Um sistema para a cultura de células epiteliais pigmentadas da íris para estudo da regeneração Lens em Newt
22 de junho de 2011
Em newt, a lente regenera sempre a partir da íris dorsal pela transdiferenciação das células epiteliais pigmentadas da íris (EPIs). Aqui nós descrevemos um procedimento para células de cultura dorsal e ventral newt IPE e sua implantação para o olho newt. As células são então implantados estudado por corte de tecido e imuno-histoquímica.
O objetivo geral deste procedimento é cultivar células do epitélio pigmentado da íris para estudar a regeneração do cristalino em nova. Isso é realizado primeiramente anestesiando-se a nova em uma solução anestésica, e em seguida removendo-se os olhos.
O segundo passo do procedimento é isolar as células epiteliais pigmentadas da íris a partir do tecido ocular, removendo primeiro o tecido retiniano, seguido pelo corte dos fragmentos da íris corneana em metades dorsal e ventral. As células da íris são então separadas do estroma e cultivadas in vitro por duas semanas. Após duas semanas de Turing, as células EPI são agregadas e então implantadas em um novo recipiente que foi lin optimiz.
Após um mês de cicatrização, a histologia revela o potencial de regeneração do cristalino pelas células da EPI dorsal e ventral. A demonstração visual deste método é essencial nas etapas de cultura celular e implante, difíceis de aprender porque exigem cerca de cem habilidades para microdissecção e cirurgias. Comece anestesiando pelo menos sete camundongos nus com 0,1% de etil aminobenzoato de metano sulfônico, remova cirurgicamente seus olhos utilizando pinça e tesoura cirúrgica, cortando a pálpebra juntamente com a conjuntiva. Em seguida, corte o nervo óptico.
Agora, transfira rapidamente os olhos dissecados para uma câmara de fluxo laminar e esterilize-os em etanol de Lugo por três segundos. Em seguida, lave os olhos duas vezes em solução de Hank livre de cálcio e magnésio. Transfira-os para Hank fresco e prossiga com a dissecação.
Usando um bisturi, faça uma incisão no olho. Em seguida, use tesoura para cortar ao redor da margem corneana. Remova a lente e corte o tecido retiniano remanescente junto com a esclera.
Transfira os complexos íris-corneanos para um recipiente com Hanks fresco usando um bisturi número 15. Separe os complexos em suas metades dorsal e ventral. As íris dorsal e ventral são identificadas pela presença de manchas pretas na esclera do lado dorsal e por um corte em forma de V na íris ventral.
Se pare o íris ventral e o íris dorsal. Colete os fragmentos do íris em uma placa de 35 milímetros contendo um mililitro de solução L 15. Mantenha as metades dorsal e ventral em placas separadas.
Agora, adicione 150 microlitros de solução dispa às placas e incube-as por duas horas a 27 graus Celsius. Para coletar células EPI do estroma. Com a ajuda de pinças, desprenda suavemente as células EPI de todos os fragmentos teciduais coletados.
Em seguida, transfira as células IPE para um tubo de 1,5 mililitro e centrifugue a 1000 RPM por dois minutos à temperatura ambiente, descartando o sobrenadante. Ressuspenda o pellet em um mililitro de solução de Hanks e repita a centrifugação para separar as células. Descarte a solução de Hanks e ressuspenda o pellet.
Em um mililitro de uma solução de tripsina 1:250, incubar por duas horas a 27 graus Celsius para lavar as células, centrifugar e remover a tripsina. Adicionar um mililitro de solução L 15 e centrifugar novamente, repetir a lavagem mais uma vez e substituir por 800 microlitros de solução L 15 fresca, e pipetar suavemente as células para colocá-las em suspensão. Em seguida, semear as células em placas de 24 poços revestidas com colágeno.
O rendimento habitual de sete Ns é de quatro poços de células dorsais e quatro poços de células ventrais. Incube o recipiente por duas semanas a 27 graus Celsius após duas semanas. Como mostrado aqui, o IPE pode ser transfectado com genes para examinar sua função na regeneração do cristalino.
Essa cultura de duas semanas de células IPE ventrais exibe a mesma morfologia que as células dorsais. Observe que a pigmentação persiste até esta fase tanto nas células da íris dorsal quanto nas ventrais. Antes de implantar as células IPE, elas devem ser agregadas pela adição de 20 microlitros de dyse em 400 microlitros de meio de cultura fresco às células, girar suavemente a placa e deixar as células durante a noite em uma incubadora a 27 graus Celsius.
No dia seguinte, utilize pipetagem suave para desprender as células e, em seguida, transfira-as para tubos de 1,5 mililitro; agora, lave as células centrifugando os tubos e substituindo o sobrenadante por um mililitro de L 15. Repita este passo duas vezes. Utilize 10 microlitros da suspensão celular para calcular a contagem de células utilizando métodos padrão.
Uma vez calculado, prepare de 3.000 a 5.000 células em 200 microlitros de L 15 por agregado. Agora, centrifugue as células e incube-as por 48 horas. A 27 graus Celsius, as células podem agora ser implantadas em um animal receptor.
Comece anestesiando um adulto novo na solução anestésica até que pare de se mover. Agora, use uma lâmina de bisturi para fazer um corte na córnea do olho. Em seguida, com o auxílio de uma pinça, remova a lente.
Após a remoção da lente, posicione o agregado de células da EPI logo abaixo do tecido corneano no lado ventral do olho. Agora, devolva a salamandra a um recipiente separado e permita que ela se recupere. Durante esse período, manipule a salamandra com cuidado para evitar danos ao tecido em cicatrização.
As células transplantadas precisam de um mês para se regenerar em uma nova lente. Após decorrido um mês, remova os novos olhos implantados com as células agregadas e fixe o tecido. Utilizando um protocolo padrão de desidratação, o material fixado pode ser embutido em moldes apropriados para cortes de 15 micrômetros, fatiados e corados adequadamente.
Após a implantação do agregado na região lenta do novo olho, o agregado proveniente das células da EPI dorsal induz a formação de uma nova lente. A indução da lente hospedeira a partir da íris dorsal também é observada no olho com o implante ventral. Nenhuma indução de lente é observada a partir do agregado preparado a partir das células da EPI ventral quando o gene six three está superexpresso; na presença de ácido retinóico, a indução de lente é observada a partir do agregado ventral.
Além disso, a indução da lente do hospedeiro a partir da íris dorsal do olho é observada após o seu desenvolvimento. Esta técnica abriu caminho para que pesquisadores na área de regeneração da lente explorassem o papel de diferentes genes em um novo contexto.
Visão Geral
Este estudo descreve um método para o cultivo de células do epitélio pigmentado da íris (IPEs) de tritões, com o objetivo de investigar a regeneração do cristalino. O procedimento envolve o isolamento e implante dessas células no olho do tritão, seguido de análise histológica para avaliar a formação do cristalino.
Componentes Principais do Estudo
Área da Ciência
- Neurociência
- Biologia Regenerativa
- Técnicas de Cultura Celular
Contexto
- As salamandras possuem a capacidade de regenerar lentes a partir de células do epitélio da íris dorsal.
- As células epiteliais pigmentadas da íris (IPEs) desempenham um papel crucial nesse processo de regeneração.
- Compreender os mecanismos da regeneração da lente pode fornecer insights para a medicina regenerativa.
- Estudos anteriores demonstraram o potencial das IPEs na formação da lente.
Objetivo do Estudo
- Desenvolver um método confiável para o cultivo de EPIs dorsais e ventrais de tritões.
- Investigar as capacidades de regeneração da lente dessas células cultivadas.
- Fornecer uma demonstração visual das técnicas de cultivo celular e implantação.
Métodos Utilizados
- Anestesia e remoção cirúrgica dos olhos de tritão.
- Isolamento de células do EPI a partir de fragmentos da íris dorsal e ventral.
- Cultura in vitro de células do EPI por duas semanas.
- Implante de células do EPI agregadas nos olhos receptores de tritão.
Resultados Principais
- A análise histológica revelou a regeneração bem-sucedida do cristalino a partir de implantes de EPI dorsal.
- Nenhuma indução do cristalino foi observada a partir de células de EPI ventral, a menos que genes específicos fossem superexpressos.
- O estudo demonstrou a importância dos EPIs dorsais na formação do cristalino.
- Células de EPI transfectadas mantiveram sua morfologia e pigmentação durante o cultivo.
Conclusões
- O método estabelecido é eficaz para estudar a regeneração do cristalino em salamandras.
- Pesquisas futuras podem explorar os fatores genéticos que influenciam a regeneração do cristalino.
- Essa técnica pode auxiliar na compreensão dos processos regenerativos em outras espécies.
Perguntas Frequentes
Relevância Executiva para a Indústria
Este método permite a desmistificação mecanicista das vias de regeneração do cristalino ao fornecer um sistema in vitro reprodutível para investigar a função de células epiteliais pigmentadas da íris dorsal versus ventral. Ele apoia a validação de alvos em biologia regenerativa ao isolar variáveis que governam a capacidade de transdiferenciação. O sistema oferece valor preditivo para a priorização de alvos genéticos e moleculares em etapas pré-clínicas de descoberta.
Aplicações Estratégicas em P&D de Biotecnologia Farmacêutica
Descoberta Inicial e Validação de Alvo
- Valor Científico: Avalia hipóteses terapêuticas por meio do teste da capacidade de formação de lentes de células IPE dorsais e ventrais cultivadas.
- Valor Operacional: Permite a desaceleração biológica por meio de ensaios de reagregação e implante que recapitulam o potencial de regeneração in vivo.
- Valor Preditivo: Apoia a triagem de portfólios ao identificar quais manipulações genéticas restauram a função regenerativa em agregados de células IPE ventrais.
Triagem e Desenvolvimento de Ensaios
- Prontidão para ensaio: Produz agregados de IPE padronizados adequados para triagem de compostos ou genética em um sistema relevante para a doença.
- Saída quantitativa: Permite a medição da indução da lente como leitura funcional após implantação e cicatrização.
- Escalabilidade: Permite o uso de placas de múltiplos poços e fluxos de trabalho de agregação para testes paralelos de condições experimentais.
Pesquisa Translacional e Pré-clínica
- Relevância para Doenças: Modela um processo regenerativo com polaridade dorsal-ventral clara, oferecendo insights sobre sinais posicionais na reparação tecidual.
- Continuidade Translacional: Conecta achados de culturas in vitro a resultados in vivo por meio da validação histológica da formação da lente.
- Redução de Riscos Mecanísticos: Esclarece as contribuições específicas de genes para a regeneração, como o papel do six3 e do ácido retinóico na reprogramação do IPE ventral.
Integração de Pipeline e Fluxo de Trabalho
O método se insere na continuidade entre descoberta e pré-clínico ao permitir a validação orientada por hipóteses de alvos de regeneração antes de se comprometer com a otimização de compostos líderes ou estudos de eficácia pré-clínicos.
- Biologia da Descoberta: Apoia a elucidação de vias ao isolar células EPI para testar o potencial de transdiferenciação em condições controladas.
- Triagem: Fornece agregados quantitativos e reprodutíveis para avaliar modificadores genéticos ou farmacológicos da regeneração do cristalino.
- Análises: Gera pontos finais histológicos que permitem comparar a capacidade regenerativa entre grupos experimentais.
- Pesquisa Translacional: Conecta fenótipos in vitro à restauração tecidual in vivo, apoiando decisões de avanço com ajuste de risco.
- Reutilização Empresarial: Estabelece uma plataforma reutilizável para estudar mecanismos de regeneração sob múltiplas perturbações genéticas ou ambientais.
Impacto Operacional e Empresarial
- Valor Científico: Fornece insights mecanicistas sobre a plasticidade das células da íris e reduz a ambiguidade na validação de alvos para regeneração.
- Valor Operacional: Oferece procedimentos padronizados e escalonáveis de cultura celular e implante, com prazos definidos de cultura de duas semanas e cicatrização de um mês.
- Valor Estratégico: Melhora decisões de prosseguir ou interromper projetos ao confirmar se intervenções moleculares restauram a função regenerativa em tipos celulares não permissivos.
- Impacto no Portfólio: Permite a priorização ajustada ao risco de alvos com base em sua capacidade de induzir a formação da lente em agregados de EPI ventral.
Considerações sobre a Implementação
- Requer experiência em microcirurgia, dissecação de tecidos e manipulação estéril de células para o isolamento e agregação da íris.
- Depende de placas revestidas com colágeno, meio L15, tripsina e reagentes de dissociação para obter um rendimento consistente de células do epitélio pigmentado da íris (IPE).
- Necessita de protocolos padronizados de agregação utilizando corante e incubação controlada para garantir a formação reprodutível de pelotas.
- Exige experiência em processamento histológico e seccionamento para avaliar os resultados da regeneração do cristalino um mês após a implantação.
- Limitado pela disponibilidade de espécimes de tritão e pelo desafio técnico da separação dorsal-ventral da íris com base em marcos anatômicos.
