Tridimensional Optical resolução Microscopia Fotoacústica

O objetivo geral deste procedimento é demonstrar microscopia fotoacústica de resolução óptica in vivo ou, ou Pam de microcirculação não invasiva e livre de marcadores. Isso é feito anestesiando primeiro o animal experimental. A segunda etapa do procedimento é posicionar a região de interesse traduzindo a cabeça de imagem da resolução óptica, os parâmetros de varredura do microscópio fotoacústico são então definidos e a aquisição da imagem é iniciada.

Em última análise, as distribuições da concentração total de oxigênio e da saturação de oxigênio da hemoglobina são obtidas por meio do cálculo dos dados experimentais de múltiplos comprimentos de onda. A microscopia fotoacústica de resolução óptica é baseada na excitação a laser e na detecção ultrassônica. Um feixe de laser de poste curto é focado no tecido biológico.

A absorção de luz gera aquecimento transitório e subsequente emissão ultrassônica, que é recebida para formar uma imagem. A vantagem exclusiva de, ou Pam, é a detecção livre de solo e sensibilidade requintada à absorção óptica. Em contraste, as tecnologias de reflexão existentes, não de microscopia óptica, são principalmente sensíveis ao espalhamento óptico ou fluorescência Capaz de fornecer imagens de alta resolução sem rótulo in vavo de absorção óptica ou RPM encontrou amplas aplicações biomédicas em neurologia, oftalmologia, biologia vascular e dermatologia.

A microscopia fotoacústica de resolução óptica ou pamm consiste em componentes ópticos e ultrassônicos. A fonte de irradiação óptica é um laser de corante bombeado por um laser de pulso de estado sólido. O feixe de laser de saída é atenuado por um filtro de densidade neutra e acoplado a uma fibra óptica de modo único para entrega de luz para permitir a varredura mecânica da cabeça de imagem do microscópio em vez do objeto vivo para acoplar efetivamente o feixe de laser multimodo em uma fibra óptica de modo único.

É primeiro filtrado por um orifício de 50 micrômetros de diâmetro. O orifício é posicionado ligeiramente longe do foco da lente do condensador para combinar seu diâmetro com o diâmetro do feixe do modo fundamental. Para criar um foco óptico quase limitado por difração, a saída da fibra monomodo é agrupada e preenche a abertura traseira de um microscópio. Objetivo.

A detecção ultrassônica envolve um combinador de feixe óptico acústico caseiro conectado a um transdutor ultrassônico. O combinador alinha a irradiação óptica e a detecção acústica coaxialmente. Uma cavidade esférica é retificada na parte inferior do combinador para produzir uma lente acústica com uma abertura numérica de 0,5 na água, que fornece um diâmetro focal acústico de 43 micrômetros na frequência central de 50 megahertz.

Para o primeiro alinhamento, é útil usar o ecossom de pulso para determinar a posição do plano focal acústico. A cabeça de imagem é ajustada verticalmente até que o sinal ultrassônico de eco de pulso máximo seja observado. Para maximizar a sensibilidade de detecção, os focos óptico e acústico são alinhados. Confocal.

Um alvo opticamente absorvente, como um pedaço de fita isolante preta, é colocado no plano focal acústico. Em seguida, a posição focal óptica é ajustada para maximizar o sinal fotoacústico. O sistema PAM também inclui amplificadores eletrônicos e conversor digital analógico, um scanner mecânico e um controlador de scanner.

O sinal digitalizado é transferido para um computador para formação de imagens. O software converte os dados brutos em uma sequência de imagens bcan transversais. À medida que o raster da cabeça do microscópio escaneia o objeto, as imagens gravadas podem ser exibidas como imagens transversais individuais, imagens de projeção de amplitude máxima 2D ou renderizações 3D.

Um tanque de água é usado para abrigar a cabeça de imagem do microscópio. Uma janela de imagem é cortada em uma placa de Petri e selada com uma membrana de polietileno ultrassônica e opticamente transparente. A onda fotoacústica gerada a partir do objeto é acoplada acusticamente ao detector ultrassônico primeiro por gel ultrassônico entre o objeto e a membrana de polietileno e, em seguida, por água deionizada na placa de Petri.

Essas invenções e aplicações dos lasers ópticos disponíveis e do transdutor de ultrassom compõem o sistema ou pam. No próximo segmento, faremos uma imagem da microvasculatura de um camundongo vivo com esse sistema. Se o animal que está sendo fotografado não for um camundongo nu, 24 horas antes do experimento, é ideal detete.

Assim, a irritação da vasculatura da pele é recuperada. Anestesiado o mouse com flúor 3% ISO vaporizado em oxigênio de grau médico. A vazão típica é entre um e 1,5 litros por minuto.

Dependendo do peso corporal do animal. Mantenha a anestesia com flúor ISO 1% Durante todo o experimento, belisque o dedo do pé para garantir que o mouse esteja totalmente anestesiado. Transfira o mouse para um estágio estereotáxico com uma almofada de aquecimento para manter a temperatura corporal em 37 graus Celsius.

Agora alise a orelha na placa de plástico. Em seguida, aplique uma camada de gel de ultrassom em cima da orelha. Evite prender bolhas de ar dentro do gel.

Aplique também pomada oftálmica nos olhos para evitar ressecamento ou danos acidentais do laser. Evite tocar no olho diretamente com o aplicador. Em seguida, coloque a orelha sob a janela de imagem e levante lentamente o estágio animal até que o gel de ultrassom entre em contato com a parte inferior da membrana.

O contato suave é necessário porque pressionar a orelha contra a membrana pode afetar o fluxo sanguíneo na orelha. Em seguida, tome algumas precauções com o animal para monitorar seu estado fisiológico. Prenda um oxímetro de pulso ao mouse, perna ou cauda.

Agora abaixe a cabeça de imagem até que a lente acústica esteja imersa em água deionizada e remova as bolhas presas sob a lente acústica. Defina o laser para o modo de disparo externo e inicie a varredura de teste. Ajuste a posição Z da cabeça de imagem até que os focos duplos ópticos e acústicos estejam assentados no meio da orelha.

Agora defina os parâmetros de digitalização e inicie a aquisição formal da imagem. Para medir a concentração total de hemoglobina. Defina o comprimento de onda para um ponto espástico ISO onde a oxihemoglobina e a desoxihemoglobina têm coeficientes de extinção molar iguais.

Para medir a saturação de oxigênio da hemoglobina, defina o segundo comprimento de onda para onde os coeficientes de extinção molar da oxihemoglobina e da desoxihemoglobina têm uma diferença pronunciada. Quando terminar, limpe a orelha do mouse e coloque-o em uma incubadora. Com a temperatura ambiente ajustada em 37 graus Celsius, ao acordar, retorne naturalmente o camundongo ao biotério.

Esta imagem de projeção de amplitude máxima mostra a anatomia vascular de uma orelha de camundongo nua viva fotografada usando ou Pam a 570 nanômetros. Esta imagem de projeção mostra a saturação de oxigênio da hemoglobina no mesmo ouvido. É calculado a partir das imagens adquiridas em um comprimento de onda espástico ISO de 570 nanômetros e um comprimento de onda dominante de absorção de desoxihemoglobina de 561 nanômetros.

Um olhar mais atento à região encaixotada mostra a resolução de oramm. Um leito capilar densamente compactado é claramente resolvido. Neste vídeo, demonstramos o protocolo experimental típico para ORPM, incluindo a configuração do sistema, o alinhamento do sistema in vivo

Um dos aspectos mais importantes no projeto e operação do instrumento é o alinhamento confocal acústico óptico, que é crucial para a sensibilidade da imagem, a microscopia fotoacústica de resolução óptica em combinação com a microscopia fotoacústica de resolução acústica penetrante profunda e a tomografia computadorizada fotoacústica prometem imagens in vivo, funcionais e moleculares e múltiplas escalas finais, unhas de órgãos, células, tecidos, e até órgãos podem ser fotografados com o mesmo contraste. A origem, como a escalabilidade da imagem, tem o potencial de revolucionar a pesquisa em sistemas multiescala, biologia e tradução. De descobertas laboratoriais microscópicas à prática clínica macroscópica.