Name: Pressurização impulsivo de células neuronais de Estudos Traumático Brain Injury (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-10-12T12:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 24 s
Description: Aprenda a pressurização impulsiva de células neuronais para estudar lesão cerebral traumática usando o dispositivo Kolsky bar. Este método controlado permite investigar danos celulares e mecanismos de lesão.

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Os autores gostariam de agradecer as fontes de financiamento: Exército-UNL Centro de Mecânica Trauma (DoD / ARO, # W911NF-11-1-0033, PI: Dr. Chandra Namas), Prêmio Layman UNL (26-1110-0033 -001 , PI: Lim).

1. Cultura Celular Neuronal <ol><li> As células do cérebro, incluindo células neuronais, astrócitos e a sua co-cultura pode ser utilizado como um modelo de célula. Como uma demonstração de viabilidade, pressurização impulsivo de células da linha de células neuronais é apresentado. </li><li> SH-Sy5y células de neuroblastoma humano (ATCC, CRL-2266) são cultivadas em lamelas de vidro 18 mm de diâmetro. As células são semeadas a uma densidade de 3 x 10 3 células / cm 2, usando os meios de crescimento composto por DMEM suplementado com 10% de soro fetal bovino e 1% de penicilina-estreptomicina. Lâminas de vidro de células em cultura são mantidas em 5% de CO 2 incubador humidificado a 37 ° C. </li><li> Para obter a diferenciação de células neuronais de células SH-Sy5y, as células são tratadas com meio suplementado com mais de 10 uM de ácido retinóico (AR) durante 7 dias com meio mudado a cada dois dias. No dia 7, as células estão prontas para ser pressurizado. </li></ol> 2. Equipamento de pressurização: Kolsky Bar <ol><li> A barra de Kolsky, dedesenvolvido pela Kolsky 1 em 1949, tem sido utilizado para medir a propriedade mecânica de um material, a uma taxa de carregamento muito elevada. O aparelho é constituído por duas barras com uma amostra colocada em contacto entre as barras. Uma onda de tensão, criada na barra incidente, se propaga para a amostra, onde a onda se divide em uma onda reflectida e transmitida. A tensão da amostra é proporcional à onda transmitida. No presente estudo, nós utilizamos uma câmara de pressurização da célula a ser colocado entre as duas barras da Kolsky set-up. </li><li> As duas barras de liga de alumínio (cada comprimento de 6 m) estão suspensos por chumaceiras de bronze alinhados, e uma câmara de pressurização in vitro de células é colocado entre as barras. O bar é o bar a montante incidente com uma massa 130 lb presa em uma extremidade. Um grampo de fricção é colocado numa posição em que vai dar a duração do impulso desejada. Ao envolver-se a braçadeira de aperto e um macaco tesoura entre a massa e um suporte de carga, a secção de aperto de massa da barra de incidente é pré-compressed para o nível desejado. Forçar um parafuso entalhado que trava o grampo para uma ruptura brusca com um sistema hidráulico libera a compressão pré-armazenados rapidamente e, assim, gera um impulso de pressão. Esta propaga-se através da barra incidente, acciona o êmbolo da câmara de teste, e pressuriza o fluido e as células dentro da câmara de impulso. A pressurização da câmara, por sua vez inicia uma pressão de pulso de propagação a jusante da barra de transmissão. As estirpes associadas com os impulsos de pressão das barras são medidos com medidores de compostos de alta resistência de tensão excitado a 45 volts. Os sinais de calibre são gravados com um osciloscópio digital na freqüência de 1 MHz, como uma história de carregamento. </li><li> In vitro a câmara de pressurização da célula é constituída por um êmbolo do cilindro. O cilindro tem 2,6 cm de diâmetro interno e 3,8 cm de diâmetro exterior, e tem um pequeno orifício aproveitado na base da cavidade. O orifício serve de ar de ventilação e o excesso de líquido da amostra durante a instalação da célula. O pistão é de 7,5 cm de comprimentoe é feita a partir do material de barra mesmo. O pistão é envolvido com duas a três camadas de fita de encanador (Teflon), que servem como selo de baixo atrito. A tampa de extremidade é de 32 mm de comprimento e tem dois pequenos parafusos de aço inoxidável que fixam as lamelas de vidro (no qual as células são cultivadas), durante o carregamento. </li></ol> 3. Pressurização impulsivo de células neuronais <ol><li> Todas as peças da câmara de pressurização são esterilizados utilizando a autoclave e são mantidos sob luz UV. A montagem da câmara é realizada no interior da capa de cultura de células. O parafuso de purga na câmara é fracamente envolvida na entrada de ar na base da cavidade. Pré-aquecido (37 ° C) de meio de crescimento fresco é pipetada para dentro da câmara, sem fazer bolhas. Em seguida, uma lâmina de vidro de células de cultura é recolhida, e é colocado sobre a tampa do êmbolo (células voltados para fora). Os pequenos parafusos que prendem são apertados para o slide para segurá-la no lugar. O êmbolo com uma lâmina de vidro de células cultivadas é inserido um pequeno into da cavidade da câmara, e o conjunto é inclinado com a abertura estar no ponto mais alto. O parafuso de purga é removida e o pistão é empurrado para dentro da primeira cavidade obrigando as bolhas de ar, em seguida, o excesso de líquido. Ou uma marca de referência ou um gabarito é utilizado como um guia para assegurar o mesmo volume de meio de cultura para cada teste. A dimensão axial da mídia na câmara é de cerca de 6 mm. Higienizar o parafuso de purga e substituí-lo para fazer a água da câmara apertado. A câmara não deve vazar sob esta carga estática, se isso acontecer, o envoltório Teflon precisa ser substituídos ou reforçados. </li><li> Neste ponto, o sistema de barra Kolsky é reposto. A massa pesada é transferida de volta para a posição original e um parafuso de travamento novo substitui o utilizado (quebrado) um. O trinco de bloqueio novo com o sistema hidráulico para cerca de 200 psi. Usar a tomada de uma tesoura para comprimir a secção de pré-carregamento da barra incidente, até um pouco de pressão mais elevado do que o valor desejado, e depois voltar-off para envolver o atrito total doparafuso de Jack. A aquisição de dados agora está armado. </li><li> A câmara de pressurização da célula montada é montado no sistema. Ela é colocada num bloco V suportada pela pequena tesoura jack laboratório e em linha com as duas barras. Unte cada interface com uma camada de graxa leve e esfregar as superfícies cabeçadas em conjunto para eliminar as lacunas de ar entre eles. </li><li> O teste está agora pronto para prosseguir. O parafuso de fixação braçadeira é forçado a quebrar rapidamente por bombear o motorista pinça hidráulica. A braçadeira vai separar e a aquisição de dados deve exibir os resultados. A história de pressurização da célula é determinada a partir das medições do calibre bar transmitida. Se a barra de transmissão utilizada é suficientemente longo, este deve ser apenas a partir da primeira perturbação para o ponto em que as medições mostram uma pressão negativa. A duração do pulso transmitido pode ser mais curto do que o impulso de acidente, se a bolha está preso. A magnitude pode não atingir a do pulso incidente, mas deve ter uma lon suficientementeg planalto antes da descarga. Caso contrário, quer uma bolha de ar grande na câmara selada ou um desalinhamento entre o conjunto e uma barra pode ter ocorrido. </li><li> A câmara de pressurização da célula é então removido e desmontado no interior da capa de cultura de células. O parafuso de purga é removido e o êmbolo é puxado livre da câmara. A lâmina de vidro de células de cultura é tomada a partir da extremidade do êmbolo. </li></ol> 4. Avaliando o comportamento das células pressurizada <ol><li> Após a pressurização, as células podem ser inspeccionadas imediatamente ou ainda incubada para posterior exame. Com processos adequados de operação de assepsia, de longo prazo pós-incubação é possível. </li><li> Células sob pressão pode ser examinado por todas as técnicas de biologia molecular e celular. Especificamente para a pressurização da célula neuronal, para investigar a fisiologia celular e molecular, em condições de TBI, os ensaios de avaliação de pressão induzidas por alterações no crescimento de neurites, a mudança de microtúbulos do citoesqueleto neuronal, Expre genession apoptose, etc, pode ser realizada. Como amostras de controlo de células, as células que são cultivadas na mesma, mantida no interior da câmara de pressurização para o mesmo período de tempo, mas não pressurizado são utilizados (assim chamada, câmara de controlo). </li><li> Para avaliar as alterações no crescimento de neurites, as células de controlo submetidas a pressão e da câmara são examinadas por microscópio óptico imediatamente após a pressurização e 1 e 24 h de pós-incubação. Um exemplo de imagens de células neuronais são mostrados na seção "Resultados representativos" (Figura 2). A mudança de comprimento de neurites pode ser quantificado por coloração imunofluorescente actina e análise de imagem. As células são fixadas com uma solução de paraformaldeído a 4% w / v, lavou-se com um 0,05% v / v de Tween-20 tampão de lavagem, e permeabilizadas com um v / v 0,1% de Triton X-100 a solução. Após o bloqueio com um w / v de bovino a 1% solução de albumina de soro, as células são incubadas com o isotiocianato de tetrametilrodamina (TRITC)-faloidina conjugada. Imagens de imunofluorescência das células são colhidas utilizando um fluorescentemicroscópio e os comprimentos das neurites de células pressurizados e de controlo são quantificados utilizando o software ImageJ (NIH). </li><li> As neurites pode ser identificado como axônios ou dendritos. Para avaliar as alterações morfológicas nos axônios ou dendritos, os experimentos acima descritos podem ser repetidos, utilizando anticorpos de detecção de cada estrutura, ou seja, um anticorpo de neurofilamento (NF) para axónios e do microtúbulo associado à proteína de anticorpo (MAP2) para dendrites. </li><li> Os microtúbulos são um dos principais componentes do citoesqueleto de neurónios, e os danos aos microtúbulos tem sido utilizada como marcador de lesão neuronal. Microtúbulos 2 pode ser visualizada usando o anticorpo imunofluorescência β-tubulina. As células são fixadas após 0 e 24 h de pós-pressurização, coradas com anticorpo β-tubulina, e observadas ao microscópio de fluorescência. </li><li> Para avaliar o efeito da pressurização impulsiva na expressão do gene neuronal apoptótica e, de ARN total é extraído a partir de células submetidas a pressão e de controlo. Genexpressão e pode ser examinado através da realização de RT-PCR quantitativo em tempo real ou RT-PCR, semelhante aos nossos protocolos publicados. 3 </li></ol> 5. Resultados representativos: <img src="/files/ftp_upload/2723/2723fig1.jpg" alt="Figura 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 1"> Figura 1. Um exemplo de perfil de pressão aplicada às células no interior da câmara de pressurização. O aparelho bar Kolsky sucesso gera nível 2 MPa, um único pulso de pressurização tipo impulsivo, com uma duração de cerca de 0,7 ms. <img src="/files/ftp_upload/2723/2723fig2.jpg" alt="Figura 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 2"> Figura 2. Um exemplo de resposta de células neuronais de pressurização impulsivo. SH-Sy5y células expostas a pressurização impulsivo a 2 MPa mostra colapso neurite / axon distinta em relação às células de controlo da câmara. 6. Dificuldades e Soluções <ol><li> Câmara de vedação é um dos principais obstáculos a serem superados. É found que os discos de largura, com o-rings tem um problema de cinzelamento e atrito maior. A fim de eliminar os efeitos de fricção, bem como evitar cinzelamento, um simples método de gravação do pistão com a fita de Teflon canalizador é usado. Isto resolve os problemas e produz o nível de pressão desejado e duração. </li><li> Comportamento da célula neuronal pressurizado, especialmente quando se avalia mecanismo TCE secundário ou efeitos a longo prazo, deve ser examinada depois de um tempo pós-incubação longo. A câmara contendo as células é exposto a condições potencialmente não esterilizadas enquanto se move para a barra Kolsky, pressurizando, e movendo-se para trás para o capuz de cultura de células. Com a esterilização prévia das partes da câmara e do funcionamento apropriado de montagem / desmontagem da corrediça de células cultivadas e câmara no interior da capa de cultura de células, de longo prazo pós-incubação é possível até várias semanas. </li><li> A reprodutibilidade dos dados é um parâmetro importante em celulares experiências de estimulação mecânica. Para o nosso dispositivo, o reproducibility em resposta celular neuronal é determinada como desejado perfil de pressurização impulsivo, nos dois níveis de pressão e duração, é repetidamente obtidos. Uma vez que o perfil de pressão gravar obtido para cada pressurização, os dados de resposta de células a partir de perfil de pressão não desejada pode ser manualmente excluída depois. </li><li> As etapas de pressurização inteiras, incluindo a montagem da câmara de transferência e montar na barra Kolsky, a pressurização, a transferência de recurso, e a desmontagem da câmara, ter menos de 10 min. A corrediça próxima célula de cultura pode ser pressurizado imediatamente após a pressurização anterior. Assim, um número suficiente de experiências de pressurização pode ser completado de forma eficiente. O nosso set-up utiliza 18 milímetros lamínulas de diâmetro. Um experimento pressurização não fornece proteínas suficientes para inmunotransferência devido ao tamanho do substrato (e também em parte por causa de algumas das células submetidas a pressão são mortos). Cerca de três experimentos de pressurização repetidas fornecer quantidade de proteína necessária para immunoblOtting. Mais uma vez, a reprodutibilidade é verificada cada vez com o perfil de pressão. </li></ol>

<ol><li>Kolsky, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+investigation+of+mechanical+properties+of+materials+at+very+high+rates+of+loading%5BTitle%5D)+AND+%22Prec.+Phys.+Soc.+London%22%5BJournal%5D)">An investigation of mechanical properties of materials at very high rates of loading.</a> Prec. Phys. Soc. London. 62, 676-700 (1949).</li>
<li>Tang-Schomer, M. D., Patel, A. R., Baas, P. W., Smith, D. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanical+breaking+of+microtubules+in+axons+during+dynamic+stretch+injury+underlies+delayed+elasticity%2C+microtubule+disassembly%2C+and+axon+degeneration%5BTitle%5D)+AND+%22FASEB.+J%22%5BJournal%5D)">Mechanical breaking of microtubules in axons during dynamic stretch injury underlies delayed elasticity, microtubule disassembly, and axon degeneration.</a> FASEB. J. 24, 1401-1410 (2010).</li>
<li>Lim, J. Y., Taylor, A. F., Li, Z., Vogler, E. A., Donahue, H. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Integrin+expression+and+osteopontin+regulation+in+human+fetal+osteoblastic+cells+mediated+by+substratum+surface+characteristics%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue.+Eng%22%5BJournal%5D)">Integrin expression and osteopontin regulation in human fetal osteoblastic cells mediated by substratum surface characteristics.</a> Tissue. Eng. 11, 19-29 (2005).</li>
<li>Chen, Y. C., Smith, D. H., Meaney, F. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+approaches+for+studying+blast-induced+traumatic+brain+injury%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurotrauma%22%5BJournal%5D)">In vitro approaches for studying blast-induced traumatic brain injury.</a> J. Neurotrauma. 26, 861-876 (2009).</li>
<li>Ling, G., Bandak, F., Armonda, R., Grant, G., Ecklund, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Explosive+blast+neurotrauma%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurotrauma%22%5BJournal%5D)">Explosive blast neurotrauma.</a> J. Neurotrauma. 26, 815-825 (2009).</li>
<li>Shepard, S. R., Ghajar, J. B. G., Giannuzzi, R., Kupferman, S., Hariri, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluid+percussion+barotrauma+chamber%3A+a+new+in+vitro+model+for+traumatic+brain+injury%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Surg.+Res%22%5BJournal%5D)">Fluid percussion barotrauma chamber: a new in vitro model for traumatic brain injury.</a> J. Surg. Res. 51, 417-424 (1991).</li>
<li>VandeVord, P. J., Leung, L. Y., Hardy, W., Mason, M., Yang, K. H., King, I. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Up-regulation+of+reactivity+and+survival+genes+in+astrocytes+after+exposure+to+short+duration+overpressure%5BTitle%5D)+AND+%22Neurosci.+Lett%22%5BJournal%5D)">Up-regulation of reactivity and survival genes in astrocytes after exposure to short duration overpressure.</a> Neurosci. Lett. 434, 247-252 (2008).</li>
<li>Huang, H., Feng, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+study+of+the+dynamic+tribological+response+of+closed+fracture+surface+pairs+by+Kolsky-bar+compression-shear+experiment%5BTitle%5D)+AND+%22Int.+J.+Solids.+Struct%22%5BJournal%5D)">A study of the dynamic tribological response of closed fracture surface pairs by Kolsky-bar compression-shear experiment.</a> Int. J. Solids. Struct. 41, 2821-2835 (2004).</li>
<li>Song, B., Chen, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Split+Hopkinson+pressure+bar+techniques+for+characterizing+soft+materials%5BTitle%5D)+AND+%22Lat.+Am.+J.+Solids.+Struct%22%5BJournal%5D)">Split Hopkinson pressure bar techniques for characterizing soft materials.</a> Lat. Am. J. Solids. Struct. 2, 113-152 (2005).</li>
</ol>

Não há conflitos de interesse declarados.

Muitas das técnicas experimentais in vitro têm sido tentadas para estudar os danos das células cerebrais em condições de TCE. Estes incluem neurônio / astrócitos alongamento, tensão de escoamento induzido cisalhamento, queda de peso, laceração caneta, laser transecção, litotripsia, etc 4,5 Assumiu-se que de curta duração sobre pressão é um fator dominante física para TCE. 6,7 Especialmente , a onda de choque da explosão TCE tem uma duração de pulso de uma ordem de milissegundos. 4 Com base neste pressuposto e observação, câmara barômetro capaz de pressurização transiente foi desenvolvido e utilizado para avaliar o comportamento de células do cérebro em condições de TCE. Por exemplo, no fluido de percussão barotrauma câmara de um impulso de pressão com 20-30 ms de duração longa e um pico de pressão de até 0,5 MPa foi usada para examinar o comportamento de células glial humana sob o TCE. 6 Recentemente, VandeVord et al. 7 metal usado bola câmara barômetro marcante para examinar a célula astrócitoscomportamento sob TCE, mas a bola de metal dramáticas produzidas pulsos de pressão múltiplos. No presente estudo, nós desenvolvemos um dispositivo de pressurização novel célula que gera um único pulso de pressurização tipo impulsivo. O dispositivo foi desenvolvido com base na barra de Kolsky configuração, que tem sido utilizado como um aparelho de ensaio de materiais em nossos 8 e de outros estudos. 1,9 O bar Kolsky da capacidade de teste de material em taxa de carga muito elevada foi modificado para ser capaz de aplicar um único pulso de sobrepressão tipo para as células de cultura no interior da câmara de pressurização (Figura 1). Poderíamos conseguir controlar a magnitude e duração da sobrepressão impulsivo. Como uma resposta das células representativo, foi demonstrado que a 2 MPa de pressão SH-Sy5y células neuronais exibir neurite significativo e perda axonal, em comparação com células de controlo não pressurizados de câmara. Em conclusão, foi desenvolvido um novo aparelho de pressurização impulsivo célula usando um Kolsky especialmente concebidodispositivo bar e demonstrou seu potencial para utilização em investigar a resposta celular neuronal em condições de TCE. Observamos também que esta técnica é muito versátil na medida em que qualquer tipo de células podem ser expostas a pressões impulsivas em níveis diferentes e duração. Portanto, o dispositivo pode ser usado para investigar o impulsivo pressão induzida comportamento mecanotransdução celular, não só para ferir as células, mas também para estimular as células positivamente na sua função e determinação destino.

<ul><li> SH-Sy5y (ATCC, CRL-2266), as células de neuroblastoma humano </li><li> 18 lamínulas mm de diâmetro </li><li> Meios de cultura de células: DMEM, 10% de soro fetal bovino, 1% de penicilina-estreptomicina </li><li> Ácido retinóico (10 mM) para induzir a neurogénese </li><li> Kolsky barra de dispositivo de pressurização impulsivo </li><li> Pistão-cilindro de câmara de pressurização da célula </li><li> Parafusos de aço inoxidável para proteger lamela células cultivadas no pistão </li><li> Graxa para interfaces entre células na câmara e bar Kolsky </li><li> Gerais de biologia molecular suprimentos para avaliar a resposta de células de pressurização (fixador, anticorpo, corante fluorescente, o abastecimento de PCR, etc) </li></ul>

pressurização impulsivo de células neuronais de estudos traumático brain injury

Impulsive Pressurization of Neuronal Cells for Traumatic Brain Injury Study

Um experimento de pressurização romance impulsivo celular foi desenvolvido utilizando um dispositivo de bar Kolsky para investigar explosão induzida por traumatismo crânio-encefálico (TCE). Demonstramos neste artigo de vídeo como a pressurização explosão TBI-impulsivo relevante é aplicada às células neuronais in vitro. Isto é conseguido através da utilização bem controlada pulso de pressão criado por um dispositivo especializado Kolsky bar, com história completa da pressão no interior da câmara de pressurização da célula registada. Pressurizados células neuronais são inspeccionadas imediatamente após a pressurização, ou ainda incubadas para examinar os efeitos a longo prazo de pressurização impulsivo sobre neurite / axonal outgrowth, a expressão do gene neuronal, apoptose, etc observou-se que a pressurização impulsivo a cerca de 2 MPa relativos induz perda distinta neurite de células não pressurizados. A nossa técnica proporciona um método novo para investigar os mecanismos moleculares / celulares de explosão TBI, através de pressurização impulsivo de células cerebrais em bem controlada prEssure magnitude e duração.

Um experimento de pressurização romance impulsivo celular foi desenvolvido utilizando um dispositivo de bar Kolsky para investigar os mecanismos moleculares / celulares da explosão induzida lesão cerebral traumática.

Pressurização impulsivo de células neuronais de Estudos Traumático Brain Injury

Um novo experimento de pressurização impulsiva de células foi desenvolvido utilizando um dispositivo de barra de Kolsky para investigar a lesão cerebral traumática (LCT) induzida por blasto.

O objetivo geral deste procedimento é administrar e observar a pressurização impulsiva de células cerebrais cultivadas para o estudo de lesão cerebral traumática. Isso é realizado primeiramente induzindo a diferenciação neuronal de células cultivadas com ácido retinóico. Em seguida, as células neuronais são colocadas no dispositivo de pressurização celular baseado no ksky bar e expostas a pressão impulsiva com magnitude e duração relevantes para lesão cerebral traumática induzida por explosão.Por fim, as células são submetidas a ensaios de biologia molecular para avaliar danos celulares e possíveis mecanismos de lesão cerebral traumática. Os resultados da inspeção por microscopia mostram morte celular neuronal e perda estrutural dos neuritos axonais com pressurização impulsiva de magnitude de dois megapascal e duração de 0,7 milissegundo. A principal vantagem desta técnica em relação aos métodos existentes, como a percussão por fluido, é a ausência de fases de pressão negativa e o controle preciso da duração do tempo.Este método pode ajudar a responder perguntas fundamentais na área de lesão cerebral traumática (TBI), como o limiar para morte ou lesão de células neurais em função da pressão impulsiva, magnitude, duração e forma de carregamento. Embora este método tenha sido usado até agora em nosso grupo para estudar TBI induzida por explosão, ele também pode ser aplicado a outros tipos de lesão cerebral traumática, como TBI induzida por impacto. O procedimento será demonstrado por Matthew, um estudante de pós-graduação do Laboratório da Professora Chen fang, e por li ha, uma técnica do meu laboratório.Este experimento utiliza um conjunto de barras Ksky montado como um aparelho de pressurização celular. O aparelho consiste em duas barras de liga de alumínio com seis metros, suspensas por mancais de latão alinhados, com uma câmara de pressurização celular in vitro. Situada entre as barras, a câmara de pressurização celular é composta por um cilindro com pistão.O cilindro possui um pequeno furo roscado na base da cavidade, que durante a instalação da amostra celular permite a saída de ar e fluido em excesso. O pistão é feito do mesmo tubo que a barra e é envolto com duas ou três camadas de fita de teflon. A tampa final fixa as lamínulas de vidro com dois pequenos parafusos de aço inoxidável.Esta demonstração utiliza células de neuroblastoma humano SH-SY5Y. No entanto, o protocolo é aplicável a diversos modelos celulares em cultura. As células são semeadas em lamínulas de vidro com 18 milímetros de diâmetro, numa densidade de 3000 células por centímetro quadrado.No DMEM suplementado, enquanto incuba as células, induza sua diferenciação suplementando o meio com ácido retinóico 10 micromolar por sete dias, com a troca do meio a cada dois dias. No sétimo dia, as células apresentam uma estrutura bem desenvolvida de neuritos e axônios e estão prontas para serem pressurizadas. Esterilize todas as partes da câmara de pressurização usando uma autoclave e armazene-as sob luz UV enquanto monta a câmara.Em uma câmara de cultura, certifique-se de que o parafuso de ventilação esteja levemente encaixado na ventilação de ar. Na base da cavidade, preencha a câmara com meio de crescimento morno recém-preparado. Em seguida, parafuse uma lâmina de vidro com células cultivadas na tampa do pistão, com as células voltadas para fora, e carregue cuidadosamente o pistão na cavidade da câmara.Remova o parafuso de ventilação, incline a ventilação para cima e empurre o pistão para dentro da câmara até uma linha de referência previamente determinada. Isso deixa cerca de seis milímetros de profundidade de fluido dentro da câmara de pressurização da célula. Evite introduzir bolhas, sanitize o parafuso de ventilação e recoloque-o para tornar a câmara estanque à água.A câmara não deve apresentar vazamentos sob carga estática. Reconfigure o sistema da barra Ksky. Retorne a massa pesada para sua posição original e substitua o parafuso de travamento.O parafuso de travamento exerce uma força de aperto que impede o movimento da barra incidente até que os pinos sejam rompidos. Acople o novo parafuso de travamento com o macaco hidráulico até cerca de 200 PSI. Use o macaco de tesoura para comprimir a seção de pré-carregamento da barra incidente até uma pressão um pouco superior ao valor desejado e, em seguida, alivie a pressão para acionar totalmente o atrito do parafuso JAK. Agora configure a aquisição de dados, pois a pressurização ocorre em cerca de um milissegundo.Defina uma frequência de amostragem de um megahertz usando extensômetros de 2000 ohms em um circuito de ponte de Wheatstone. A tensão deve ser ajustada para 45 volts na barra transmissora. Monte a câmara da célula com o pistão voltado para a barra transmissora.Coloque a câmara celular em um bloco em V suportado pelo suporte de tesoura de laboratório pequeno e alinhe com as duas barras. Lubrifique levemente cada interface e elimine qualquer ar entre as superfícies em brotamento, esfregando-as suavemente uma contra a outra. Agora o sistema está preparado.Arme a aquisição de dados e realize o teste bombeando rapidamente o atuador hidráulico do grampo. Isso força o parafuso de travamento a se romper, fazendo com que o grampo se separe e uma onda de pressão seja transmitida às células. Após o teste, remova a lâmina da câmara em uma cabine de cultura e prossiga com a avaliação do comportamento celular.Com experiência, o aparelho pode ser usado para pressurizar cerca de nove lâminas de cultivo celular por hora. Ao analisar o sinal obtido, erros por bolhas de ar podem ser observados no início do sinal da barra transmitida, porém não são vistos nesta demonstração.Se a barra de transmitância for longa o suficiente, então os dados mais importantes devem começar com a primeira perturbação e terminar onde as medições indicam uma pressão negativa; essa leitura de tensão é proporcional à tensão sofrida pelas células por meio da análise com extensômetro. A duração do pulso transmitido pode ser menor do que a do pulso incidente. Se uma pequena bolha ficar aprisionada no fluido dentro da câmara de pressurização celular, a magnitude do pulso transmitido pode não exceder a do pulso incidente, mas deve apresentar uma plataforma suficientemente longa antes da descompressão.Caso contrário, uma grande bolha de ar pode ficar aprisionada na câmara selada ou a montagem e a barra podem estar desalinhadas. Após a pressurização, as células podem ser inspecionadas imediatamente ou incubadas por mais tempo para exames posteriores. Compare as células pressurizadas com as células controle da câmara, que foram tratadas de maneira idêntica, mas não submetidas à pressurização, para avaliar alterações no comprimento dos neuritos por microscopia óptica em diferentes pontos temporais pós-incubação.A coloração imunofluorescente da actina pode ser usada para avaliar alterações no citoesqueleto. Também é possível utilizar anticorpo contra a proteína associada aos microtúbulos dois. A MAP dois pode ser utilizada para visualizar alterações em um dos principais marcadores neuronais.Para avaliar o efeito da pressurização impulsiva sobre a expressão gênica neuronal e apoptótica, utilize técnicas padrão de biologia molecular, como a R-T-P-C-R, se desejado. Pode-se coletar lisados celulares suficientes para imunoblotagem a partir de várias amostras celulares submetidas à mesma pressão. Neste exemplo, o perfil de pressurização, com o equipamento ksky bar, aplicou com sucesso um único pulso impulsivo de dois megapascal, com duração de cerca de 0,7 milissegundo, sobre células neuronais cultivadas, conforme observado nas imagens de microscópio óptico. Células neuronais humanas SHSY cinco Y, submetidas à pressão impulsiva de dois megapascal, apresentam ruptura acentuada dos neuritos e axônios em comparação com as células-controle não despressurizadas.Ao realizar este procedimento, você sempre deve segurar a câmara de pressurização do fluido desta forma e nunca assim, pois isso submeterá as células a uma pressão negativa após o seu desenvolvimento. Esta técnica abriu caminho para que os pesquisadores na área de neurociência explorassem o mecanismo celular da lesão cerebral traumática sob condições controladas de pressurização em próstata. Agradecemos o apoio financeiro do Centro de Mecânica do Trauma da UNL do Exército.

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Research

JoVE Journal

Bioengineering

Bioengenharia

Este vídeo demonstra o procedimento para induzir uma lesão cerebral traumática de crânio aberto em um camundongo, fazendo uma incisão na linha média do crânio, perfurando o crânio e removendo a aba óssea para expor o córtex cerebral e aplicando alta pressão para induzir trauma. A ferida é então suturada para preparar o modelo de camundongo para experimentos subsequentes.

Gerando um modelo de camundongo com lesão cerebral traumática usando uma sonda impactadora

In vitro estão sendo desenvolvidos modelos de lesões cerebrais traumáticas para reproduzir in vivo deformação cerebral. Estiramento lesão induzida tem sido utilizada para neurónios, astrócitos, células da glia, da aorta e células endoteliais cerebrais. No entanto, nosso sistema utiliza a barreira hemato-encefálica (BBB), modelo que possui propriedades que constituem um modelo legítimo do BBB para estabelecer um modelo TBI vitro.

Estique em células cerebrais endoteliais microvasculares (cEnd) como um<em&gt; In Vitro</em&gt; Modelo de lesão cerebral traumática do cérebro Barreira Hemato

Lesões cerebrais traumáticas (TCEs) continuam sendo um sério problema de saúde. Utilizando o modelo de cirurgia de impacto cortical controlado, pesquisas sobre os efeitos do TCE e possíveis métodos de tratamento podem ser realizadas.

Controlado Modelo Impact Cortical para lesão cerebral traumática

Este artigo descreve um novo modelo de traumatismo crânio-encefálico explosão primária. Um tubo de choque conduzido de ar comprimido é usado para expor em vitro culturas hippocampal fatia de rato a uma única onda de choque. Este é um protocolo simples e rápido, gerando uma lesão de tecidos do cérebro podem ser reproduzidos com um alto throughput.

Um modelo de romance In Vitro de explosão traumatismo crânio-encefálico

Aqui, apresentamos um protocolo para descrever métodos para ex vivo determinação de reatividade vascular após uma lesão cerebral traumática de explosão primária (bTBI) usando segmentos arterial cerebral meio isolado, pressurizado, roedores (MCA). bTBI indução é realizada usando um tubo de choque, também conhecido como um dispositivo avançado explosão Simulator (ABS).

Efeitos de Neurotrauma induzida por explosão em roedores pressurizado artérias cerebrais de médio

Aqui nós apresentamos um protocolo para induzir o TBI severo com o modelo fluido lateral da lesão de percussão (FPI) em ratos adultos, machos de Wistar. Também demonstramos o uso de um sistema de telemetria sem fio para coletar gravações contínuas de vídeo-EEG e monitorar as descargas epileptiformes consistentes com a epileptogênese pós-traumática.

Uso de um sistema de vídeo-EEG sem fio para monitorar descargas epileptiformes após lesão cerebral traumática induzida por fluido-percussão lateral

Aqui nós descrevemos um protocolo para a indução de ferimento de cérebro traumático murino através de um impacto cortical controlado da abrir-cabeça.

Modelo murino de impacto cortical controlado para a indução de traumatismo cranioencefálico

Apresentamos aqui um protocolo de um modelo de onda de explosão para roedores para investigar efeitos neurobiológicos e fisiodicos de lesão cerebral traumática leve a moderada. Estabelecemos uma configuração de banco-topo, movida a gás, equipada com sensores de pressão, permitindo uma geração confiável e reprodutível de lesão cerebral traumática leve a moderada induzida por explosão.

Modelo de onda de explosão de baixa intensidade para avaliação pré-clínica de lesão cerebral traumática leve de cabeça fechada em roedores

Hemorragia intraparenquimatosa e neuroinflamação acompanhadas de contusão cerebral podem desencadear lesão cerebral secundária grave. Este protocolo detalha um modelo de impacto cortical controlado por camundongos (CCI), permitindo que os pesquisadores estudem a contusão por hemorragia e respostas imunes pós-traumáticas e explorem possíveis terapêuticas.

Um modelo pré-clínico de impacto cortical controlado para hemorragia traumática, contusão e neuroinflamação

Aqui são apresentados métodos para produzir exposições repetidas a explosões de baixa intensidade usando camundongos.

Modelagem de exposição a explosões de baixo nível altamente repetitiva em camundongos

Este protocolo descreve um sistema de ar de sobrepressão personalizado projetado para induzir lesões do sistema nervoso central (SNC) do sistema fechado em camundongos, incluindo traumas oculares, cerebrais e da medula espinhal. O objetivo deste protocolo é fornecer uma estrutura para que os pesquisadores adaptem e expandam facilmente o sistema para seus estudos exclusivos de trauma do SNC.

Sistema para lesão do sistema nervoso central focal e fechado

Aprenda a pressurização impulsiva de células neuronais para estudar lesão cerebral traumática usando o dispositivo Kolsky bar. Este método controlado permite investigar danos celulares e mecanismos de lesão.

Pressurização impulsivo de células neuronais de Estudos Traumático Brain Injury

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