Name: Uma simples gota de suspensão Protocolo Cultura de Células para a geração de esferóides 3D (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-05-06T16:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 24 s
Description: Aprenda a gerar esferoides 3D semelhantes a tecidos usando o método de gotas suspensas em cultura celular. Esta técnica rápida permite avaliar interações célula-célula em biologia celular e engenharia de tecidos.

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O autor gostaria de agradecer ao Dr. Dongxuan Jia para assistência técnica. Algumas das imagens que aparecem neste artigo foram em colaboração com o Dr. Malcolm S. Steinberg, Departamento de Biologia Molecular, Universidade de Princeton. O autor também gostaria de agradecer ao Departamento de Defesa Programa de Pesquisa em Câncer de Próstata (subvenções PC-030482-991552 e PC) e os de NCI / NIH (concessão R01CA118755) seu apoio generoso.

1. Preparação de uma suspensão de células Único <ol><li> Culturas de células aderentes devem ser cultivadas a confluência de 90%, quando então monocamadas devem ser lavados duas vezes com PBS. Depois de drenar bem, adicionar 2 ml (para 100 placas mm) de 0,05% de tripsina-EDTA 1 mM, e incubar a 37 ° C até que as células detach. Parar tripsinização adicionando 2 ml de meio completo e gentilmente usar uma pipeta de 5 ml para triturar a mistura até que as células estão em suspensão. Transferência de células para um tubo de 15 ml. </li><li> Adicionar 40 mL de uma 10 mg / ml DNAse estoque e incubar por 5 minutos em temperatura ambiente. Brevemente Vortex e centrifugar a 200 xg por 5 minutos. </li><li> Elimine o sobrenadante e lavar pellet com 1 ml completa meio de cultura de tecidos. Repita, então as células ressuspender em 2 ml de meio completo de cultura de tecidos. </li><li> Contar as células usando um hemocitômetro, ou contador de células automatizado e ajustar a concentração para 2,5 x 10 6 células / ml. Para esta demonstração BioRad um contador de células automatizado TC10 foi usado. </li></ol> 2. Formação de gotas de suspensão. <ol><li> Remova a tampa de um prato de 60 milímetros de cultura de tecidos e coloque 5 ml de PBS no fundo do prato. Este funcionará como uma câmara de hidratação. </li><li> Inverter a tampa e use uma pipeta 20 l para depositar 10 gotas mL para o fundo da tampa. Certifique-se que gotas são colocadas suficientemente distante para não tocar. É possível colocar pelo menos 20 gotas por prato. </li><li> Inverter a tampa do PBS-cheia câmara inferior e incubar a 37 ° CO C / 5% 2 / 95% de umidade, monitorar as gotas diárias e incubar até folhas ou células ou agregados formaram. Um microscópio estéreo pode ser usado para avaliar a formação de agregados. </li><li> Uma vez que formam folhas, podem ser transferidos para fundo redondo de vidro shaker frascos contendo 3 ml de meio completo e incubados em um agitador banho maria a 37 ° C e 5% CO 2 até formar esferóides. </li></ol> 3. Notas <ol><li> Dependendo do tamanho da célula, a concentração pode precisar de ser ajustado para cima ou para baixo. </li><li> As células podem ser marcadas com corantes fluorescentes membrana intercalando antes da formação gota suspensa. </li><li> Dois tipos de células diferentes podem ser diferencialmente manchada e misturado na proporção de 1:1 (ou outro) antes da formação de gotas de suspensão. Estes podem ser câncer e estroma células, tecidos embrionárias, ou células geneticamente modificados para ter as assinaturas adesivo específico. </li><li> As células podem ser separados de pratos de cultura de tecidos utilizando tripsina 0,05% / 2 mM de cálcio para preservar a função caderina. </li><li> Dependendo do experimento, tamanhos de folha pode ser medido, ou agregados pode ser usado para ensaios mecânicos ou por análise bioquímica ou molecular. </li></ol> 4. Resultados representativos: Folha ou formação esferóide normalmente ocorre no prazo de 24 horas, mas pode demorar mais dependendo do tipo de célula. A Figura 1 representa as imagens capturadas após 18 horas de incubação de câncer de próstata não tratado MAT-LyLu (MLL) células em suspensão cultura gota (Figura 1A) ou células tratadas com 25 mm inibidor MEK PD98059. Note-se que os resultados do tratamento Meki em uma compactação marcadas da camada de células. Compactação pode ser quantificado através da medição do tamanho de 10-20 (ou mais) pendurado cai e comparando tamanho médio entre os grupos de tratamento. Normalmente, analisar imagens utilizando o software ImageJ por thresholding cada imagem, em seguida, converter imagens para o modo binário, após o que aplicar a análise de partículas para revelar a área total da imagem em pixels. Isto pode ser facilmente convertida em microns quadrados. A Figura 2 apresenta uma comparação de tamanho para as células não tratadas e Meki MLL-tratada. Como se observa, o tratamento reduz significativamente Meki tamanho da folha em comparação de Student t-test (P &lt;0,0001). Para esta comparação, 10 agregados para cada uma das células tratadas e não tratadas foram medidos. A Figura 3 representa um pintinho esferóide fígado embrionário formado após 24 horas pendurado em cultura queda e dois dias em um banho de shaker. O ensaio de gota em suspensão também pode ser modificado para incluir mais de um tipo de célula para revelar o posicionamento espacial adotada. Por exemplo, células do fígado pinto embrionárias podem ser isoladas, marcadas com um corante fluorescente intercalando membrana e misturado com células embrionárias do coração de galinha que foram marcadas com um marcador fluorescente diferentes. Mostra a figura 4A, que ao invés de permanecer misturados, as células do fígado e do coração tendem a "resolver" a partir de um outro e adotar uma esfera-dentro-de uma esfera de configuração em que as células cardíacas são envolvidas por células do fígado. Esta configuração pode ser explicada por diferenças na adesão intercelular entre células do fígado e coração. Este conceito é codificada na Hipótese de Adesão diferencial que tem sido usada para explicar o comportamento de células de classificação entre o tecido embrionário germe camada de anfíbios 3 e 4 teleost embriões, células pancreáticas para a organização das ilhotas 5 e para a célula de classificação entre duas populações de células idênticas in todos os outros aspectos do que para os níveis de expressão do mesmo tipo de caderina (6 e Figura 4B). Este resultado é particularmente importante para demonstrar como a engenharia uma simples diferença na adesão entre populações de células pode resultar na geração de estrutura do órgão, por exemplo, uma das ilhotas pancreáticas 5. <img src="/files/ftp_upload/2720/2720fig1.jpg" alt="Figura 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 1"> Figura 1. Imagens de células incubadas em cultura queda pendurado por 18 horas ou, na ausência (A) ou presença (B) de 25 mm do inibidor de MEK PD98059. As imagens foram captadas com uma Nikon Eclipse TE 300 e um microscópio de epifluorescência fotométricos CoolSnap ES câmera digital. <img src="/files/ftp_upload/2720/2720fig2.jpg" alt="Figura 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 2"> Figura 2. Quantificação de Meki induzida compactação de ratos células cancerígenas da próstata MLL. Culturas gotas de suspensão de células não tratadas e Meki MLL-tratados foram incubados por 18 horas whereupon tamanho agregado foi determinado como descrito acima. Análise estatística do tamanho de agregados foi por teste t de Student. O asterisco representa uma diferença estatisticamente significativa no tamanho do agregado (P &lt;0,0001) entre as células não tratadas e tratadas com Meki e sugere que os resultados Meki-tratamento em agregados significativamente menores e mais compactos. <img src="/files/ftp_upload/2720/2720fig3.jpg" alt="Figura 3" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 3"> Figura 3. Um esferóide formada pela incubação de células embrionárias de fígado em pinto pendurado cultura queda para 18 horas, em seguida, em uma incubadora / agitação do banho por 48 horas. Esta imagem foi capturada com um microscópio estéreo Nikon SMZ800 e um Sony Preto câmera CCD. <img src="/files/ftp_upload/2720/2720fig4.jpg" alt="Figura 4" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 4"> Figura 4. Hanging cultura queda revela-out de classificação de comportamento entre diferentes tipos celulares. No painel A, as células do fígado pinto embrionárias foram coradas com PKH-2 da membrana corante intercalando e misturados em proporções iguais com PKH-26 manchado pinto células cardíacas embrionárias. No painel B, dois N-caderina-transfectadas clones L celular (LN4 e LN2a), expressando N-cad em suas superfícies na proporção de 2,4:1, também foram coradas com os corantes fluorescentes membrana intercalando PKH-2 e PKH-26 , (Sigma-Aldrich), misturados em proporções iguais e culta como a suspensão de gotas 7. Após 18 horas de cultura, folhas de células foram transferidas para frascos de agitação e incubadas por mais 48 horas. Agregados foram fixadas em paraformaldeído 2% em tampão fosfato e visto com um sistema de digitalização a laser BioRad MRC600 microscópio confocal acoplada a um microscópio Nikon Optiphot-2. Secções ópticas de ambos os canais verde e vermelho foram coletados e uma estação de trabalho Silicon Graphix Carmesim VGX equipado com Imagens Vital Voxel Ver Ultra software de imagem foi usado para atribuir falsa cor para ambos os canais e fundir as imagens, revelando as configurações anatômicas geradas. (A) secção óptica confocal através de um envolvimento total das células do coração demonstrando (aqui em uma cor amarelo-pseudo) pelas células do fígado em pseudo-azul (de 8). (B) seção Confocal óptica através de um envolvimento total demonstrando alta de N-caderina células que expressam (verde) por aqueles que expressam os níveis mais baixos de N-caderina (vermelho) (de 6).

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</ol>

Não há conflitos de interesse declarados.

Estudos têm demonstrado que a cultura de células em um contexto tridimensional (3D) produz morfologia celular e sinalização distintas quando comparado a um rígido sistema de cultura de duas dimensões (2D) 9. Por exemplo, géis de fibroblastos de colágeno povoadas demonstram que a morfologia de fibroblastos em 3D é bastante distinta da observada em 2D 10,11. Da mesma forma, a cultura 3D pode induzir a diferenciação de tecidos específicos de células epiteliais mamárias. Sistemas de cultura 3D têm sido...

<ul><li> contador automático de células (BioRad TC10) </li><li> tremendo banho de água com CO 2 Modelo cobrir gable 3540 (Lab-line) </li></ul>

uma simples gota de suspensão protocolo cultura de células para a geração de esferóides 3d

A Simple Hanging Drop Cell Culture Protocol for Generation of 3D Spheroids

Estudos de célula-célula e célula substrato coesão-adesão têm sido historicamente realizados em culturas de monocamada aderente sobre substratos rígidos. Células dentro de um tecido, no entanto, normalmente são encerrados dentro de uma massa de tecido de forma compacta em que as células estabelecer conexões íntimas com muitas quase-vizinhos e com componentes da matriz extracelular. Assim, o meio químico e forças físicas experimentadas por células dentro de um tecido 3D são fundamentalmente diferentes do que aqueles experimentados por células cultivadas em cultura em monocamada. Isto tem sido demonstrado que marcadamente impacto morfologia celular e sinalização. Vários métodos têm sido desenvolvidos para gerar culturas de células em 3D, incluindo encapsulamento de células em géis de colágeno ou em um biomaterial andaimes 2. Tais métodos, embora úteis, não recapitular a arquitetura de adesão íntima direto célula-célula encontrada em tecidos normais. Ao contrário, eles mais de perto os sistemas aproximados de cultura em que as células individuais são frouxamente dispersas dentro de uma malha 3D de produtos ECM. Aqui, descrevemos um método simples em que as células são colocadas em cultura pendurado queda e incubados em condições fisiológicas, até que a verdadeira forma esferóides 3D em que as células estão em contato direto uns com os outros e com componentes da matriz extracelular. O método não requer equipamento especializado e pode ser adaptado para incluir a adição de qualquer agente biológico em quantidades muito pequenas que podem ser do seu interesse na elucidação efeitos sobre célula-célula ou célula-ECM interação. O método também pode ser usado para co-cultura dois (ou mais) diferentes populações de células, de modo a elucidar o papel das interações célula-célula ou célula-ECM na especificação de relações espaciais entre as células. Célula-célula e célula coesão ECM-adesão são os pilares dos estudos de desenvolvimento embrionário interação celular, tumor de estroma na invasão maligna, cicatrização de feridas, e para aplicações de engenharia de tecidos. Este método simples irá fornecer um meio de gerar tecido celular-como agregados para a medição de propriedades biomecânicas ou para análise molecular e bioquímica em um modelo fisiologicamente relevantes.

Nós descrevemos um método simples e rápida de gerar tecido 3D-como esferóides e sua potencial aplicação para quantificar as diferenças de interações célula-célula.

Uma simples gota de suspensão Protocolo Cultura de Células para a geração de esferóides 3D

Estudos de coesão célula-célula e de adesão célula-substrato foram historicamente realizados em culturas de monocamada aderentes a substratos rígidos. As células ...

O objetivo deste experimento é gerar tecidos tridimensionais semelhantes a esteroides. Isso é realizado primeiramente colhendo células cultivadas e, em seguida, gerando uma suspensão unicelular. Em seguida, gotas da suspensão celular são depositadas na face inferior da tampa invertida de uma placa de cultura de tecidos.Em seguida, a tampa é invertida sobre a câmara de hidratação. O passo final é incubar as gotas suspensas por 24 a 48 horas para permitir a formação de agregados. Estes podem então ser transferidos para um banho-maria agitado e incubados por até mais cinco dias.No final, podem ser obtidos resultados que mostram diferenças na coesão de agregados ou na organização celular por meio de ensaios de compactação, microscopia de superfície de tecido 10 simetria ou microscopia de fluorescência epi. A principal vantagem dessa técnica em relação a métodos existentes, como o cultivo convencional de tecidos em 2D, por exemplo, é que as células cultivadas em 3D imitam mais fielmente as interações celulares vivenciadas pelas células em um ambiente tecidual. Vou demonstrar este método para mostrar a vocês que é tão simples que até um pesquisador principal pode realizá-lo.Para iniciar este experimento, colete células aderentes em 90% de confluência. Primeiro, aspire o meio de cultura e lave a camada celular duas vezes com PBS. Em seguida, aspire o PBS e pipete dois mililitros de tripsina a 0,05% com solução de EDTA sobre a monocamada.Coloque a placa no incubador de cultura de tecidos a 37 graus Celsius e incube até que as células se desprendam. Em seguida, retire a placa do incubador e interrompa a desnização. Adicionando dois mililitros de meio completo.Use uma pipeta de cinco mililitros para tritar a mistura até que as células estejam completamente em suspensão. Em seguida, transfira a suspensão celular para um tubo cônico de 15 mililitros. Pipete 40 microlitros de uma solução de DNA a 10 miligramas por mililitro para dentro da suspensão celular e incube-a em temperatura ambiente por cinco minutos após a incubação.Vortexe brevemente a suspensão celular e, em seguida, centrifugue a 200 vezes a gravidade por cinco minutos. Após a conclusão da centrifugação, aspire o sobrenadante S e descarte-o, depois ressuspenda o pellet em um mililitro de meio completo para lavagem. Repita a centrifugação e ressuspenda o pellet em um mililitro de meio completo.Em seguida, realize uma contagem celular utilizando um contador celular automatizado ou um hemocitômetro. Ajuste a suspensão celular com meio até uma concentração final de 2,5 × 10⁶ células por mililitro. Em seguida, prossiga para a formação de gotas suspensas.Prepare uma câmara de hidratação removendo a tampa de uma placa de cultura de tecidos de 60 milímetros e pipetando cinco mililitros de PBS no fundo da placa. Inverta a tampa da placa e pipete gotas de até 2010 microlitros de suspensão celular na parte inferior da tampa. Certifique-se de que as gotas sejam colocadas suficientemente separadas para não entrarem em contato.Substitua cuidadosamente a tampa contendo os cultivos em gota sobre a base da placa contendo PBS. Coloque a placa de cultivo em uma incubadora de cultura de tecidos, ajustada a 37 graus Celsius, 5% de dióxido de carbono e 95% de umidade, e incube durante a noite.Monitore as gotas diariamente e continue a incubação até que folhetos celulares ou agregados se formem. Uma vez formados os folhetos celulares ou agregados, transfira-os para frascos de vidro cônicos contendo três mililitros de meio completo. Incube os frascos contendo os folhetos celulares ou agregados em banho-maria agitado.Mantido a 37 graus Celsius e 5% de dióxido de carbono por aproximadamente 24 horas, até que a formação de esteroides possa ser visualizada ao microscópio estereoscópico. Uma vez formados os esteroides, o efeito de manipulações experimentais sobre a formação de esteroides pode ser quantificado de acordo com o procedimento descrito no protocolo escrito. Além disso, a intercalação na membrana de corantes fluorescentes previamente incluídos pode agora ser visualizada utilizando microscopia de fluorescência.Esta imagem de microscopia de campo claro demonstra a agregação de células de câncer de próstata de rato MLL após 18 horas de incubação utilizando o método de gota suspensa. Esta imagem mostra um segundo agregado de células MLL formado após 18 horas de cultivo utilizando o método de gota suspensa. Essas células foram cultivadas na presença de 25 micromolar do inibidor da MEK PD 9 8 0 5 9, resultando em um agregado celular substancialmente mais compacto.Aqui, é demonstrada a diferença entre o cultivo em gota suspensa de MLL tratado com inibidor de MEK, o tamanho do agregado e o tamanho do controle não tratado. O asterisco representa uma diferença estatisticamente significativa com P menor que 0,0001. Conforme determinado pelo teste t de Student entre agregados não tratados e tratados com inibidor de MEK, isso sugere que o tratamento com inibidor de MEK resulta em agregados significativamente menores e mais compactos.Esta imagem foi capturada usando um microscópio estereoscópico Nikon Smz 800 e ilustra um esteroide formado pelo incubamento de células hepáticas de embrião de galinha em cultura de gota suspensa por 18 horas. Em seguida, em banho-maria agitado a 37 graus Celsius por 48 horas. Esta imagem de microscopia confocal demonstra o comportamento de separação que ocorre quando certas populações celulares são cultivadas em co-cultura utilizando o método de gota suspensa; antes de prosseguir para a cultura de gota suspensa, as células hepáticas de embrião de galinha foram coradas com o corante interno de membrana pkh dois e embrião de galinha.As células cardíacas foram coradas com PKH 26. As suspensões celulares foram então misturadas e colocadas em gota suspensa. O cultivo foi realizado por 18 horas, seguido por 48 horas de incubação em banho-maria agitado a 37 graus Celsius.Pode-se observar na seção óptica que as células cardíacas coradas em amarelo estão envolvidas por células hepáticas. Coradas artificialmente em azul aqui, dois nardis e clones de células L transfectadas que expressam NCA em suas superfícies. Na proporção de 2,4 para 1, foram coradas com os corantes fluorescentes de membrana PKH2 e PKH26, misturados em proporções iguais, e cultivadas como gotas suspensas como anteriormente.Neste exemplo, as células que expressam níveis elevados de cadian, coloridas artificialmente de verde, são envolvidas por aquelas que expressam níveis mais baixos de en cadian, coloridas artificialmente de vermelho. Uma vez dominada, esta técnica pode ser realizada em 30 minutos ou menos, se for executada corretamente.

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Research

JoVE Journal

Bioengineering

Bioengenharia

Os esferoides são um tipo de modelo de cultura de células 3D usado para representar com mais precisão o ambiente de uma célula em comparação com os modelos de monocamada de cultura de células 2D. No protocolo de exemplo, veremos os cientistas gerarem esferóides a partir de uma linha de células de câncer colorretal e aplicarem imagens de células vivas para rastrear o crescimento dos esferoides.

Geração de esferóides a partir de linhagens celulares: um método de cultura celular tridimensional (3D)

Este vídeo descreve a técnica de geração de esferoides tridimensionais por meio do método de gota suspensa usando células de melanoma. O modelo esferóide de melanoma organotípico tridimensional (3D) gerado in vitro pode retratar a arquitetura in vivo do melanoma maligno e pode fornecer informações sobre as interações intratumorais.

Método de gota suspensa: uma técnica para gerar esferoides de melanoma 3D

Este método avalia a invasão de células cancerígenas de esferóides em uma matriz 3D circundante.  Os esferoides são gerados através do método de cultura de gota suspensa e, em seguida, incorporados em uma matriz composta de materiais de membrana basal e colágeno tipo I.  A invasão dos esferóides é posteriormente monitorada.

A Cancer Cell Spheroid Ensaio para avaliar a invasão em um ambiente 3D

Aqui, descrevemos um protocolo rápido e flexível para a formação de esferoides de células 3D por meio da agregação celular. Isso é facilmente adaptado a vários tipos de células e é adequado para uso em uma variedade de aplicações, incluindo ensaios de migração celular, invasão ou anoikis, e para imagens e quantificação de interações célula-matriz.

Um Método celular agregação eficiente e flexível para 3D Spheroid Produção

Este protocolo descreve a geração de spheroids paciente-derivados, e a análise a jusante que inclui a quantificação da proliferação, do teste da citotoxicidade, da citometria do fluxo, da coloração da imunofluorescência e da imagem latente confocal, a fim avaliar a medicina potencial dos candidatos como terapêutica antineoplásica. Este protocolo suporta a medicina da precisão com identificação de drogas específicas para cada paciente e estágio da doença.

Spheroids 3D derivados do paciente fisiológico para a seleção antineoplástica da droga para alvejar pilhas de haste do cancro

Aqui, nós apresentamos diversos métodos simples para avaliar a viabilidade e a morte em spheroids da pilha de cancro 3D, que imitam os gradientes physico-químicos de tumores in vivo muito melhor do que a cultura 2D. O modelo esferóide, portanto, permite a avaliação da eficácia do câncer de drogas com melhor tradução para as condições in vivo.

Avaliando a viabilidade celular e morte em 3D culturas esferóides de células cancerosas

Apresentamos um dispositivo microfluídico centrífuga movido a motor que pode cultivar esferóides celulares. Usando este dispositivo, esferóides de tipos de células únicas ou múltiplas podem ser facilmente coculturados condições de alta gravidade.

Plataforma lab-on-a-CD para geração de esferóides tridimensionais multicelulares

O presente protocolo descreve uma técnica para produzir esferoides de tecido em larga escala de forma econômica usando um dispositivo semelhante a um selo impresso em 3D.

Geração de esferoides de tecido por meio de um dispositivo semelhante a um selo impresso em 3D

Apresentamos um protocolo para o cultivo de esferoides de alta reprodutibilidade e sua caracterização fenotípica usando captura de imagens e proteômica.

Análise Fenotípica Semi-Automatizada de Culturas Funcionais de Células Esferoides 3D

Este estudo apresenta uma metodologia econômica e eficiente para gerar estruturas celulares 3D usando um sistema baseado em carimbos para criar micropoços em moldes de agarose. O sistema promove a formação de esferóides/organoides uniformes, melhorando assim as interações celulares. Essa abordagem reduz a variabilidade experimental e oferece suporte a aplicações em testes de medicamentos e engenharia de tecidos.

Geração de esferoides/organoides tridimensionais a partir de culturas de células bidimensionais usando um novo dispositivo de carimbo

Aprenda a gerar esferoides 3D semelhantes a tecidos usando o método de gotas suspensas em cultura celular. Esta técnica rápida permite avaliar interações célula-célula em biologia celular e engenharia de tecidos.

Uma simples gota de suspensão Protocolo Cultura de Células para a geração de esferóides 3D

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