Uma simples gota de suspensão Protocolo Cultura de Células para a geração de esferóides 3D

O objetivo deste experimento é gerar tecidos tridimensionais semelhantes a esteroides. Isso é realizado primeiramente colhendo células cultivadas e, em seguida, gerando uma suspensão de células únicas. Em seguida, gotas da suspensão celular são depositadas na face inferior da tampa invertida de uma placa de cultura de tecidos.

Em seguida, a tampa é invertida sobre a câmara de hidratação. O passo final é incubar as gotas suspensas por 24 a 48 horas para permitir a formação de agregados. Estes podem então ser transferidos para um banho-maria agitado e incubados por até mais cinco dias.

Por fim, podem ser obtidos resultados que mostram diferenças na coesão de agregados ou na organização celular por meio de ensaios de compactação, microscopia de superfície de tecido 10 simetria ou microscopia de fluorescência epi. A principal vantagem dessa técnica em relação a métodos existentes, como o cultivo convencional de tecidos em 2D, por exemplo, é que as células cultivadas em 3D imitam mais fielmente as interações celulares vivenciadas pelas células em um ambiente tecidual. Vou demonstrar este método para mostrar a vocês que ele é tão simples que até um pesquisador principal pode realizá-lo.

Para iniciar este experimento, colete células aderentes com 90% de confluência. Primeiro, aspire o meio de cultura e lave a camada celular duas vezes com PBS. Em seguida, aspire o PBS e pipete dois mililitros de tripsina a 0,05% com solução de EDTA sobre a monocamada.

Coloque a placa no incubador de cultura de tecidos a 37 graus Celsius e incube até que as células se desprendam. Em seguida, retire a placa do incubador e interrompa a desnização. Adicionando dois mililitros de meio completo.

Utilize uma pipeta de cinco mililitros para triturar a mistura até que as células estejam completamente em suspensão. Em seguida, transfira a suspensão celular para um tubo cônico de 15 mililitros. Pipete 40 microlitros de uma solução de DNA a 10 miligramas por mililitro para dentro da suspensão celular e incube-a em temperatura ambiente por cinco minutos após a incubação.

Vortexe brevemente a suspensão celular e, em seguida, centrifugue a 200 vezes a gravidade durante cinco minutos. Após a conclusão da centrifugação, aspire o sobrenadante S e descarte-o, depois ressuspenda o pellet em um mililitro de meio completo para lavagem. Repita a centrifugação e ressuspenda o pellet em um mililitro de meio completo.

Em seguida, realize uma contagem celular utilizando um contador celular automatizado ou hemocitômetro. Ajuste a suspensão celular com meio até uma concentração final de 2,5 vezes 10 à sexta células por mililitro. Em seguida, prossiga para a formação de gotas suspensas.

Prepare uma câmara de hidratação removendo a tampa de uma placa de cultura de tecidos de 60 milímetros e pipetando cinco mililitros de PBS no fundo da placa. Inverta a tampa da placa e pipete gotas de até 2010 microlitros de suspensão celular na parte inferior da tampa. Certifique-se de que as gotas sejam colocadas suficientemente separadas para não se tocarem.

Substitua cuidadosamente a tampa contendo os cultivos em gota sobre a base da placa contendo o PBS. Coloque a placa de cultivo em uma incubadora de cultura de tecidos, ajustada a 37 graus Celsius, 5% de dióxido de carbono e umidade de 95%, e incube durante a noite.

Monitore as gotas diariamente e continue a incubação até que folhetos celulares ou agregados se formem. Após a formação de folhetos celulares ou agregados, transfira-os para frascos de vidro cônicos contendo três mililitros de meio completo. Incube os frascos contendo os folhetos celulares ou agregados em banho-maria agitado.

Mantido a 37 graus Celsius e 5% de dióxido de carbono por aproximadamente 24 horas, até que a formação de esteroides possa ser visualizada ao microscópio estereoscópico. Uma vez formados os esteroides, o efeito de manipulações experimentais sobre a formação de esteroides pode ser quantificado de acordo com o procedimento descrito no protocolo escrito. Além disso, a intercalação na membrana de corantes fluorescentes previamente incluídos pode agora ser visualizada utilizando microscopia de fluorescência.

Esta imagem de microscopia de campo claro demonstra a agregação de células de câncer de próstata de rato MLL após 18 horas de incubação utilizando o método de gota suspensa. Esta imagem mostra um segundo agregado de células MLL formado após 18 horas de cultivo utilizando o método de gota suspensa. Essas células foram cultivadas na presença de 25 micromolar do inibidor da MEK PD 9 8 0 5 9, resultando em um agregado celular substancialmente mais compacto.

Aqui, é demonstrada a diferença entre o cultivo em gota suspensa de MLL tratado com inibidor de MEK, o tamanho do agregado e o tamanho do controle não tratado. O asterisco representa uma diferença estatisticamente significativa de P menor que 0,0001. Conforme determinado pelo teste t de Student entre agregados não tratados e tratados com inibidor de MEK, isso sugere que o tratamento com inibidor de MEK resulta em agregados significativamente menores e mais compactos.

Esta imagem foi capturada utilizando um microscópio estereoscópico Nikon Smz 800 e ilustra um esteroide formado pelo incubamento de células hepáticas de embrião de galinha em cultura de gota suspensa por 18 horas. Em seguida, em banho-maria agitado a 37 graus Celsius por 48 horas. Esta imagem de microscopia confocal demonstra o comportamento de separação que ocorre quando certas populações celulares são cultivadas em co-cultura utilizando o método de gota suspensa; antes de prosseguir para a cultura de gota suspensa, as células hepáticas de embrião de galinha foram coradas com o corante interno de membrana pkh dois e embrião de galinha.

As células cardíacas foram coradas com PKH 26. As suspensões celulares foram então misturadas e colocadas em gota suspensa. O cultivo foi realizado por 18 horas, seguido por 48 horas de incubação em banho-maria agitado a 37 graus Celsius.

Pode-se observar na seção óptica que as células cardíacas coradas em amarelo estão envolvidas por células hepáticas. Coradas artificialmente em azul aqui, dois nardis e clones de células L transfectadas expressando NCA em suas superfícies. Na proporção de 2,4 para um, foram coradas com os corantes fluorescentes de membrana PKH2 e PKH26, misturados em proporções iguais, e cultivadas como gotas suspensas, como antes.

Neste exemplo, as células que expressam níveis elevados de cadian, coloridas artificialmente de verde, são envolvidas por aquelas que expressam níveis mais baixos de en cadian, coloridas artificialmente de vermelho. Uma vez dominada, esta técnica pode ser realizada em 30 minutos ou menos, se for executada corretamente.