Translocação polarizada de proteínas fluorescentes em Xenopus Ectodérmicas em resposta à sinalização Wnt

O objetivo geral deste procedimento é examinar alterações na localização subcelular de proteínas após a sinalização por fatores de crescimento. Isso é realizado primeiramente injetando blastômeros animais de embriões iniciais de Xenopus com RNAs que codificam diversas proteínas marcadas com RFP e o receptor de sinalização FRIZZLED oito. Em seguida, são preparados implantes eletrodérmicos e/ou cortes criostáticos de embriões e realizada imunomarcação.

Por fim, as células imunomarcadas são visualizadas utilizando um microscópio fluorescente. Em última análise, podem-se obter resultados que mostram como a localização subcelular de proteínas específicas depende de vias de sinalização embrionárias. Como exemplo, demonstramos que a proteína DIVERSA é recrutada do centríolo para a membrana celular pelo receptor FRIZZLED OITO.

Este método permite aos pesquisadores visualizar a localização subcelular de proteínas sinalizadoras in vivo utilizando embriões de Xenopus. Isso pode ajudar a responder questões fundamentais na biologia do desenvolvimento e celular, como estudos sobre a regulação espacial de sinalização e mecanismos de prioridade celular. Para iniciar o processo de fertilização in vitro, obtenha óvulos de rãs fêmeas que foram injetadas com gonadotrofina coriônica humana.

Doze horas antes do experimento, adicione 0,5 a um mililitro de solução ringer modificada de Marx 1 X sobre os ovos e fertilize-os in vitro com um pequeno pedaço de testículo dissecado. Após dois a três minutos, reduza a concentração de sal com MMR 0,1 X para ativar a motilidade dos espermatozoides. Incube por 20 minutos.

Após a fertilização, os ovos orientam-se com seus polos animais voltados para cima. Remova a camada de gelatina dos ovos substituindo a solução MMR por uma solução de 3% de cisteína em água durante cinco minutos. Lave os ovos três vezes com MMR 0,1 X.

Incube a 13 graus Celsius até o estágio de duas a quatro células. Em seguida, transfira os embriões para 3%fi. Incube em 0,5 XMMR para microinjeção.

Sintetize RNAs a partir de modelos de DNA linearizado utilizando o kit M message M machine e dilua com água livre de RNAses até uma concentração de 0,1 a um micrograma por microlitro. Os RNAs para diversos marcadores, como o RFP citoplasmático, o marcador de membrana GFP CX e o FRIZZLED oito, são utilizados na concentração de 0,1 a um nanograma por injeção. Prepare as agulhas de injeção a partir de tubos capilares utilizando um puxador de agulhas e um afiador de agulhas antes da injeção.

Calibre cada agulha com água para ejetar 10 litros de líquido por injeção. Coloque os embriões sobre um prato de plástico em uma grande gota de 3% fial 0,5 XMMR. Aspire uma microlitro de solução de RNA em uma agulha de injeção com um microinjetor de shige estreito.

Injete 10 nanolitros de RNA em cada um dos dois blastômeros animais de embriões de duas células. Transfira os embriões injetados para um poço de uma placa de 12 poços e incube a 13 graus Celsius até que atinjam o estágio de gástrula inicial.

Transfira os embriões em estágio gástrula para uma solução de 0,6 XMMR em um recipiente plástico de seis centímetros de diâmetro revestido com 1% de agaros. Remova manualmente a membrana vitelina com pinça. Em seguida, utilize uma agulha de tsin e um laço de cabelo para excisar explantes de ectoderme dos embriões.

Fixe-os em formaldeído 3,7% em PBS por 30 minutos. Lave o X explan três vezes por 10 minutos cada em PBS. Para corar os núcleos, adicione davi à terceira lavagem.

Em seguida, monte o explante X em uma lâmina de vidro colocando-o entre duas tiras de fita adesiva transparente, com o lado interno não pigmentado do explante X voltado para a objetiva. Adicione duas a três gotas de 20 microlitros da solução de montagem. Coloque uma lamínula por cima.

Os embriões injetados podem ser seccionados por criomicrotomia para visualizar a distribuição de proteínas fluorescentes na célula e para realizar coloração com anticorpos específicos. Na fase 10, fixe os embriões por uma a duas horas à temperatura ambiente com fixador concentrado em um frasco de vidro de quatro mililitros. Em seguida, após lavagem em PBS, incorpore os embriões em uma solução de gelatina de peixe a 15% e sacarose a 15% no mesmo frasco.

No dia seguinte, transfira os embriões embutidos para uma forma de plástico. Congele rapidamente os embriões embutidos em gelo seco. Em seguida, prepare cortes criohistológicos utilizando um criostato.

Realize a coloração imunofluorescente nas seções, monte lâminas e visualize embriões em corte transversal utilizando o mesmo método descrito para implantes de ectoderme. Colete imagens usando um microscópio fluorescente Zeiss Axio plan com os filtros apropriados e aome para identificar e imagens planos Z específicos dentro do explante X. Nesta figura, a ersina está localizada no centríolo em células ectodérmicas, mas translocalizada para a membrana celular.

Em resposta à Frizzled oito, o cex GFP marca a membrana celular em verde. O Diverse em RFP está em vermelho, e os núcleos marcados com DPI estão em azul aqui. O Diverse em RFP é recrutado para a membrana celular pela Frizzled oito em cortes crioseccionados de embrião.

A tubulina gama é um marcador centrossomal. Após assistir a este vídeo, você deverá ter uma boa compreensão da utilidade dos embriões XUS e das células embrionárias para estudos de autorização de ancoragem de proteínas e processos de sinalização em resolução subsidiária.