Name: Translocação polarizada de proteínas fluorescentes em Xenopus Ectodérmicas em resposta à sinalização Wnt (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-05-26T15:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 55 s
Description: Aprenda a visualizar a localização subcelular de proteínas em embriões de Xenopus usando microscopia de fluorescência. Este método permite estudar a polaridade celular e o controle espacial da sinalização em ectoderme.

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Pesquisa no laboratório Sokol é patrocinado pela Institues Nacional de Saúde.

1. Fertilização In Vitro de Xenopus Ovos <ol><li> Obtenção dos ovos de rãs do sexo feminino que foram injetados com gonadotrofina coriônica humana (400 unidades / rã) 12 horas antes do experimento. </li><li> Coloque os ovos em uma pequena quantidade (0,5-1 ml) de uma solução de Ringer x Marc modificados (MMR) 10 a os ovos e fertilizá-los in vitro com um pequeno pedaço de testículos dissecados. Depois de 2-3 min, adicione 0,1 x MMR para cobrir toda a superfície dos ovos. Em 20 minutos, o ovo casaco geléia é removido por cisteína 3% - HCL (pH ajustado para 8 com hidróxido de sódio). Os ovos são lavados com 0,1 x MMR três vezes e deixado em uma incubadora de frio (13 ° C) para injectáveis. </li><li> Ovos fertilizados são autorizados a desenvolver a 2-4 estágio celular. Para injectáveis, os embriões são transferidos para a solução contendo Ficoll 3%, 0,5 x MMR. </li></ol> 2. Microinjeção RNA <ol><li> RNAs são sintetizados a partir de modelos DNA linearizado usando mMessage mMachine kit (Ambion) e diluído com água livre de RNase na concentração de ações de 0,1-1 mg / mL. Doses ótimas de RNAs para injectáveis ​​são determinados em experimentos-piloto. RNAs para Diversin-RFP, o marcador de membrana GFP-CAAX Frizzled e 8 são utilizados em 0,1-1 ng por injeção. </li><li> Agulhas de injeção são preparados com um puxador de uma agulha de uma capilar e, em seguida, com um moedor de agulha. Antes da injecção, cada agulha é calibrado com água para ejetar 10 nl de injeção de líquido por. </li><li> Para injectáveis, os embriões são colocados em um prato de plástico em uma gota grande de Ficoll 3%, 0,5 x MMR. Um microlitro de solução de RNA é sugado para uma agulha de injeção com Narishige microinjetor. Nl 10 de RNA é injetado em animais de 8 blastômeros de embriões de células 2-3 vezes. Os embriões injetados são transferidos para um poço da placa de 12 poços. </li></ol> 3. Preparando Explantes Ectodérmica <ol><li> Quando os embriões injetados atingir o estádio de gástrula inicial, eles são transferidos para solução 0,6 x MMR em um prato de 3 centímetros de plástico revestidas com agarose 1%. Membrana vitelina é removida manualmente com uma pinça. Explantes ectodérmica são excisadas dos embriões usando uma agulha de tungstênio e um hairloop. </li><li> Explantes ectodérmica são transferidos para um frasco de vidro e fixado com formol a 3,7% em tampão fosfato salino (PBS) por 30 minutos. Explantes fixos são lavados com PBS por três vezes (10 minutos cada). DAPI está incluído na terceira lavagem de manchar núcleos. </li><li> Explantes são montados em um copo de slides. Duas tiras de fita adesiva estão ligados ao slide e os explantes são colocados entre as duas tiras. Uma vez que a superfície externa de explantes é pigmentada, o lado interno dos explantes deve enfrentar a objetiva do microscópio. Adicionar 2-3 gotas 20 mL da solução de montagem (70 glicerol% em PBS, incluindo 25 mg / ml DABCO, anti-fading reagente) 11. Coloque uma lamela por cima. </li></ol> 4. Imagem de explantes Sob um microscópio de fluorescência <ol><li> As amostras são vistas sob microscópio Zeiss Axioplan fluorescentes com filtros adequados. </li><li> As imagens são tiradas com o anexo ApoTome para visualizar um plano específico de vários explantes independente. </li></ol> 5. Cryosectioning Cryosectioning é uma forma alternativa de visualizar a distribuição de proteínas fluorescentes na célula e mais aplicável para a imunocoloração. No estágio 10, os embriões são fixos por 1-2 horas, com fixador Dent (20% DMSO, 80% de metanol), lavados com PBS, e embebidos em solução de sacarose 15% dos peixes gelatin/15 11%. Os embriões congelados são rapidamente incorporados em gelo seco e criosecções são gerados em Leica Criostato. Seções transversais incluiria células ectodérmicas que herdam RNAs injetado e seus produtos de proteína traduzida. As secções mantêm fluorescência e pode ser com os anticorpos específicos e, em seguida, rotulados com anticorpos secundários conjugados com fluorescência. Núcleos são corados com DAPI. Os meios de comunicação de montagem são os mesmos descritos acima. Imagem pode ser realizada como descrito acima. 6. Resultados representativos: <img src="/files/ftp_upload/2700/2700fig1.jpg" alt="Figura 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 1"> Figura 1. Receptor Frizzled recrutas Diversin à membrana celular. Células ectodérmicas expressar 8 Frizzled (Xfz8) e Div-RFP RNAs revelar Div-RFP na membrana celular, em vez de o centrossoma (como revelado por g-tubulina co-coloração). O esquema do experimento está no topo; uma típica seção transversal é mostrada.

<ol><li>Gurdon, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Embryonic+induction+---+molecular+aspects%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Embryonic induction --- molecular aspects.</a> Development. 99, 285-306 (1987).</li>
<li><a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22Principles+of+Developmental+Genetics%22">Principles of Developmental Genetics</a>. Moody, S. A. , Academic Press. (2007).</li>
<li>Clevers, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Wnt%2Fbeta-catenin+signaling+in+development+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Wnt/beta-catenin signaling in development and disease.</a> Cell. 127, 469-480 (2006).</li>
<li>Klaus, A., Birchmeier, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Wnt+signalling+and+its+impact+on+development+and+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Cancer%22%5BJournal%5D)">Wnt signalling and its impact on development and cancer.</a> Nat Rev Cancer. 8, 387-398 (2008).</li>
<li>Gordon, M. D., Nusse, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Wnt+signaling%3A+multiple+pathways%2C+multiple+receptors%2C+and+multiple+transcription+factors%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Wnt signaling: multiple pathways, multiple receptors, and multiple transcription factors.</a> J Biol Chem. 281, 22429-22433 (2006).</li>
<li>Schwarz-Romond, T., Asbrand, C., Bakkers, J., Kuhl, M., Schaeffer, H. J., Huelsken, J., Behrens, J., Hammerschmidt, M., Birchmeier, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+ankyrin+repeat+protein+Diversin+recruits+Casein+kinase+Iepsilon+to+the+beta-catenin+degradation+complex+and+acts+in+both+canonical+Wnt+and+Wnt%2FJNK+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+Dev%22%5BJournal%5D)">The ankyrin repeat protein Diversin recruits Casein kinase Iepsilon to the beta-catenin degradation complex and acts in both canonical Wnt and Wnt/JNK signaling.</a> Genes Dev. 16, 2073-2084 (2002).</li>
<li>Moeller, H., Jenny, A., Schaeffer, H. J., Schwarz-Romond, T., Mlodzik, M., Hammerschmidt, M., Birchmeier, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Diversin+regulates+heart+formation+and+gastrulation+movements+in+development%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Diversin regulates heart formation and gastrulation movements in development.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 103, 15900-15905 (2006).</li>
<li>Itoh, K., Jenny, A., Mlodzik, M., Sokol, S. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Centrosomal+localization+of+Diversin+and+its+relevance+to+Wnt+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell+Sci%22%5BJournal%5D)">Centrosomal localization of Diversin and its relevance to Wnt signaling.</a> J. Cell Sci. 122, 3791-3798 (2009).</li>
<li>Itoh, K., Jacob, J., Sokol, Y. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+role+for+Xenopus+Frizzled+8+in+dorsal+development%5BTitle%5D)+AND+%22Mech+Dev%22%5BJournal%5D)">A role for Xenopus Frizzled 8 in dorsal development.</a> Mech Dev. 74, 145-157 (1998).</li>
<li>Newport, J., Kirschner, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+major+developmental+transition+in+early+Xenopus+embryos%3A+I.+characterization+and+timing+of+cellular+changes+at+the+midblastula+stage%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">A major developmental transition in early Xenopus embryos: I. characterization and timing of cellular changes at the midblastula stage.</a> Cell. 30, 675-686 (1982).</li>
<li>Itoh, K., Brott, B. K., Bae, G. U., Ratcliffe, M. J., Sokol, S. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nuclear+localization+is+required+for+Dishevelled+function+in+Wnt%2Fbeta-catenin+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol%22%5BJournal%5D)">Nuclear localization is required for Dishevelled function in Wnt/beta-catenin signaling.</a> J Biol. 4, 3-3 (2005).</li>
</ol>

Não há conflitos de interesse declarados.

Temos utilizado o protocolo acima para caracterizar a localização subcelular de Diversin. Em explantes pólo animal, Diversin-RFP foi detectado junto ao núcleo e colocalized com g-tubulina, um marcador centrosomal, em criosecções (Figura 1). Uma vez que a localização subcelular de uma proteína é identificada, constrói a exclusão pode ser gerado para estabelecer quais domínios de proteína são necessárias e suficientes para a localização subcelular. Usando essa abordagem, os domínios de localização centrosomal de Diversin ...

translocação polarizada de proteínas fluorescentes em xenopus ectodérmicas em resposta à sinalização wnt

Polarized Translocation of Fluorescent Proteins in Xenopus Ectoderm in Response to Wnt Signaling

Polaridade celular é uma propriedade fundamental das células eucarióticas que é dinamicamente regulada por fatores intrínsecos e extrínsecos durante o desenvolvimento embrionário 1, 2. Uma das vias de sinalização envolvidas neste regulamento é o caminho Wnt, que é usado muitas vezes durante a embriogênese e críticas para a doença humana 3, 4, 5. Múltiplos componentes moleculares desta via coordenadamente regular a sinalização de uma forma espacialmente restrito, mas os mecanismos subjacentes não são totalmente compreendidos. Células embrionárias epiteliais Xenopus é um excelente sistema para o estudo de localização subcelular de várias proteínas de sinalização. Proteínas de fusão fluorescentes são expressos em embriões Xenopus por microinjeção RNA, explantes ectodérmica são preparados e localização de proteínas é avaliado por epifluorescência. Neste protocolo experimental que descrevem como localização subcelular de Diversin, uma proteína citoplasmática que tem sido implicado na sinalização celular e determinação de polaridade 6, 7 é visualizado em células Xenopus ectodérmica para estudar transdução de sinal Wnt 8. Co-expressão de um ligante Wnt ou um receptor Frizzled altera a distribuição de Diversin fundido com proteína fluorescente vermelha, RFP, e recruta-o para a membrana celular de uma forma polarizada 8, 9. Este protocolo ex vivo deve ser uma adição útil para estudos in vitro de culturas de células de mamíferos, em que o controle espacial de sinalização difere daquela do tecido intacto e é muito mais difícil de analisar.

Xenopus ectoderma embrionário tornou-se um modelo atraente para os estudos da polaridade celular. Um ensaio é descrito, em que a distribuição subcelular de proteínas fluorescentes é avaliada em células ectoderma. Este protocolo vai ajudar abordar as questões relacionadas ao controle espacial de sinalização.

Translocação polarizada de proteínas fluorescentes em Xenopus Ectodérmicas em resposta à sinalização Wnt

A polaridade celular é uma propriedade fundamental das células eucarióticas que é regulada dinamicamente por fatores intrínsecos e extrínsecos durante o desenvolvimento embrionário...

O objetivo geral deste procedimento é examinar alterações na localização subcelular de proteínas após a sinalização por fatores de crescimento. Isso é realizado primeiramente injetando blastômeros animais de embriões iniciais de Xenopus com RNAs que codificam diversas proteínas marcadas com RFP e o receptor de sinalização FRIZZLED oito. Em seguida, são preparados implantes eletrodérmicos e/ou cortes criostáticos de embriões e realizada imunomarcação.Por fim, as células imunomarcadas são visualizadas utilizando um microscópio fluorescente. Em última análise, podem-se obter resultados que mostram como a localização subcelular de proteínas específicas depende de vias de sinalização embrionárias. Como exemplo, demonstramos que a proteína DIVERSA é recrutada do centríolo para a membrana celular pelo receptor FRIZZLED OITO.Este método permite aos pesquisadores visualizar a localização subcelular de proteínas sinalizadoras in vivo utilizando embriões de Xenopus. Isso pode ajudar a responder questões fundamentais na biologia do desenvolvimento e celular, como estudos sobre a regulação espacial de sinalização e mecanismos de prioridade celular. Para iniciar o processo de fertilização in vit

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Biologia

Genética induzível Destino Mapping (GIFM) marcas e faixas de células com o controle espacial e temporal...

Uma Abordagem Prática para mapeamento genético induzível Fate: Um Guia Visual para Mark e Track Células In Vivo</em

Descrevemos aqui o uso de uma variante de proteína fluorescente verde sensível ao pH, pHluorin, para estudar a dinâmica espátula-temporal dos receptores de orientação de axônio que traficam na superfície celular. O receptor com marca de phluorina é expresso tanto na cultura celular quanto in vivo,usando eletroporação do embrião de filhote.

Uso de pHluorin para avaliar a dinâmica dos receptores de orientação de axônio na cultura celular e no embrião de filhotes

O manuscrito aqui fornece um simples conjunto de métodos que permitam analisar a secreção e difusão de ligantes marcados fluorescentes em Xenopus. Isto proporciona um contexto para testar a capacidade de outras proteínas para modificar a distribuição de ligando e permitindo experiências que podem dar uma visão sobre os mecanismos que regulam a gradientes de morfogénio.

Utilizando Análise de confocal<em&gt; Xenopus laevis</em&gt; Para Investigar moduladores de Wnt e Shh morfogénio gradientes

Nos embriões de Xenopus, as células do teto do blastocele são pluripotentes e podem ser programadas para gerar vários tecidos. Aqui, descrevemos protocolos para usar explantes de telhado de blastocele de anfíbios como um sistema de ensaio para investigar as principais características in vivo e in vitro do desenvolvimento neural inicial.

Stem Cell-like<em&gt; Xenopus</em&gt; Embrionárias explantes Estudar características Neural desenvolvimento precoce<em&gt; In Vitro</em&gt; E<em&gt; In Vivo</em

Apresentamos transgênese transitória e silenciamento de genes em Ciona intestinalis, um grupo irmã cordados aos vertebrados, utilizando técnicas de microinjeção e eletroporação. Tais métodos facilitar a genómica funcional neste invertebrados simples que apresenta características rudimentares de vertebrados, incluindo notocorda e na cabeça epitélio sensorial, e muitas orthologs da doença associada genes humanos.

Microinjeção de embriões e Eletroporação na cordados<em&gt; Intestinalis Ciona</em

Este artigo de vídeo detalha uma simples em metodologia in vivo que pode ser utilizado para caracterizar de forma eficiente e sistematicamente componentes de vias de sinalização complexas e redes reguladoras em muitos embriões de invertebrados.

O Poder da Simplicidade: Sea Urchin embriões<em&gt; Na Vivo</em&gt; Modelos de desenvolvimento para estudar células de células-complexo de sinalização de rede Interações

Este protocolo descreve uma estratégia optogenética para modular a atividade da proteína quinase ativada por mitógenos (MAPK) durante a diferenciação celular e o desenvolvimento embrionário de Xenopus . Este método permite a ativação reversível da via de sinalização MAPK na cultura de células de mamíferos e em organismos vivos multicelulares, como embriões Xenopus , com alta resolução espacial e temporal.

Modulação Reversível Mediada por Luz do Caminho Protein Quinaso Ativado por Mitogênio durante a Diferenciação Celular e<em&gt; Xenopus</em&gt; Desenvolvimento embrionário

Este protocolo demonstra como controlar uma translocação nuclear da proteína sob estresse de calor, usando uma fluorescência verde (GFP) de proteína proteína da fusão como um marcador e 4', 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) coloração. O DAPI protocolo de coloração é rápido e preserva os sinais de Localização subcellular GFP e proteína.

Detectar a localização Subcellular da proteína por marcação de proteína de fluorescência verde e 4' 6-Diamidino-2-phenylindole de coloração em Caenorhabditis elegans

Este protocolo tem como objetivo demonstrar como microinjetar uma mistura de DNA/DOTAP em olhos de embriões de um dia de idade Xenopus laevis , e como a imagem e reconstruir a proteína fluorescente verde individual (GFP) expressando mandris axonal óptica em mesencefálicas tectal de intacto, vivendo Xenopus Tadpoles.

Microinjection do ADN em Eyebuds em embriões do laevis de Xenopus e imagem latente de GFP que expressa Arbors axonal óticos em girinos intact, vivendo de Xenopus

Quantificação de DNA dupla fita-estrias usando formação γH2AX como um marcador molecular tornou-se uma ferramenta valiosa na biologia da radiação. Aqui mostramos o uso de um teste de imunofluorescência para a quantificação dos focos γH2AX após a exposição das células à radiação.

Quantificação de γH2AX Focos em resposta à radiação ionizante

Aprenda a visualizar a localização subcelular de proteínas em embriões de Xenopus usando microscopia de fluorescência. Este método permite estudar a polaridade celular e o controle espacial da sinalização em ectoderme.

Translocação polarizada de proteínas fluorescentes em Xenopus Ectodérmicas em resposta à sinalização Wnt

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