Determinação de concentração de ácidos nucléicos e proteínas Usando o Micro-volume Bio-spec Espectrofotômetro Nano

O objetivo geral deste procedimento é determinar com precisão e reprodutibilidade as concentrações de ácidos nucleicos e proteínas utilizando um espectrofotômetro de microvolume. Isso é realizado primeiramente selecionando o comprimento de trajeto apropriado para a amostra a ser medida. O segundo passo do procedimento é medir um branco.

Em seguida, a amostra de DNA ou proteína é medida. O passo final do procedimento é salvar os dados no formato PDF ou CSV. Em última análise, resultados altamente reprodutíveis para DNA e proteína.

A quantificação pode ser obtida rapidamente e com precisão por este método. A principal vantagem desta técnica é que ela é rápida, precisa e reprodutível. Para iniciar o procedimento de quantificação de DNA, ligue o espectrofotômetro BIOSpec-nano.

Abra o software BIOS spec nano a partir da área de trabalho do PC. Clique na guia ácido nucleico simples D-S-D-N-A. O software estabelecerá comunicação com o instrumento e executará uma sequência de inicialização.

Isso verifica se o instrumento está funcionando de acordo com as especificações. Em seguida, selecione o comprimento do caminho óptico. No controle deslizante do comprimento do caminho óptico.

Três opções estão disponíveis para amostras de volume microlitro. Pode-se usar 0,2 milímetros ou 0,7 milímetros. E para amostras diluídas, há a opção de usar um caminho óptico de cinco milímetros.

Nesta demonstração, 0,7 milímetros é selecionado para medir uma amostra de dois microlitros. Todos os cálculos são baseados no comprimento de trajeto selecionado. Em seguida, no software, clique na guia configuração e selecione a configuração de limpeza automática.

Selecione um para uma única limpeza. Antes da medição da amostra, ou toda vez que um novo comprimento de trajeto óptico for selecionado, é necessária uma medição em branco. Para um micropipetador com comprimento de trajeto óptico de 0,7 milímetro, pipete dois microlitros de água ou tampão sobre o pedestal. Clique em branco para realizar a medição em branco.

A janela superior se moverá para entrar em contato com a gota da amostra e flashes de xenônio poderão ser observados. Quando a medição estiver concluída, o limpador removerá automaticamente a amostra. Agora a amostra pode ser medida.

É importante usar uma solução amostral homogênea, pois a presença de partículas não dissolvidas pode resultar em dados irreprodutíveis. Para evitar a introdução de bolhas de ar, aspire cuidadosamente dois microlitros da amostra e, em seguida, pipete uniformemente a amostra para fora da ponteira sobre o pedestal.

Pressione o botão de início no instrumento. Como antes, a janela superior se moverá para fazer contato com a gota da amostra e flashes de xenônio podem ser observados; para determinar a reprodutibilidade, repita a medição da mesma amostra três vezes. Todos os dados registrados são automaticamente salvos como um arquivo A BUD. Para salvar como um arquivo PDF ou CCSV, clique em salvar P-D-F-C-S-V.

Os resultados também podem ser salvos como um arquivo CSV usando a seleção apropriada na guia salvar. A quantificação de proteínas pode ser realizada usando o método de absorvância a 280 nm. Para quantificação de proteínas, selecione a guia de quantificação de proteínas.

Insira o coeficiente de extinção épsilon 280 se for conhecido; se o épsilon 280 não for conhecido, calcule-o utilizando o cálculo do épsilon 280. Selecione 0,2 milímetros no controle deslizante de comprimento de trajeto para medir uma amostra de três microlitros. Em seguida, no software, clique na guia configuração e selecione a configuração de limpeza automática. Selecione dois para duas limpezas a fim de prevenir qualquer contaminação cruzada da amostra e garantir uma leitura precisa.

Para medir um branco, pipete três microlitros de água ou tampão sobre o pedestal e clique em branco para a medição do branco. Em seguida, pipete cuidadosamente três microlitros da amostra de proteína sobre o pedestal. Sem introduzir bolhas de ar, inicie a medição da amostra clicando em iniciar no software ou pressionando o botão de início no instrumento.

Repita a medição da mesma amostra três vezes para determinar a reprodutibilidade mostrada. Abaixo estão dados de medições realizadas em uma amostra típica de DNA de dupla fita. A fórmula utilizada para o cálculo da concentração de DNA é concentração da amostra igual a DF vezes a quantidade de OD 260 menos OD 320 vezes NACF, onde DF equivale ao fator de diluição da amostra e NACF equivale ao fator de concentração do ácido nucleico.

O fator de concentração do ácido nucleico é definido de acordo com o analito selecionado. A concentração calculada do ácido nucleico e a razão OD 2 62 80 são indicadas. Esta tabela contém os resultados dos testes de reprodutibilidade para a quantificação de DNA.

Em conjunto, os dados mostram resultados altamente reprodutíveis, conforme evidenciado pelo baixo desvio padrão relativo de 0,26%. Aqui são apresentados resultados representativos de uma análise de concentração proteica para BSA. A concentração proteica em microgramas por mililitro baseia-se no valor de Epsilon dois 80. Finalmente, esta tabela mostra uma análise de reprodutibilidade da quantificação proteica.

O desvio padrão relativo de 0,51% indica que o BIOS spec nano mede a densidade óptica com precisão não apenas para DNA, mas também para proteínas. Após dominar a técnica, múltiplas amostras podem ser analisadas em um minuto.