Determinação de concentração de ácidos nucléicos e proteínas Usando o Micro-volume Bio-spec Espectrofotômetro Nano

O objetivo geral deste procedimento é determinar as concentrações de ácidos nucléicos e proteínas com precisão e reprodutibilidade usando um espectrofotômetro de micro volume. Isso é feito selecionando primeiro o comprimento do caminho apropriado para a amostra a ser medida. A segunda etapa do procedimento é medir um espaço em branco.

Em seguida, a amostra de DNA ou proteína é medida. A etapa final do procedimento é salvar os dados em formato PDF ou CSV. Em última análise, resultados altamente reprodutíveis para DNA e proteína.

A quantificação pode ser obtida com rapidez e precisão por este método. A principal vantagem dessa técnica é que ela é rápida, precisa e reprodutível. Para iniciar o procedimento de quantificação de DNA, ligue o nano espectrofotômetro de especificação do BIOS.

Abra o software biográfico nano na área de trabalho do PC. Clique na guia simples de ácido nucleico D-S-D-N-A. O software estabelecerá comunicação com o instrumento e executará uma sequência de inicialização.

Isso verifica se o instrumento está funcionando de acordo com as especificações. Em seguida, selecione o comprimento do caminho. No controle deslizante de comprimento do caminho.

Três opções estão disponíveis para amostras de volume de microlitros. 0,2 milímetros ou 0,7 milímetros podem ser usados. E para amostras diluídas, existe a opção de usar um vete de comprimento de caminho de cinco milímetros.

Nesta demonstração, 0,7 milímetros são selecionados para medir uma amostra de dois microlitros. Todos os cálculos são baseados no comprimento do caminho selecionado. Em seguida, no software, clique na guia de configuração e selecione configuração de limpeza automática.

Selecione um para um toalhete. Antes da medição da amostra, ou toda vez que um novo comprimento de caminho é selecionado, é necessária uma medição em branco Para um comprimento de caminho de 0,7 milímetros, pipete dois microlitros de água ou tampão no pedestal. Clique em branco para medir em branco.

A janela superior se moverá para fazer contato com a gota de amostra e flashes de xenônio podem ser observados. Quando a medição estiver concluída, o limpador limpará automaticamente a amostra. Agora a amostra pode ser medida.

É importante usar uma solução de amostra homogênea como presença de partículas não dissolvidas. A partícula da amostra resultará em dados irreproduzíveis. Para evitar a introdução de bolhas de ar, aspire cuidadosamente dois microlitros da amostra e, em seguida, pipete a amostra uniformemente da ponta da pipeta para o pedestal.

Pressione o botão Iniciar no instrumento. Como antes, a janela superior se moverá para fazer contato com a gotícula da amostra e flashes de xenônio podem ser observados para determinar a reprodutibilidade, repita a medição da mesma amostra três vezes, todos os dados registrados são salvos automaticamente como um arquivo BUD. Para salvar como um arquivo PDF ou CCSV, clique em salvar P-D-F-C-S-V.

Os resultados também podem ser salvos como um arquivo CSV usando a seleção apropriada na guia salvar. A quantificação de proteínas pode ser feita usando o método de absorbância dois 80. Para quantificação de proteínas, selecione a guia de quantificação de proteínas.

Insira o coeficiente de extinção epsilon dois 80 se conhecido, se Epsilon dois 80 não for conhecido, calcule-o usando Epsilon dois 80 calc selecione 0,2 milímetros no controle deslizante de comprimento do caminho para medir uma amostra de três microlitros. Em seguida, no software, clique na guia de configuração e selecione configuração de limpeza automática. Selecione dois para dois lenços para evitar qualquer transferência de amostra e garantir uma leitura precisa.

Para medir uma pipeta em branco de três microlitros de água ou tampão no pedestal, clique em branco para medição em branco. Em seguida, pipete cuidadosamente três microlitros de amostra de proteína no pedestal. Sem introduzir bolhas de ar para começar a medir a amostra, clique em iniciar no software ou pressione o botão Iniciar no instrumento.

Repetir a medição da mesma amostra três vezes para determinar a reprodutibilidade apresentada. Aqui estão os dados das medições em uma amostra típica de DNA de fita dupla. A fórmula usada para calcular a concentração de DNA é a concentração da amostra igual a DF vezes a quantidade de OD dois 60 menos OD três 20 vezes NACF, onde DF é igual ao fator de diluição da amostra e NACF é igual ao fator de concentração de ácido nucleico.

O factor de concentração de ácidos nucleicos é definido de acordo com a substância a analisar seleccionada. A concentração de ácido nucleico calculada e a razão OD 2 62 80 são indicadas. Esta tabela contém os resultados dos testes de reprodutibilidade para quantificação de DNA.

Juntos, os dados mostram resultados altamente reprodutíveis, como evidenciado pelo baixo desvio padrão relativo de 0,26% Os resultados representativos de uma análise de concentração de proteína para BSA são mostrados aqui. A concentração de proteína de micrograma por mililitro é baseada no valor Epsilon dois 80. Finalmente, esta tabela mostra uma análise de reprodutibilidade da quantificação da proteína.

O desvio padrão relativo de 0,51% indica que a especificação nano do BIOS mede com precisão não apenas o DNA, mas também as proteínas. Uma vez dominado, várias amostras podem ser analisadas em um minuto.