Imagens ao vivo de extrusão celular da epiderme de Zebrafish desenvolvimento

A manutenção dos tecidos epiteliais requer a remoção contínua de células danificadas e moribundas sem interromper a função de barreira. Para realizar isso, expulse as células moribundas formando e contraindo um anel de actina e miosina na célula ao redor da célula moribunda para ejetá-la enquanto fecha quaisquer lacunas que possam ter resultado de sua saída. Neste artigo em vídeo, Um método para induzir e criar imagens de extrusão de células apoptóticas da epiderme de larvas de peixe-zebra em tempo real.

Em mostrado, isso é conseguido pela injeção de uma proteína fluorescente vermelha marcada com sonda de actina F em embriões de peixe-zebra transgênicos em estágio celular expressando proteína fluorescente verde na epiderme para visualizar filamentos atuantes em tecidos epiteliais. Dia quatro, larvas pós-personalização que expressam GFP e RFP são então tratadas com G quatro 18 para induzir apoptose na epiderme. A dinâmica da actina e as alterações na forma das células epiteliais que ocorrem durante a extrusão são visualizadas por imagens de lapso de tempo em um microscópio confocal de disco giratório.

A principal vantagem desta técnica sobre os métodos existentes, como força imunológica e análises, é que podemos observar mudanças rápidas e dinâmica de actina que ocorrem durante o processo de extrusão em um tecido epitelial vivo. Neste vídeo, mostraremos um procedimento para geração de imagens de extrusão de células apoptóticas da epiderme de peixes-zebra em desenvolvimento em tempo real. Usamos esse procedimento em nosso laboratório para entender como as células reorganizam coordenadamente seu citoesqueleto de actons para remover células apoptóticas, mantendo a função de barreira e como interromper o processo de extrusão pode levar a certos estados de doença.

Então vamos começar: Para visualizar a dinâmica de atuação durante a extrusão celular na epiderme do peixe-zebra em desenvolvimento, comece descongelando o RNA previamente transcrito no gelo. Transcrevemos Mr.mRNA que codifica a proteína fluorescente vermelha fundida ao calp no domínio de homologia da utrofina e atuamos na proteína de ligação. Adicione vermelho de fenol ao RNA na proporção de um para um para uma concentração final de RNA de cerca de 30 nanogramas por microlitro e carregue um microlitro de solução em uma agulha capilar puxada por enchimento traseiro.

Colete cerca de 75 embriões C-K-G-F-P em estágio 1 celular em E três tampão. Pipete os embriões coletados no molde de microinjeção com uma pipeta de macarrão de cinco e três quartos e oriente suavemente os embriões no cocho com FST Dumont. Número cinco, as pinças trabalham rapidamente para evitar a necessidade de injetar o RNA em embriões de vários estágios sob um microscópio estéreo de dissecação de laboratório padrão.

Use um microinjetor controlado por pressão para injetar o RNA no jugo dos embriões como fóssil de fenol. O vermelho deve ser visível no embrião após a injeção. Certifique-se de injetar pelo menos 50 embriões para cada experimento.

Separe os embriões para remover quaisquer óvulos não fertilizados ou danificados e incube todos os embriões restantes a 28 graus Celsius. Após 24 horas, use um microscópio de dissecação fluorescente para selecionar embriões de peixe-zebra que tenham um alto nível de fluorescência GFP na epiderme e fluorescência atuante marcada com RFP. Incubar os embriões selecionados a 28 graus Celsius até que estejam prontos para prosseguir com o tratamento medicamentoso para induzir a exposição à apoptose ao aminoglicosídeo.

O antibiótico G four 18 ou medicamento causa extrusão de células apoptóticas da epiderme das larvas de peixe-zebra em desenvolvimento. É importante ressaltar que este tratamento só funciona em larvas quatro dias após a fertilização e mais velhas para induzir a extrusão celular. Colete até 25 larvas de peixe-zebra 4 dias após a fertilização expressando GFP e RFP em uma placa de cultura de 35 por 10 milímetros contendo três mililitros de meio E-três.

Substitua cuidadosamente o meio por três mililitros de E três contendo um miligrama por mililitro de G quatro 18 e incube a larva na droga por quatro horas no escuro a 28 graus Celsius. Em seguida, remova a mídia e substitua por E pré-quente três mídias contendo 0,02% trica e prossiga para montar as larvas para montar as larvas para imagem. Transfira até três larvas para um tubo de fendor de 1,5 mililitro e remova a maior parte do meio E três.

Usando uma pipeta cortada, coloque 120 microlitros de 1% de baixo ponto de fusão na mistura de tubos. Em seguida, pipete suavemente as larvas e a mistura de aro na lamínula no fundo de um prato de cultura matech. Usando um suporte de pino FST com um pino de inserção ou agulha de tungstênio anexado, oriente rapidamente as larvas para que fiquem retas e planas contra a lamínula.

Deixe o aose solidificar. Em seguida, encha suavemente o prato com E três meios contendo 0,02% trica. Descobrimos que todo o processo de extrusão de células apoptóticas da epiderme das larvas de peixe-zebra em desenvolvimento leva aproximadamente 20 minutos.

Aqui, demonstramos como configurar um experimento de imagem de lapso de tempo usando um microscópio confocal de disco giratório e o software and ou IQ para coletar planos da série Z através de uma única camada da epiderme do peixe-zebra. Primeiro, ligue a câmera do microscópio de lasers de néon de argônio e hélio e a lâmpada epifluorescente dentro do software e ou IQ. Crie um protocolo de série temporal contendo os comprimentos de onda a serem fotografados.

A frequência dos intervalos entre as capturas de imagem e o número de vezes que a captura deve ser repetida Coloque delicadamente a placa mattec contendo a amostra no microscópio stage e, em seguida, use uma objetiva de 20 vezes com luz transmitida para focar nas larvas. Mova a objetiva de imersão em água 40 vezes para a posição correta. Usando esse objetivo, podemos filmar aproximadamente 20 a 25 células por campo, o que nos permite acompanhar os comportamentos celulares durante a extrusão, ao mesmo tempo em que resolvemos a dinâmica de atuação subcelular.

Coloque cuidadosamente uma gota de água no topo da objetiva de 40 vezes e coloque rapidamente o prato de mattec em cima. Identifique a amostra usando iluminação de campo claro e, em seguida, use epifluorescência de 488 nanômetros para focar especificamente na epiderme positiva para GFP. Mude para o modo de varredura confocal.

Ajuste a intensidade do laser e o tempo de exposição para cada um dos canais de acordo. Tome cuidado para equilibrar a potência do laser e o tempo de exposição para uma detecção ideal do seu sinal e para evitar qualquer fototoxicidade. Para identificar células de extrusão, use epifluorescência para visualizar a epiderme marcada com GFP e identificar um grupo de células em um padrão clássico de roseta que consiste em uma coleção de células ao redor de uma pequena célula redonda no meio.

Além disso, deve haver um acúmulo da actina marcada com RFP visível como um anel ao redor da pequena célula redonda no meio, uma marca registrada da extrusão celular. Uma vez identificada uma célula de extrusão, defina rapidamente os limites superior e inferior para a Série Z e o tamanho do passo. Em seguida, comece a adquirir quatro conjuntos de dados confocais D para visualizar os dados e visualizar a contração do anel de actina e os comportamentos epiteliais que ocorrem ao redor da célula moribunda.

Com o tempo, faça projeções 3D da série Z e salve os dados como um arquivo de filme. Esta etapa pode ser executada usando uma variedade de pacotes de software. Esta figura mostra a expressão de RFP UTR CH na epiderme de uma larva de peixe-zebra CK GFP quatro dias após a fertilização.

Aqui ainda enquadram projeções Z de um filme de lapso de tempo que seguem a dinâmica de atuação ao vivo. Durante o processo de extrusão de células epiteliais são mostradas as setas denotam o anel de actina formado por células vizinhas, que se contrai e se fecha ao longo de dois minutos. Seguindo este procedimento, podemos usar outros métodos em combinação com esta técnica, como o uso de inibidores químicos ou mutações genéticas para entender melhor como a alteração da extrusão pode levar a certos estados de doença.

Decorrente da falha em limpar as células apoptóticas, acabamos de mostrar como configurar um experimento de imagem de lapso de tempo para visualizar o processo de extrusão da epiderme do peixe-zebra em desenvolvimento. Ao realizar este procedimento, é importante lembrar de limitar a quantidade de luz exposta à sua amostra para evitar qualquer fotobranqueamento ou toxicidade. Então é isso.

Obrigado por assistir e boa sorte com seus experimentos.