Pressurização impulsivo de células neuronais de Estudos Traumático Brain Injury

O objetivo geral deste procedimento é administrar e observar a pressurização impulsiva de células cerebrais cultivadas para o estudo de lesão cerebral traumática. Isso é realizado primeiramente induzindo a diferenciação neuronal de células cultivadas com ácido retinóico. Em seguida, as células neuronais são colocadas no dispositivo de pressurização celular baseado no ksky bar e expostas a pressão impulsiva com magnitude e duração relevantes para lesão cerebral traumática induzida por explosão.

Por fim, as células são submetidas a ensaios de biologia molecular para avaliar danos celulares e possíveis mecanismos de lesão cerebral traumática. Os resultados da inspeção por microscopia mostram morte celular neuronal e perda estrutural dos neuritos axonais com pressurização impulsiva de magnitude de dois megapascal e duração de 0,7 milissegundo. A principal vantagem desta técnica em relação aos métodos existentes, como a percussão por fluido, é a ausência de fases de pressão negativa e o controle preciso da duração do tempo.

Este método pode ajudar a responder perguntas fundamentais na área de lesão cerebral traumática (TBI), como o limiar para morte ou lesão de células neurais em função da pressão impulsiva, magnitude, duração e forma de carregamento. Embora este método tenha sido usado até agora em nosso grupo para estudar TBI induzida por explosão, ele também pode ser aplicado a outros tipos de lesão cerebral traumática, como TBI induzida por impacto. O procedimento será demonstrado por Matthew, um estudante de pós-graduação do Laboratório da Professora Chen fang, e por li ha, uma técnica do meu laboratório.

Este experimento utiliza um conjunto de barras Ksky montado como um aparelho de pressurização celular. O aparelho consiste em duas barras de liga de alumínio com seis metros, suspensas por mancais de latão alinhados, com uma câmara de pressurização celular in vitro. Situada entre as barras, a câmara de pressurização celular é composta por um cilindro com pistão.

O cilindro possui um pequeno furo roscado na base da cavidade, que durante a instalação da amostra celular permite a saída de ar e fluido em excesso. O pistão é feito do mesmo tubo que a barra e é envolto com duas ou três camadas de fita de teflon. A tampa final fixa as lamínulas de vidro com dois pequenos parafusos de aço inoxidável.

Esta demonstração utiliza células de neuroblastoma humano SH-SY5Y. No entanto, o protocolo é aplicável a diversos modelos celulares em cultura. As células são semeadas em lamínulas de vidro com 18 milímetros de diâmetro, numa densidade de 3000 células por centímetro quadrado.

No DMEM suplementado, enquanto incuba as células, induza sua diferenciação suplementando o meio com ácido retinóico 10 micromolar por sete dias, com a troca do meio a cada dois dias. No sétimo dia, as células apresentam uma estrutura bem desenvolvida de neuritos e axônios e estão prontas para serem pressurizadas. Esterilize todas as partes da câmara de pressurização usando uma autoclave e armazene-as sob luz UV enquanto monta a câmara.

Em uma câmara de cultura, certifique-se de que o parafuso de ventilação esteja levemente encaixado na ventilação de ar. Na base da cavidade, preencha a câmara com meio de crescimento morno recém-preparado. Em seguida, parafuse uma lâmina de vidro com células cultivadas na tampa do pistão, com as células voltadas para fora, e carregue cuidadosamente o pistão na cavidade da câmara.

Remova o parafuso de ventilação, incline a ventilação para cima e empurre o pistão para dentro da câmara até uma linha de referência previamente determinada. Isso deixa cerca de seis milímetros de profundidade de fluido dentro da câmara de pressurização da célula. Evite introduzir bolhas, sanitize o parafuso de ventilação e recoloque-o para tornar a câmara estanque à água.

A câmara não deve apresentar vazamentos sob carga estática. Reconfigure o sistema da barra Ksky. Retorne a massa pesada para sua posição original e substitua o parafuso de travamento.

O parafuso de travamento exerce uma força de aperto que impede o movimento da barra incidente até que os pinos sejam rompidos. Acople o novo parafuso de travamento com o macaco hidráulico até cerca de 200 PSI. Use o macaco de tesoura para comprimir a seção de pré-carregamento da barra incidente até uma pressão um pouco superior ao valor desejado e, em seguida, alivie a pressão para acionar totalmente o atrito do parafuso JAK. Agora configure a aquisição de dados, pois a pressurização ocorre em cerca de um milissegundo.

Defina uma frequência de amostragem de um megahertz usando extensômetros de 2000 ohms em um circuito de ponte de Wheatstone. A tensão deve ser ajustada para 45 volts na barra transmissora. Monte a câmara da célula com o pistão voltado para a barra transmissora.

Coloque a câmara celular em um bloco em V suportado pelo suporte de tesoura de laboratório pequeno e alinhe com as duas barras. Lubrifique levemente cada interface e elimine qualquer ar entre as superfícies em brotamento, esfregando-as suavemente uma contra a outra. Agora o sistema está preparado.

Arme a aquisição de dados e realize o teste bombeando rapidamente o atuador hidráulico do grampo. Isso força o parafuso de travamento a se romper, fazendo com que o grampo se separe e uma onda de pressão seja transmitida às células. Após o teste, remova a lâmina da câmara em uma cabine de cultura e prossiga com a avaliação do comportamento celular.

Com experiência, o aparelho pode ser usado para pressurizar cerca de nove lâminas de cultivo celular por hora. Ao analisar o sinal obtido, erros por bolhas de ar podem ser observados no início do sinal da barra transmitida, porém não são vistos nesta demonstração.

Se a barra de transmitância for longa o suficiente, então os dados mais importantes devem começar com a primeira perturbação e terminar onde as medições indicam uma pressão negativa; essa leitura de tensão é proporcional à tensão sofrida pelas células por meio da análise com extensômetro. A duração do pulso transmitido pode ser menor do que a do pulso incidente. Se uma pequena bolha ficar aprisionada no fluido dentro da câmara de pressurização celular, a magnitude do pulso transmitido pode não exceder a do pulso incidente, mas deve apresentar uma plataforma suficientemente longa antes da descompressão.

Caso contrário, uma grande bolha de ar pode ficar aprisionada na câmara selada ou a montagem e a barra podem estar desalinhadas. Após a pressurização, as células podem ser inspecionadas imediatamente ou incubadas por mais tempo para exames posteriores. Compare as células pressurizadas com as células controle da câmara, que foram tratadas de maneira idêntica, mas não submetidas à pressurização, para avaliar alterações no comprimento dos neuritos por microscopia óptica em diferentes pontos temporais pós-incubação.

A coloração imunofluorescente da actina pode ser usada para avaliar alterações no citoesqueleto. Também é possível utilizar anticorpo contra a proteína associada aos microtúbulos dois. A MAP dois pode ser utilizada para visualizar alterações em um dos principais marcadores neuronais.

Para avaliar o efeito da pressurização impulsiva sobre a expressão gênica neuronal e apoptótica, utilize técnicas padrão de biologia molecular, como a R-T-P-C-R, se desejado. Pode-se coletar lisados celulares suficientes para imunoblotagem a partir de várias amostras celulares submetidas à mesma pressão. Neste exemplo, o perfil de pressurização, com o equipamento ksky bar, aplicou com sucesso um único pulso impulsivo de dois megapascal, com duração de cerca de 0,7 milissegundo, sobre células neuronais cultivadas, conforme observado nas imagens de microscópio óptico. Células neuronais humanas SHSY cinco Y, submetidas à pressão impulsiva de dois megapascal, apresentam ruptura acentuada dos neuritos e axônios em comparação com as células-controle não despressurizadas.

Ao realizar este procedimento, você sempre deve segurar a câmara de pressurização do fluido desta forma e nunca assim, pois isso submeterá as células a uma pressão negativa após o seu desenvolvimento. Esta técnica abriu caminho para que os pesquisadores na área de neurociência explorassem o mecanismo celular da lesão cerebral traumática sob condições controladas de pressurização em próstata. Agradecemos o apoio financeiro do Centro de Mecânica do Trauma da UNL do Exército.