fig.1, mostra que a fração de volume ósseo (a fração do volume de osso que é ocupado por tecido mineralizado) é de 0,18, ea densidade mineral óssea é 723 mg / cm 3. Esses valores permitem-nos comparar essa estrutura com ossos em outros estágios de desenvolvimento. <img src="/files/ftp_upload/2688/2688fig3.jpg" alt="Figura 3" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 3"> Figura 3. Representações diferentes de uma imagem 3D de um embrião fêmur mouse. A (corte transversal) transversal (A), a seção (medio-lateral) sagital (B) e um instantâneo do volume renderização (C) são mostrados. A Figura 4 mostra uma imagem 3D do pulmão de um rato fêmea nude (RNU), 12 semanas de idade, implantado ortotopicamente com carcinoma do pulmão de não pequenas células (NSCLC) NCI-H460. 2500 imagens de projeção foram tiradas com uma ampliação linear de 0.5x, garantindo uma resolução final de 16 microns. A imagem mostra a Microfil vasos sanguíneos corados (até 20 mícrons de diâmetro). A análise das imagens mostra que quatro semanas após o implante, os nódulos de câncer múltiplas são formadas. Eles estão cobrindo uma fração significativa do volume de pulmão (17%). A maioria dos coloração pulmonar foi encontrada em áreas periféricas dos tumores. Significativamente, como mostrado na fig 4B, diversos vasos sangüíneos estão presentes também no interior do nódulo, que abrange, de acordo com análise preliminar cerca de 3% do seu volume. <img src="/files/ftp_upload/2688/2688fig4.jpg" alt="Figura 4" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 4"> Figura 4. Imagem 3D de nódulos de câncer que cresce em um ratopulmão. Um instantâneo da prestação volume (A) e uma seção através do volume (B) são mostrados. Os nódulos de câncer são marcadas com setas. Filme 1. Renderização Volume do fêmur do rato na Figura 1. <a href="/files/ftp_upload/2688/2688movie1.mpg">Clique aqui para assistir o filme.</a> Filme 2. Renderização de volume dos pulmões de ratos na Figura 2. <a href="/files/ftp_upload/2688/2688movie2.mpg">Clique aqui para assistir o filme.</a> Filme 3. Seções Serial através dos pulmões. Os nódulos aparecem como áreas cinzentas na maioria das fatias. <a href="/files/ftp_upload/2688/2688movie3.mpeg">Clique aqui para assistir o filme.</a>

<ol><li>Schambach, S. J., Bag, S., Schilling, L., Groden, C., Brockmann, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Application+of+micro-CT+in+small+animal+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">Application of micro-CT in small animal imaging.</a> Methods. 50, 2-13 (2010).</li>
<li>Bauer, J. S., Link, T. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Advances+in+osteoporosis+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Eur+J+Radiol%22%5BJournal%5D)">Advances in osteoporosis imaging.</a> Eur J Radiol. 71, 440-449 (2009).</li>
<li>Chappard, D., Retailleau-Gaborit, N., Legrand, E., Basle, M. F., Audran, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+insight+bone+measurements+by+histomorphometry+and+microCT%5BTitle%5D)+AND+%22J+Bone+Miner+Res%22%5BJournal%5D)">Comparison insight bone measurements by histomorphometry and microCT.</a> J Bone Miner Res. 20, 1177-1184 (2005).</li>
<li>Muller, R., Van Campenhout, H., Damme, B. V. an <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Morphometric+analysis+of+human+bone+biopsies%3A+a+quantitative+structural+comparison+of+histological+sections+and+micro-computed+tomography%5BTitle%5D)+AND+%22Bone%22%5BJournal%5D)">Morphometric analysis of human bone biopsies: a quantitative structural comparison of histological sections and micro-computed tomography.</a> Bone. 23, 59-66 (1998).</li>
<li>Mueller, K., Yagel, R., Wheller, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Anti-Aliased+3D+Cone-Beam+Reconstruction+Of+Low-Contrast+Objects+With+Algebraic+Methods%5BTitle%5D)+AND+%22IEEE+Transactions+on+Medical+Imaging%22%5BJournal%5D)">Anti-Aliased 3D Cone-Beam Reconstruction Of Low-Contrast Objects With Algebraic Methods.</a> IEEE Transactions on Medical Imaging. 18, 519-537 (1999).</li>
<li>Kachelriess, M., Schaller, S., Kalender, W. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Advanced+single-slice+rebinning+in+cone-beam+spiral+CT%5BTitle%5D)+AND+%22Med+Phys%22%5BJournal%5D)">Advanced single-slice rebinning in cone-beam spiral CT.</a> Med Phys. 27, 754-772 (2000).</li>
<li>Endo, M., Komatsu, S., Kandatsu, S., Yashiro, T., Baba, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+combination-weighted+Feldkamp-based+reconstruction+algorithm+for+cone-beam+CT%5BTitle%5D)+AND+%22Phys.+Med.+Biol%22%5BJournal%5D)">A combination-weighted Feldkamp-based reconstruction algorithm for cone-beam CT.</a> Phys. Med. Biol. 51, 3953-3965 (2006).</li>
<li>Marxen, M., Thornton, M. M., Chiarot, C. B., Klement, G., Koprivnikar, J., Sled, J. G., Henkelman, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MicroCT+scanner+performance+and+considerations+for+vascular+specimen+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Med+Phys%22%5BJournal%5D)">MicroCT scanner performance and considerations for vascular specimen imaging.</a> Med Phys. 31, 305-313 (2004).</li>
<li>Plouraboué, F., Cloetens, P., Fonta, C., Steyer, A., Lauwers, F., Marc-Vergnes, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((X-ray+high-resolution+vascular+network+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22J+Microsc%22%5BJournal%5D)">X-ray high-resolution vascular network imaging.</a> J Microsc. 215, 139-148 (2004).</li>
</ol>

Não há conflitos de interesse declarados.

C57/Bl6 mouse no dia embrionário 18.5 (E18.5) é de quatro dias após o início do processo de mineralização. Nesta fase de desenvolvimento, o osso futuro é feito de muitas camadas de osteóide mineralizado, claramente visto na Fig. 3. Neste ponto, deve-se ressaltar que tecidos mineralizados pode ser visualizado na resolução mais baixa com instrumentos diferentes, que exigem um tratamento menos amostra. O presente protocolo (e as micro instrumento CT usado nele) além de proporcionar maior resolução, oferece a máxima flexibilidade para o usuário a escolher os melhores parâmetros geométricos para a medição. Resultados na Fig. 4 mostram que, no pulmão ortotópico modelos animais de câncer humano, câncer de pulmão não pequenas células podem induzir o recrutamento de vasos sanguíneos e neovascularização. Consideramos que o tecido pulmonar não era nem se movia, nem tem sua forma alterada durante a medição. O usuário deve tomar precauções especiais para evitar tais mudanças durante uma tomografia. Para algumas amostras, especialmente para os tecidos mais moles, um tem de construir aparelhos especiais de holding que imobilizam perfeitamente a amostra durante a medição. Infelizmente, a presença de vazamentos elevados de agente de contraste nas imediações dos tumores impedido quantificação confiável dos vasos sanguíneos periféricos. Como resultado as imagens estão contaminados por algum agente de coloração especialmente nas bordas, que está claramente presente nos filmes 2 e 3. Nós não poderíamos evitar esse vazamento, mas as informações úteis sobre os nódulos de câncer, incluindo seu tamanho, forma e presença de vasos sanguíneos internos não foi afetada. Poderíamos concluir claramente que, pelo menos, para a circulação brônquica, que foi aqui estudado, a oferta de sangue periférico participa de perfusão do tumor, com cerca de perfusão presente também no interior do tumor.

Para aquisição de imagem nós usamos uma MICRO XCT-400 microfocussed X-ray sistema de tomografia produzido por Xradia, Concord, EUA. As imagens foram processados ​​e analisados ​​utilizando ImageJ (NIH, EUA), Avizo (VSG, França) e MicroView (General Electric, EUA) pacotes de software. Qualquer software de análise disponíveis imagem pode ser usada em vez

imagens de alta resolução em 3d de ex-vivo amostras biológicas por micro ct

High Resolution 3D Imaging of Ex-Vivo Biological Samples by Micro CT

Não-destrutivos visualização volumétrica só pode ser alcançada através de técnicas de tomografia, dos quais o mais eficiente é o x-ray tomografia computadorizada micro (μCT). De alta resolução μCT é muito versátil e preciso técnica (1-2 mícrons de resolução) para exame em 3D de ex-vivo amostras biológicas 1, 2. Em oposição a tomografia eletrônica, o μCT permite o exame de até quatro centímetros de espessura amostras. Esta técnica requer horas apenas algumas das medidas em relação a semana em histologia. Além disso, μCT não depende de modelos 2D estereológico, portanto, podem complementar e, em alguns casos podem até mesmo substituir métodos histológicos 3, 4, que são tanto demorado e destrutivo. Condicionamento de amostras e posicionamento em μCT é simples e não requer alto vácuo ou baixas temperaturas, que pode afetar adversamente a estrutura. A amostra é posicionada e rotação de 180 ° ou 360 ° entre um microfocused fonte de raios-x e um detector, que inclui um cintilador e uma câmera CCD preciso, Para cada ângulo de uma imagem 2D é levado, em seguida, todo o volume é reconstruído usando uma dos algoritmos diferentes disponíveis 5-7. A resolução 3D aumenta com a diminuição do passo de rotação. O protocolo de vídeo atual mostra os principais passos na imobilização de preparação, e posicionamento da amostra seguido por imagem em alta resolução.

Não-destrutivos visualização volumétrica só pode ser alcançada através de técnicas de tomografia, dos quais o mais eficiente é o x-ray tomografia micro computadorizada (TC).

Imagens de alta resolução em 3D de Ex-Vivo Amostras Biológicas por Micro CT

A visualização volumétrica não destrutiva pode ser alcançada apenas por técnicas tomográficas, das quais a mais eficiente é a microtomografia computadorizada de raios X...

O objetivo geral deste procedimento é realizar a microtomografia computadorizada tridimensional por raios X de tecidos mineralizados e não mineralizados. Isso é realizado primeiramente pela extração das amostras a serem examinadas, seguida pelo imobilização e posicionamento das amostras no instrumento de micro-TC. O terceiro passo do procedimento consiste em definir os parâmetros de aquisição para cada amostra e coletar as imagens.No final, obtém-se uma imagem 3D da amostra com alta resolução por meio de tomografia computadorizada de raios X. A principal vantagem desta técnica em relação às metodologias existentes, como ressonância magnética, ultrassom ou microscopia eletrônica, é que ela fornece informações sobre volumes de carrapatos com resolução de um mícron. Este método pode fornecer informações sobre muitos tecidos biológicos. Pode ser utilizado também em eletrônica, nas ciências dos materiais e na arqueologia.O preparo é diferente para tecidos mineralizados e não mineralizados. Tecidos mineralizados devem ser selados em recipientes com ajuste hermético, para que a posição da amostra não se altere. Durante a realização de medições de alta resolução, a forma do recipiente variará de acordo com a morfologia do tecido.Por exemplo, um fêmur de camundongo extraído de um embrião com 18,5 D de idade pode caber dentro de uma ponteira de pipeta. Comece selando a extremidade estreita de uma ponteira de pipeta de poliestireno com cola, como resina epóxi. Em seguida, encha a ponteira com um tampão de trabalho.Neste caso, encaixe a perna com o fêmur exposto firmemente no interior da ponteira com PBS e coloque a ponteira em um suporte apropriado, selando a outra extremidade com uma folha de filme parafilm. Sacrifique e perfunda o animal conforme descrito no manuscrito suplementar. Em seguida, extraia os pulmões e o coração corados e transfira-os para um tubo de ensaio de 50 mililitros previamente preparado. Coloque os órgãos sobre um pedaço de papel seco.Coloque as amostras nos tubos de ensaio finais para medição, com um pano umedecido em etanol no fundo do tubo. Para criar um ambiente saturado com etanol, a amostra deve ajustar-se firmemente dentro do tubo. Se a amostra estiver solta, aperte-a com um fio e imobilize-a próximo ao fundo do tubo, logo acima do pano.Em seguida, cole ou parafuse o tubo em um suporte do instrumento e prossiga com o ajuste da imagem. Parâmetros de aquisição. Comece colocando o porta-amostras na platina de rotação do instrumento.Em seguida, utilizando valores arbitrariamente selecionados de tensão e corrente, obtenha uma imagem de raios X. Se a imagem estiver muito escura, faça ajustes aumentando gradualmente o número de fótons.Isso é feito aumentando progressivamente a corrente. Se a imagem não tiver ficado mais brilhante após aumentar a corrente para 200 microampères, faça pequenos aumentos progressivos na energia dos fótons de raios X aumentando a tensão. Se a imagem estiver muito brilhante, primeiro reduza a tensão, depois reduza a corrente até que a imagem fique satisfatória.Benning também pode ser utilizado para aumentar o brilho da imagem à custa da resolução. Um valor de inning igual a dois tornará a imagem cerca de quatro vezes mais brilhante com metade da resolução. Após definir o brilho ideal, otimize o tempo de exposição da câmera para equilibrar o melhor contraste obtível com uma duração razoável do experimento.O contraste da imagem, especialmente para amostras com alta absorção, pode ser melhorado utilizando filtros para reduzir o fluxo de fótons de baixa energia. Agora, escolha a magnificação de trabalho entre 0,5 x e 40 x e ajuste o campo de visão para abranger toda a amostra, maximizando ao mesmo tempo a resolução. Para aumentar a resolução, posicione a fonte de raios X mais próxima da amostra.Para aumentar o campo de visão, posicione o detector mais próximo da amostra. Para a imagem 3D, a amostra deve caber dentro do campo de visão em qualquer ângulo de rotação, portanto o eixo de rotação deve estar centralizado. Comece girando a amostra até menos 20 graus.Se o volume desejado tiver se deslocado lateralmente, reposicione o eixo de rotação. Prossiga com a aquisição de imagens em rotações adicionais e continue fazendo correções até que a amostra esteja totalmente visível de -90 a +90 graus, então prossiga com a medição em todos os ângulos entre -90 e 90 graus. A execução de um programa de imageamento pode levar muito tempo, portanto planeje-se adequadamente.Por exemplo, para obter imagens do fêmur inteiro com ampliação de Forex e resolução de oito mícrons são necessárias 1.000 imagens de projeção. Isso leva apenas três horas para ser concluído. No entanto, leva 10 horas para coletar as 2.500 imagens de projeção necessárias para visualizar os pulmões de rato com ampliação de 0,5 x e resolução de 16 mícrons.Para comparação futura das imagens, é necessário calibrar a imagem obtendo imagens de um fantasma padrão feito de materiais artificiais que apresentam absorção de raios X semelhante à do osso e à da água, nas mesmas condições experimentais. Quanto à amostra, após registrar todas as imagens de projeção, o volume completo é reconstruído. Para calibrar a imagem reconstruída aos valores do fantasma, utilize o campo hounds ou a escala de TC.Por exemplo, na ampliação Forex, o valor semelhante à água no fantoma é definido como zero e o valor semelhante ao osso é definido como 3000 dentro dessa faixa. Todos os demais valores são interpolados ou extrapolados. As imagens podem agora ser analisadas usando qualquer pacote de software capaz de suportar arquivos de 20 gigabytes, como o ImageJ gratuito ou o Fiji.Esta renderização volumétrica mostra o fêmur de um camundongo quatro dias após a mineralização óssea ter iniciado, com a fração mineralizada calculada em 18%, e a densidade mineral óssea pode ser comparada a ossos em outros estágios de desenvolvimento. Esta renderização volumétrica tomográfica dos pulmões de uma rata nua fêmea de 12 semanas de idade tem resolução de 16 micrômetros. A coloração pulmonar é utilizada para revelar vasos sanguíneos com diâmetro de 20 micrômetros.Nesta análise de cortes seriados dos mesmos pulmões, múltiplos nódulos cancerosos podem ser observados como formas acinzentadas sólidas dentro de quatro semanas após o implante das células tumorais. Nestes pulmões, os nódulos cresceram até cobrir 17% do volume pulmonar.A maioria da coloração pulmonar foi encontrada nas áreas periféricas dos tumores. Vasos sanguíneos também estão presentes no interior dos nódulos, ocupando cerca de 3% do seu volume. Uma vez dominado, o posicionamento da amostra pode ser realizado em 15 a 20 minutos, se for feito corretamente.O tempo de aquisição de imagens, incluindo a reconstrução automática de volume, que normalmente não exige a presença de um operador, depende da amostra e pode levar até 50 horas. Não se esqueça de que o manuseio de agentes fixadores e corantes pode ser extremamente perigoso. Use sempre luvas de laboratório e evite inalar vapores provenientes das amostras.

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