Name: Um Ensaio Bioluminescência Cálcio de análise funcional do Mosquito ( Aedes aegypti) E Tick ( Rhipicephalus microplus) G receptores acoplados à proteína (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-04-20T11:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 46 s
Description: Aprenda a realizar ensaios de bioluminescência de cálcio para analisar relações estrutura-atividade de neuropeptídeos em receptores GPCR de Aedes aegypti e Rhipicephalus microplus.

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Drs. CJP Grimmelikhuijzen e Michael Williamson da Universidade de Copenhague (Dinamarca), são apreciados por fornecer a aequorin plasmídeo. Nosso colaborador, o Dr. Ronald J. Nachman da ARS-USDA (TX, EUA), é reconhecido para a síntese peptídica e para fornecer o leitor de placas Novostar.

1. Estabelecimento de linhagens celulares estáveis <ol><li> Clone o seu GPCR de interesse e inseri-lo em um vetor de expressão que incorpora a 5 'seqüência de consenso Kozak (AGAC / GCCATGG) em torno do códon de iniciação para a ligação ribossomal ideal em um sistema de mamíferos (Kozak, 1986). Aqui usamos o pcDNA3.1/Bm-KR plasmídeo para o receptor de cinina carrapato, eo pcDNA3.1/Aedae-KR plasmídeo para o receptor de cinina mosquito (Holmes et al, 2003;. Pietrantonio et al, 2005).. O pcDNA3.1 (-) vetor codifica resistência à ampicilina para seleção de bactérias e resistência a neomicina (G418) para seleção em células de mamíferos. </li><li> Crescer CHO-K1 células vazias (sem plasmídeos) (ATCC, Manassas, VA, EUA) ou linha de outra célula desejada em um frasco de T-25 (BD Falcon) a 37 ° C em 5% incubadora de CO 2 umidificado (Holmes et al ., 2003). Todas as incubações devem ser feitos sob estas condições, a menos que especificado em contrário. Manter as células vazias no meio de crescimento (F12K média com 10% de soro fetal bovino) com 1X antibióticos antimicótica (Invitrogen, CA). </li><li> Para dividir células, aquecer todas as soluções a 37 ° C. Remova o meio de idade no frasco T-25 e enxágüe com 5 ml de PBS e remova PBS. Para trypsinize células, adicionar 2 ml PBS-Tripsina-EDTA (34 ml PBS, 2 ml de bicarbonato de sódio 7,5%, 4 ml 10X de tripsina-EDTA) por 2 min. Adicionar 3 ml de meio e aspirado médio cima e para baixo para misturar células. Transferência média com células em um tubo cônico e centrifugar por 2 min a ~ 200-300 g (1.000 rpm). Elimine o sobrenadante e ressuspender as células em 5 ml de meio. Diluir as células ressuspendidas a uma concentração de 1:5 ou 1:10 com meio fresco e transferir 5 ml em um frasco de T-25 novo. </li><li> Depois que as células estão crescendo de forma saudável (cerca de 2-3 dias), a semente da células CHO-K1 em T-25 frascos de cultura de tecidos e cultivá-las durante a noite em meio de crescimento sem antibióticos até que sejam confluentes cerca de 30% (aproximadamente 18 horas). O grau de confluência pode ser determinada por células observação sob microscopia fluorescente invertido. </li><li> Prepare as misturas a seguir para cada amostra: <ol><li> Combine 1-2 mg DNA (exemplo: uso de 4μl 265μg/μl pcDNA3.1/Aedae-KR) com 100 ul Opti-MEM eu Redução Médio de soro (Invitrogen). </li><li> Mix 6 Reagente Lipofectin mL (InvitrogenTM) em 100 ml de soro médio F12K livre, fazendo uma proporção de 1:1 de Lipofectin de DNA. Incubar à temperatura ambiente por 30-45 min. </li></ol> Misture suavemente as soluções de 1.5.1 com 1.5.2 de uma forma gota a gota, (volume total = mL 200). Deixe descansar em temperatura ambiente por 10-15 min. </li><li> Remova o meio de crescimento das células velhas e lavar as células com 5 ml de soro médio F12K livre e, em seguida, remover o F12K meio isento de soro. Em um tubo de 15 ml, misture delicadamente a mistura de transfecção em 1,8 ml de meio fresco F12K de forma gota a gota. Depois, lavou as células a partir do passo 1.5 com PBS e adicione esta solução de transfecção nova para as células. Incubar por 18 horas. </li><li> Mudança a médio e F12K médio mais 10% de soro fetal bovino sem antibióticos e incubar durante a noite. Dividir as células em duas T-25 frascos com F12K média mais 10% de soro fetal bovino sem antibióticos por mais 18 horas (para divisão de células por favor, veja o passo 1.3). </li><li> Substituir o meio com meio seletivo (F12K média mais 10% de soro fetal bovino com 800μg/ml GENETICIN, Invitrogen). Cultura as células usando o meio seletivo para 3-4 semanas. Com o tempo isso vai selecionar para células que têm incorporados de forma estável o plasmídeo em seu DNA genômico. Continue mantendo as células usando meio de manutenção (F12K média mais 10% de soro fetal bovino com 400μg/ml GENETICIN). Periodicamente congelar linhas celulares com relação 1:1 dos meios de comunicação de congelamento (meio seletivo com DMSO 20%) para evitar perde em caso de contaminação inesperado. </li><li> Seleção de linhagens de células clonais: como um primeiro passo, trypsinize e centrifugar as células a partir da etapa com 1,8 meio de manutenção como no passo 1.3. Re-suspender as células em meio de manutenção 5 ml, tomar 0,5 ml da célula suspender e adicionar 4,5 ml de meio de manutenção fresco para obter uma diluição de 10x. Transferir a diluição 10x em 12 poços de uma placa de 96 poços, acrescentando 100 ml a cada poço selecionar para células individuais. </li><li> Continuar a fazer 10x diluições em série destas células para uma suspensão teórico final de uma célula por 100 l (normalmente a diluição final será na faixa de 10 -11 a 10 -19; o número total de 10x diluições em série é ~ 19) . Imediatamente após cada diluição, transferir 100 ml da diluição em 12 poços da placa de 96 poços. Após 18 horas de incubação, observar 96 placas bem sob uma luz invertida ou poços de fluorescência microscópio e marca que parece conter apenas uma única célula ou células que contêm dois obviamente dividido de uma única célula. Mantenha observando todos os dias e meio mudam a cada três dias. </li><li> Quando os poços são conflu 80%diferentes (cerca de uma semana), lavar os poços marcados com 200 mL PBS e trypsinize-los com 100 ul de PBS-tripsina-EDTA solução. Transferência de células de cada um marcado bem em um poço de uma placa 6-bem com um meio de manutenção ml. Cultivar essas células para três dias depois transferir células em frasco T25 individual. Testar essas células utilizando o ensaio de bioluminescência de cálcio com peptídeos agonistas (ver secção 2). </li><li> Selecione uma linha de células a partir do passo 1,11 com a maior resposta no ensaio placa de cálcio bioluminescência e realizar pela segunda vez a única célula fases de selecção seguintes 1,9-1,11. Periodicamente congelar as linhagens celulares. </li><li> Da seleção secundário descrito no passo 1.12, escolher 2-3 linhagens de células com maior resposta no ensaio placa de cálcio bioluminescência e mantê-las em cultura por mais de cálcio ensaios placa de bioluminescência. Acompanhe os números passagem. De tempos em tempos, congelar linhas celulares de passagens cedo de modo que você pode sempre voltar a eles se as linhas de células com passagens mais parar de executar de forma consistente. </li></ol> 2. O cálcio ensaio de placa bioluminescência <ol><li> Ligadura do gene repórter de interesse em um vetor de expressão. Aqui usamos aequorin mtAEQ/pcDNA1 plasmídeo (um presente de drs. CJP Grimmelikhuijzen Williamson e Michael, University of Copenhagen, Dinamarca). Transformar o plasmídeo em E. coli MC1061/PS células (Invitrogen) e purificá-los através de um spin-QIAprep miniprep kit (Qiagen Inc.). Na etapa final eluir o plasmídeo com tampão Tris sem EDTA, e não água. </li><li> Crescer linhas celulares a partir do passo 1,13 expressando o receptor desejado no meio de manutenção. Quando as células são 90% confluentes, trypsinize, centrífuga e então re-suspender as células em 5 ml meio de manutenção como no passo 1.3. Diluir células (cerca de 10x com meio de manutenção) e contagem do número de células com células contra (Bright-Line hemocitômetro) sob microscopia. Ajustar o número de células de aproximadamente 2 x 10 5 células / ml (média de 20 células em um dos 9 quadrados mostrou no hemocitômetro). Células de semente 2 ml diluído em media em cada poço de uma placa de seis também. Incubar por 24 horas (as células devem atingir cerca de 60% após a confluência de incubação). </li><li> Mudança de mídia na placa de poços de 6 a OPTI-MEM médio. Para cada bem, misture 96 mL OPTI-MEM com 4 mL de reagente Transfection FuGENE 6 (Bioquímicos Roche) em um tubo de microcentrífuga e deixe descansar em temperatura ambiente por 5 min. Adicionar 1 mg de aequorin / pcDNA um plasmídeo de DNA para cada tubo e, em seguida, agite a amostra por 1 min, incubar em temperatura ambiente por 15-20 minutos. Adicione cada mistura em cada poço de uma forma gota a gota enquanto agitando o prato também. Incubar as placas durante 6 horas e mudar a médio e F12K meio contendo 10% de soro fetal bovino sem antibiótico. </li><li> Após incubar as células em seis placa assim por 24 horas, trypsinize, centrífuga e re-suspender as células como no passo 1.3. Conte o número de células de 400.000 células / ml como passo 2.1 e transferência de 100 l (40.000 mL cells/100 total) em cada poço de um 96-bem fina placa de fundo branco de microtitulação (Costar 3610). Incubar por mais 24 horas até cerca de 80% confluência celular. Esta é a melhor concentração de células para o ensaio de bioluminescência. </li><li> Prepare 90μl/well de um livre de cálcio media DMEM (Invitrogen) contendo 5 mM celenterazina (Invitrogen) no escuro (celenterazina é sensível à luz). Pegue a placa de 2,4, remover a velha mídia e adicione este 90μl em cada poço. Incubar as placas por 3 horas no escuro a 37 ° C e 5% CO 2, após o qual as células do prato está pronto para ser testado. </li></ol> 3. Operação do instrumento e análise de dados <ol><li> Cada leitor de placas bioluminescência é diferente. Realizamos o nosso ensaio utilizando um leitor de placas Novostar (Labtechnologies BMG) no modo bioluminensence. Se você usa um instrumento diferente, você deve se adaptar ao protocolo. </li><li> Purgar as bombas leitor de placas (ou BOMBAS PRIME) antes de usar. Desligue a luz no quarto antes de colocar a placa no suporte da placa. Uma vez que o suporte da placa foi fechada, acender as luzes. </li><li> Solubilizar peptídeos (em um tubo Eppendorf de 1,5 ml) na mídia sem cálcio DMEM. Definir a "profundidade Aspirar" e "Determinação de posição" da solução de peptídeo antes de usar. Desafio as células com 10 ml (10x), com diferentes concentrações de peptídeos (FFFSWG-NH2, Aedes-K1-3, ou peptídeo desejado outros) e imediatamente começar a gravar a emissão de luz. Criámos o instrumento para registrar a emissão de luz (465 nm) para cada poço a cada 2 segundos para um tempo total de 50 segundos. </li><li> Certifique-se incluir um controlo positivo, como um análogo ativo (analógico FFFSWGa tem sido utilizado, Taneja-Bageshwar et al., 2009) e um controle negativo, como as células transfectadas único vetor. O controle negativo será necessário na análise dos dados para definir o limiar de referência (ver resultados representativos).Um peptídeo, sem relação inativos também pode ser adicionado como um controle negativo. </li><li> Após a corrida terminar, lave a bomba de instrumento (ou BOMBAS PRIME) em seguida, coloque a sua amostra peptídeo seguinte. Salvar seus dados e lavar as bombas novamente. </li><li> Manipulação de dados: transferência dos dados de emissão de luz de cada poço em uma folha de dados do Microsoft Excel. </li><li> Colar os dados do Excel para o software 4.0 do Prisma GraphPad Software Inc. (San Diego, CA, EUA). As concentrações de peptídeo vários é o eixo X e unidades de bioluminescência é o eixo Y. Para normalizar os dados, traçar uma curva log-resposta. Selecione um não-lineares de regressão análise do ajuste da curva (equação sigmoidal dose-resposta com inclinação variável) para obter curvas concentração-resposta para cada peptídeo. O programa plota os valores no final e dá a EC 50. </li><li> Cada experimento deve ser repetido três vezes para análise de dados. </li></ol> 4. Resultados representativos: Quando expressa em células CHO-K1, o mosquito Aedes aegypti receptor de cininas comportou-se como um receptor multiligand e funcionalmente respondeu a concentrações tão baixas como 1 nM dos três endogenours Aedes cininas, Aedae cininas 1-3, testados individualmente usando o ensaio de cálcio placa bioluminescência . A Figura 1 mostra que a ordem de classificação de potência obtido foi Aedae-K-3&gt; Aedae-K-2&gt; Aedae-K-1, com base nos respectivos valores de CE 50 de 3-Aedae-K, 16,04 nM; Aedae-K- 2, 26,6 nM e Aedae-K-1, 48,85 nM, que foram estatisticamente diferentes (P &lt;0,05) (Pietrantonio et al., 2005). Nós também usamos este teste para determinar quais os resíduos de cininas são fundamentais para a interação peptídeo-receptor de cininas. Peptídeos inseto cinina compartilhar uma pentapeptide C-terminal que representa a seqüência mínima exigida para a atividade biológica, também conhecido como core. Na Tabela 1, os análogos núcleo cinina peptídeo foram sintetizados como uma série de substituição da alanina cinina núcleo pentapeptide FFSWGa e testados por um ensaio de placa de cálcio bioluminescência (Taneja-Bageshwar et al., 2006). Descobrimos que os aminoácidos Phe 1 e Trp 4 foram essenciais para a atividade do cininas inseto para ambos os receptores. O ensaio também pode ser usado para testar peptídeos projetado para Biostability reforçada. A Tabela 2 mostra os análogos projetados cinina contendo ácido isobutírico amino (AIB) sobre o carrapato testado receptor recombinante cininas e Figura 2 mostra a comparação da atividade de seis alfa-amino ácido isobutírico análogos no receptor de cininas carrapato expressar CHO-K1 linha celular por um de cálcio ensaio de bioluminescência placa (Taneja-Bageshwar et al., 2009). O hexapeptide analógico FFFSWGa é adicionada para um controle positivo para a atividade do receptor. O analógico FF [Aib] WGA resultou mais ativo do que este controle analógico hexapeptide. O analógico com duas substituições de ácido aminoisobutyric, [Aib] FF [Aib] WGA, foi o mais potente dos análogos substituição dupla testados (Tabela 2 e Figura 2). Para mais exemplos de como este ensaio tem sido e pode ser aplicado ver Nachman e Pietantonio (2010), Nachman et al. (2009), Taneja-Bageshwar et al. (2008a), e Taneja-Bageshwar et al. (2008b). <img src="/files/ftp_upload/2732/2732fig1.jpg" alt="Figura 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 1"> Figura 1. Estimativa do Aedes cininas concentração efetiva (EC 50) em células CHO-K1 E10 por um ensaio de placa de cálcio bioluminescência. O eixo y das curvas de concentração-resposta foi obtido a partir de unidades de bioluminescência, expressa em percentagem da resposta máxima observada para cada peptídeo. Pontos de dados representam a média de seis repetições obtidas durante três experimentos independentes. Barras representam o erro padrão. (A) Estimativa da Aedae-K1 EC 50 = 48 nM. (B) Estimativa da Aedae-K2 EC 50 = 26 nM. (C) Estimativa da Aedae-K3 EC 50 = 16 nM. EC 50 Aedae-K3 &lt;EC 50 Aedae-K2 &lt;EC 50 Aedae-K1; P &lt;0,05. Análise estatística e gráficos foram com o software GraphPad Prism 4.0. <img src="/files/ftp_upload/2732/2732fig2.jpg" alt="Figura 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 2"> Figura 2. Comparação da atividade de seis alfa-amino ácido isobutírico análogos no receptor de cininas carrapato expressar CHO-K1 linha celular por um ensaio de placa de cálcio bioluminescência. O eixo y representa unidades por cento máxima bioluminescência para cada analógico, expresso em percentagem de bioluminescência observada na concentração versus a resposta máxima observada entre todas as concentrações testadas para cada analógico. Análise estatística e gráficos foram realizados com o software GraphPad Prism 4.0. <table border="1"><tbody><tr><td></td><td colspan="2"> Tick ​​linha celular receptor </td><td colspan="2"> Mosquito linha celular receptor </td></tr><td> Peptídeos </td><td> EC 50 (nM) </td><td> Bioluminescência resposta máxima em 1 mM </td><td> EC 50 (nM) </td><td> Bioluminescência resposta máxima em 1 mM </td><tr><td> AFSWGa </td><td> Eu </td><td> Eu </td><td> Eu </td><td> Eu </td></tr><tr><td> FASWGa </td><td> 586 </td><td> 5600 </td><td> ND </td><td> 400 </td></tr><tr><td> FFAWGa </td><td> 64 </td><td> 12800 </td><td> 621 </td><td> 3050 </td></tr><tr><td> FFSAGa </td><td> Eu </td><td> Eu </td><td> Eu </td><td> Eu </td></tr><tr><td> FFSWAa </td><td> 417 </td><td> 10600 </td><td> 2800 </td><td> 1830 </td></tr><tr><td> FFSWGa </td><td> 590 </td><td> 10800 </td><td> ND </td><td> 525 </td></tr><tr><td> FSWGa </td><td> Eu </td><td> Eu </td><td> Eu </td><td> Eu </td></tr><tr><td> FFSWa </td><td> Eu </td><td> Eu </td><td> Eu </td><td> Eu </td></tr><tr><td> FFSWG-OH </td><td> Eu </td><td> Eu </td><td> Eu </td><td> Eu </td></tr><tr><td> FFFSWGa </td><td> 259 </td><td> 13000 </td><td> 562 </td><td> 10000 </td></tr><tr><td> FF [Aib] WGA </td><td> 29 </td><td> 12700 </td><td> 445 </td><td> 9300 </td></tr></tbody></table> Tabela 1. Potências estimado (EC 50) ea resposta bioluminescência máxima de todos os peptídeos testado em escala e receptor mosquito linhagens de células transfectadas *. * A EC 50 estimativas da concentração necessária para induzir uma resposta meia-máxima. I: Inactive, se a resposta bioluminescência é inferior a 300 unidades (nível de vetor somente células transfectadas). R: A posição onde o resíduo na respectiva FFSWGa peptídeo foi substituído por alanina. ND: O analógico foi testado, mas era ou não muito ativo ou não ativo em molarities inferior, portanto, uma EC50 não pôde ser determinado. <table border="1"><tbody><tr><td> K-Aib-1 </td><td> [Aib] FF [Aib] WGA </td></tr><tr><td> K-Aib-2 </td><td> [Α MEF] FF [Aib] WGA </td></tr><tr><td> K-Aib-3 </td><td> Ac-R [Aib] FF [Aib] WGA </td></tr><tr><td> K-Aib-4 </td><td> Ac-R [β3F] FF [Aib] WGA </td></tr><tr><td> K-Aib-5 </td><td> [Aib] RFF [Aib] WGA </td></tr><tr><td> K-Aib-6 </td><td> [Aib-Aib-Aib-Aib] RFF [Aib] WGA </td></tr></tbody></table> Tabela 2. Cinina análogos (K) contendo ácido isobutírico amino (AIB) sobre o carrapato testado receptor recombinante cininas. Ac: acetil; α Me: α metil-fenilalanina; β3F: β3-fenilalanina, um: amida.

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<li>Stables, J., Green, A., Marshall, F., Fraser, N., Knight, E., Sautel, M., Milligan, G., Lee, M., Rees, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+bioluminescent+assay+for+agonist+activity+at+potentially+any+G-protein+coupled+receptor%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">A bioluminescent assay for agonist activity at potentially any G-protein coupled receptor.</a> Analytical Biochemistry. 252, 115-126 (1997).</li>
</ol>

Não há conflitos de interesse declarados.

Fomos capazes de realizar a caracterização funcional do receptor de neuropeptídeo descoberto pela primeira vez desde o Arachnida (carrapatos, ácaros e aranhas), o receptor de cininas carrapato, usando esse protocolo. Este método tem três aplicações principais. Primeiro, a técnica pode ser aplicada para deorphanization receptor através de medições de atividade ligante. Segundo, o ensaio pode resolver ligante-receptor relações estrutura-actividade (SAR). Em terceiro lugar, os métodos podem ser usados ​​na descoberta de medicamentos. Além disso, este protocolo pode ser usado para estudar a atividade de agonistas ou antagonistas em quase qualquer GPCR. Estamos começando a adaptar este protocolo para triagem de pequenas bibliotecas. A linhagem celular utilizamos não expressam a proteína G onipresente G 16. Nós não precisamos, porque os receptores de cininas artrópodes sinal através da proteína Gq e da cascata de cálcio intracelular e conservar este propriedades de sinalização em células de mamíferos, como mostrado aqui.

<table border="1"><tbody><tr><th> Nome do reagente </th><th> Companhia </th><th> Número de catálogo </th><th> Comentários (opcional) </th></tr><tr><td> DMEM </td><td> Invitrogen </td><td> ABCD1234 </td><td></td></tr><tr><td> Células CHO-K1 </td><td> ATCC </td><td> CCL-61 </td><td> Manassas, VA, EUA </td></tr><tr><td> F12K médio </td><td> Invitrogen </td><td> 21127 </td><td></td></tr><tr><td> Soro fetal bovino </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> F0643 </td><td></td></tr><tr><td> Tripsina-EDTA (10x) </td><td> Invitrogen </td><td> 15400 </td><td></td></tr><tr><td> Antibiótico antimicótico </td><td> Invitrogen </td><td> 15240 </td><td></td></tr><tr><td> Opti-MEM eu Redução Médio Serum </td><td> Invitrogen </td><td> 31985 </td><td></td></tr><tr><td> Reagente Lipofectin </td><td> Invitrogen </td><td> 18292-011 </td><td></td></tr><tr><td> GENETICIN </td><td> Invitrogen </td><td> 10131035 </td><td></td></tr><tr><td> MC1061/P3 Ultracomp </td><td> Invitrogen </td><td> C663-03 </td><td></td></tr><tr><td> QIAprep rodada miniprep kit </td><td> Qiagen Inc. </td><td> 19064 </td><td></td></tr><tr><td> FuGENE reagente Transfection 6 </td><td> Roche </td><td> 11 814 443 001 </td><td></td></tr><tr><td> De 96 poços da placa microtitere branca fina fundo </td><td> Costar </td><td> 3610 </td><td></td></tr><tr><td> sem cálcio DMEM media </td><td> Invitrogen </td><td> 21068 </td><td></td></tr><tr><td> Celenterazina </td><td> Invitrogen </td><td> C-2944 </td><td></td></tr><tr><td> Brilhante-Line hemacitómetro </td><td> Hausser Scientific </td><td></td><td> Horsham, PA </td></tr><tr><td> Novostar </td><td> Labtechnologies BMG </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Prism software 4.0 </td><td> GraphPad Software Inc. </td><td></td><td> San Diego, CA, EUA </td></tr><tr><td> T-25 e T-75 Frascos </td><td> BD Falcon </td><td> 353014 e 353135 </td><td></td></tr></tbody></table>

um ensaio bioluminescência cálcio de análise funcional do mosquito ( aedes aegypti) e tick ( rhipicephalus microplus) g receptores acoplados à proteína

A Calcium Bioluminescence Assay for Functional Analysis of Mosquito (Aedes aegypti) and Tick (Rhipicephalus microplus) G Protein-coupled Receptors

Receptores hormonais artrópodes são alvos potenciais para pesticidas romance como eles regulam muitos processos essenciais fisiológicas e comportamentais. A maioria deles pertence à superfamília dos G receptores acoplados à proteína (GPCRs). Nós nos concentramos na caracterização de artrópodes receptores de cininas do carrapato e do mosquito. Cininas artrópodes são neuropeptídeos multifuncional com myotropic, diurético, ea função dos neurotransmissores. Aqui, um método para análises sistemáticas de relações estrutura-actividade de cininas insetos em dois heteróloga cinina receptor-expressando sistemas é descrito. Nós fornecemos informações importantes para o desenvolvimento de análogos biostable cinina com o potencial de interromper o diurético, myotropic, e / ou os processos digestivos em carrapatos e mosquitos. Os receptores de cininas do carrapato bovino do sul, Boophilus microplus (Canestrini), e do mosquito Aedes aegypti (Linnaeus), foram expressos de forma estável na linha de células de mamíferos CHO-K1. Análise funcional desses receptores foram concluídas usando um ensaio de cálcio placa bioluminescência que mede a bioluminescência para determinar os níveis intracelulares de cálcio citoplasmático a pedido peptídeo a essas células recombinantes. Este método tira vantagem da proteína aequorin, um fotoproteína isolado luminescentes água-viva. Nós transitoriamente transfectadas o aequorin plasmídeo (mtAEQ/pcDNA1) em linhagens de células que expressa de maneira estável os receptores de cininas. Essas células foram então tratadas com o celenterazina cofactor, que complexos com aequorin intracelular. Este vínculo quebra na presença de cálcio, emitindo níveis de luminescência indicativo da concentração de cálcio. Como o receptor de cininas sinais através da liberação de cálcio intracelular, a intensidade do sinal está relacionado com a potência do peptídeo. Este protocolo é uma síntese de vários protocolos descritos anteriormente, com modificações, que apresenta passo-a-passo para a expressão estável de GPCRs em uma linha de células de mamíferos através de ensaios placa funcional (Staubly et al, 2002 e Stables et al, 1997.. ). Usando esta metodologia, nós fomos capazes de estabelecer linhas de células estáveis ​​expressando o mosquito e os receptores de cininas carrapato, compare a potência de três cininas mosquito, identificar crítica posições de aminoácidos para a interação ligante-receptor, e executar semi-throughput screening de um peptídeo biblioteca. Porque cininas insetos são suscetíveis à degradação enzimática rápida por peptidases endógenas, eles são severamente limitados em uso como ferramentas para controle de pragas ou estudos endocrinológicos. Portanto, nós também testou análogos cinina contendo ácido isobutírico amino (AIB) para aumentar a sua potência e Biostability. Este analógico peptidase-resistentes representa uma vantagem importante no desenvolvimento de análogos biostable cinina de insetos e pode ajudar no desenvolvimento de neuropeptídeo baseado estratégias de controle de artrópodes.

Este protocolo fornece instruções para clonal de células de seleção de linha e um ensaio de bioluminescência de cálcio para analisar as relações estrutura-atividade de síntese neuropeptídeos de artrópodes em seus cognatos GPCRs. Este ensaio pode ser usado para deorphanization receptor e estudos de relação estrutura-atividade para o projeto análogo sintético e peptídeo / drogas lead-descoberta.

Um Ensaio Bioluminescência Cálcio de análise funcional do Mosquito ( Aedes aegypti) E Tick ( Rhipicephalus microplus) G receptores acoplados à proteína

Os receptores hormonais de artrópodes são alvos potenciais para novos pesticidas, pois regulam diversos processos fisiológicos e comportamentais essenciais. O ...

O objetivo geral do experimento a seguir é analisar as relações entre estrutura e atividade de neuropeptídeos de artrópodes sintetizados sobre seus receptores GPCR cognatos. Isso é alcançado pela transfeção de células de ovário de hamster chinês, linhagem K1 vazia, com o vetor de expressão do GPCR desejado para obtenção de linhagens celulares estavelmente transformadas derivadas de uma única célula; como segundo passo, a linhagem celular estável é transfectada com o plasmídeo quaran, que carrega o repórter Gina Quaran para medir a bioluminescência intracelular no ensaio em placa de bioluminescência do cálcio. Em seguida, o ensaio em placa de bioluminescência do cálcio é realizado para determinar os níveis citoplasmáticos de cálcio após a aplicação do ligante peptídico a essas células recombinantes.Obtêm-se resultados que mostram diferenças nas unidades de bioluminescência após a aplicação de peptídeos com estruturas diferentes ou de concentrações distintas de peptídeos em células recombinantes, com base na liberação intracelular de cálcio induzida, conforme detectado pelo repórter uma corrina no ensaio em placa. A principal vantagem do uso de linhagens celulares clonais estavelmente transformadas que expressam GPCRs recombinantes, em comparação com tendências e protocolos de expressão, é que os níveis de expressão do receptor são mais uniformes, permitindo consistência e reprodutibilidade dos resultados. Além disso, o direcionamento da proteína aquarina para as mitocôndrias permite medições sensíveis de cálcio por meio da bioluminescência, demonstrando o experimento. Hoje estarão presentes dois estudantes de pós-graduação, Shallin Lie e Simon Kersch, bem como um pós-doutorando do meu laboratório.Para estabelecer linhagens celulares estáveis, comece cultivando células de ovário de hamster chinês, linhagem K1 vazia, a 37 graus Celsius em um incubador umidificado com 5% de dióxido de carbono. Mantenha as células vazias em meio de crescimento com antibiótico antimicótico 1x após as células estarem crescendo saudavelmente. Semee as células de ovário de hamster chinês K1 em frascos de cultura tecidual T25 e cultive as células durante a noite em meio de crescimento sem antibióticos até atingirem cerca de 30% de confluência.Antes da transfeção, prepare um vetor de expressão de DNA contendo o receptor acoplado à proteína G de interesse conforme descrito no protocolo escrito. Combine o DNA com 100 microlitros de meio Optum com soro reduzido.Misture seis microlitros do reagente de lipofecção em 100 microlitros de meio F 12 K sem soro e incube em temperatura ambiente por 30 a 45 minutos. Após a incubação, misture suavemente as soluções de DNA e de lipofecção gota a gota. Deixe a mistura em repouso à temperatura ambiente por 10 a 15 minutos em um tubo de 15 mililitros.Misture suavemente a mistura de transfeção em 1,8 mililitros de meio F 12 K fresco, gota a gota. Em seguida, lave as células com PBS e adicione esta nova solução de transfeção às células. Após uma incubação de 18 horas.Substitua o meio por F 12 K, meio acrescido de 10% de FBS sem antibióticos e incube durante a noite no dia seguinte. Divida as células em dois frascos T 25 com F 12 K, meio acrescido de 10% de FBS sem antibióticos conforme descrito no procedimento escrito. Incube por mais 18 horas.Substitua o meio por meio seletivo. Em seguida, cultive as células utilizando o meio seletivo por três a quatro semanas ao longo do tempo. Isso selecionará células que incorporaram de forma estável o plasmídeo ao seu DNA genômico.Continue mantendo as células usando o meio de manutenção, congelando periodicamente as linhagens celulares para prevenir perda em caso de contaminação inesperada. Para selecionar linhagens celulares clonais, primeiro trypsinize os cultivos e centrifugue as células com meio de manutenção conforme descrito no protocolo escrito. Em seguida, ressuspenda as células em cinco mililitros de meio de manutenção.Remova 0,5 mililitros da suspensão celular e adicione 4,5 mililitros de meio de manutenção fresco para fazer uma diluição 10 x e transfira 100 microlitros da diluição 10 x para 12 poços de uma placa de 96 poços para seleção de células individuais. Continue fazendo diluições seriadas 10 x dessas células cerca de 19 vezes para obter uma suspensão final teórica de uma célula por 100 microlitros e transfira 100 microlitros de cada diluição seriada para 12 poços de uma placa de 96 poços. Após 18 horas de incubação, observe as placas de 96 poços em um microscópio invertido de luz ou de fluorescência e marque os poços que parecem conter apenas uma única célula ou duas células que obviamente se dividiram a partir de uma única célula.Observe as placas diariamente, trocando o meio a cada três dias. Deixe as células crescerem por uma semana, até atingirem cerca de 80% de confluência. Em seguida, lave os poços marcados com 200 microlitros de PBS e tripsina.Cubra os olhos com 100 microlitros de solução de PBS tripsina EDTA. Remova a solução de PBS tripsina EDTA. Adicione 100 microlitros de meio de manutenção e transfira as células de cada poço marcado para um poço de uma placa de seis poços contendo um mililitro de meio de manutenção.Após cultivar as células em placa de seis poços por três dias, transfira as células para frascos T 25 individuais. Congele periodicamente a linhagem celular para que possa ser recuperada caso as células deixem de apresentar desempenho consistente. Para determinar a linhagem celular com maior resposta, teste as células transferidas utilizando o ensaio de bioluminescência de cálcio com um ligante ativo, como o receptor, peptídeo, ligante ou outro agonista controle positivo.O ensaio de bioluminescência de cálcio será demonstrado em detalhes posteriormente neste vídeo. Realize a seleção de células individuais uma segunda vez antes de prosseguir com o experimento. Quando linhagens celulares clonais são escolhidas para ensaios e mantidas em cultura, é fundamental acompanhar os números de passagem, pois células com alto número de passagem podem deixar de funcionar adequadamente em um frasco T 25.Linhagens celulares expressando o receptor desejado em meio de manutenção até cerca de 90% de confluência. Após trypsinizar e centrifugar as células ressuspendidas, suspenda-as no meio de manutenção, dilua as células aproximadamente 10 vezes com meio de manutenção e conte o número de células com um hemocitômetro. Em seguida, ajuste o número de células para aproximadamente duas vezes 10 à quinta potência de células por mililitro, semeie dois mililitros das células em cada poço de uma placa de seis poços e incube a placa por 24 horas, após as quais as células devem estar com cerca de 60% de confluência antes do início do ensaio de placa de bioluminescência de cálcio.Prepare o gene repórter de interesse na construção do vetor de expressão. Aqui é utilizado um repórter de quórum expresso em mitocôndrias. Em seguida, transfete as células com um micrograma desse plasmídeo repórter conforme descrito no protocolo escrito.Após incubação das células em uma placa de seis poços por 24 horas, realiza-se a tripsinização, centrifugação e ressuspende-se as células, contando-as para obter uma concentração de 400.000 células por mililitro e transferindo 100 microlitros para cada poço de uma placa de microtitulação branca de 96 poços com fundo fino, incubando por mais 24 horas até que seja atingida uma confluência de aproximadamente 80%. Essa é a concentração ideal de células para o ensaio de bioluminescência. Os passos seguintes devem ser realizados no escuro, mas são mostrados aqui sob luz.Para fins demonstrativos, prepare meio DME livre de cálcio contendo cinco micromolares de CHO terezin suficiente para 90 microlitros por poço. Remova o meio antigo da placa e adicione 90 microlitros em cada poço. Incube as placas por três horas no escuro a 37 graus Celsius e 5% de dióxido de carbono, após o que as células estarão prontas para serem testadas.Esta demonstração é realizada utilizando um leitor de placas Nova Star no modo de bioluminescência. Para iniciar a purga, a placa com as amostras deve ser colocada no suporte de placas enquanto estiver no escuro. Solubilize os peptídeos em um tubo EOR de 1,5 mililitro.Utilizando quantidade suficiente de DME sem cálcio e meio para 10 microlitros de peptídeo 10 x por poço. Ajuste a profundidade de aspiração e a determinação da posição da solução de peptídeo antes do uso. Desafie as células com 10 microlitros do peptídeo e imediatamente comece a registrar a emissão de luz.Nesta demonstração, o instrumento é configurado para registrar a emissão de luz a 465 nanômetros para cada poço a cada dois segundos, durante um tempo total de 50 segundos. Após a conclusão da corrida, lave as bombas do equipamento. Repita o processo para cada amostra de peptídeo, salve os dados e lave novamente as bombas do equipamento após o ensaio.Os dados de emissão de luz de cada poço são transferidos automaticamente para uma planilha do Microsoft Excel pelo programa de software. Cole os dados do Excel no Prism Software 4.0. Gere um gráfico com as várias concentrações de peptídeo no eixo x e as unidades de bioluminescência.No eixo Y, selecione uma análise de ajuste de curva de regressão não linear para obter curvas de resposta à concentração para cada peptídeo em seus respectivos valores de CE 50. Cada experimento deve ser repetido três vezes para a análise dos dados. Quando expresso em ovário de hamster chinês, células K um, o receptor de quinina do mosquito Aedes aegypti comportou-se como um receptor multiligante e respondeu funcionalmente a concentrações tão baixas quanto um amino ácido.Para as três cininas endógenas de oito aegypti testadas isoladamente utilizando o ensaio de placa de bioluminescência de cálcio. Foram determinados valores de CE 50 estatisticamente diferentes de cerca de 16 nanomolares para a oito aegypti cinina 3, 26 nanomolares para a oito aegypti cinina 2 e 49 nanomolares para a oito aegypti cinina 1, resultando em uma ordem de potência na qual a oito aegypti cinina 3 é a mais potente e a oito aegypti cinina 1 é a menos potente, conforme mostrado. Abaixo está a comparação da atividade de seis análogos de cinina com ácido alfa amino ISO butírico sobre a linhagem celular de ovário de hamster chinês K1 que expressa o receptor de cinina de carrapato, avaliada por meio de um ensaio de placa de bioluminescência de cálcio.O eixo Y representa a porcentagem de unidades máximas de bioluminescência para cada análogo, expressa como percentual da bioluminescência observada em uma concentração em relação à resposta máxima observada em todas as concentrações testadas para cada análogo. O peptídeo HEXA KININA F-F-F-S-W-G amida é o controle positivo para a atividade do receptor. O análogo de cinina com substituição simples, F ácido aminobutírico ISO WG amida, foi mais ativo do que o peptídeo HEXA KININA análogo controle positivo; o análogo de cinina com duas substituições por ácido aminobutírico, ácido aminobutírico FF ácido aminobutírico WG amida, foi o mais potente dentre os análogos com dupla substituição testados. Após assistir a este vídeo, você deverá ter uma boa compreensão de como expressar A-G-P-C-R e obter linhagens celulares clonais para analisar relações estrutura-atividade de ligantes em receptores por meio de um ensaio de bioluminescência de cálcio.

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Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Imunologia e Infecção

Métodos para usar os sistemas de alfavírus transdução de expressar repórteres fluorescentes in vitro e em mosquitos adultos são descritos. Esta técnica pode ser adaptada para expressar toda a proteína de interesse em vez de ou em adição a um repórter.

Sistema Alphavirus Transdução: ferramentas para visualização de infecção em mosquitos vetores

Fonte: Lark, A. R., et. al., Abordagem de imagem cerebral funcional in vivo baseada no indicador de cálcio bioluminescente GFP-aequorin. J. Vis. Exp. (2016)Este vídeo demonstra imagens em tempo real da dinâmica do cálcio usando Green bioluminescência de proteína fluorescente-aequorina em Drosophila estruturas cerebrais profundas.

Imagem de bioluminescência para estudar transientes de cálcio em estruturas cerebrais de Drosophila

O ensaio de mobilização de cálcio e de fluorescência baseada aqui descrito é um sistema de rastreio inverso farmacologia de médio rendimento para a identificação de ligandos funcionalmente activação (s) de órfãos receptores acoplados à proteína (GPCRs).

Caracterização dos receptores acoplados à proteína por uma mobilização de cálcio Ensaio baseado em fluorescência

Aqui nós apresentamos um romance Ca 2+ -Imaging abordagem usando um repórter bioluminescente. Esta abordagem utiliza um GFP-aequorina constructo fundido que se liga a Ca 2+ e emite luz, eliminando a necessidade de excitação da luz. Significativamente este método permite imagem longa e contínua, o acesso a estruturas cerebrais profundas e alta resolução temporal.

In Vivo funcional do cérebro Imagiologia Abordagem Baseada em cálcio Bioluminescent Indicador GFP-aequorina

O ensaio de celular descrito destina-se a identificação do receptor do chemokine do CXC 4 (CXCR4)-interação agentes que inibem ou estimulam, competitivos ou qual alostericamente, o intracelular Ca2 + lançamento iniciado pela ativação de CXCR4.

Um cinética baseada em fluorescência Ca2 + mobilização ensaio para identificar agonistas do Receptor acoplado à proteína G, antagonistas e moduladores alostéricos

Este protocolo descreve uma metodologia de microinjeção que temos padronizado e utilizado por vários anos para entregar quantidades específicas de ácidos nucleicos diretamente a hemolinfa de mosquitos e moscas domésticas. Este protocolo resulta em mortalidade de injeção mínima e permite medições de dose correlacionado de fecundidade.

Reprodutível dsRNA Microinjection e Bioassay de oviposição em mosquitos e moscas domésticas

Descrito é um método de economia de tempo e espaço para contar ovos e determinar as taxas de escotilha de mosquitos individuais usando 24 placas de cultura de tecido de poço, o que pode aumentar substancialmente a escala e a velocidade dos ensaios de fecundidade e fertilidade.

Ensaio melhorado de fecundidade e fertilidade para a Aedes aegypti usando 24 placas de cultura de tecido poço (placas EAgaL)

Neste trabalho, um ensaio de fluorescência de cálcio intracelular de alto rendimento para placas de 384 poços para rastrear pequenas bibliotecas de moléculas em receptores acoplados à proteína G recombinante (GPCRs) é descrito. O alvo, o receptor de cinina do carrapato da febre do gado, Rhipicephalus microplus, é expresso em células CHO-K1. Este ensaio identifica agonistas e antagonistas usando as mesmas células em um ensaio de "adição dupla".

Um ensaio de fluorescência de cálcio de "dupla adição" para a triagem de alto rendimento de receptores acoplados à proteína G recombinante

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Eletropenetrografia AC-DC para o Estudo dos Comportamentos de Sondagem e Ingestão de Mosquitos Culex tarsalis em Mãos Humanas

A simplificada ainda método preciso para coletar e mancha hemócitos mosquito é descrito. Nosso método combina a simplicidade de perfusão com a precisão das técnicas de injecção de alta para isolar os preparativos limpa de hemócitos em mosquitos Aedes. Este método facilita os estudos que exigem conhecimento dos tipos de hemócitos e sua abundância.

Um Protocolo de Coleta e coloração Hemócitos do mosquito da febre amarela Aedes aegypti</em

Aprenda a realizar ensaios de bioluminescência de cálcio para analisar relações estrutura-atividade de neuropeptídeos em receptores GPCR de Aedes aegypti e Rhipicephalus microplus.

Um Ensaio Bioluminescência Cálcio de análise funcional do Mosquito ( Aedes aegypti) E Tick ( Rhipicephalus microplus) G receptores acoplados à proteína (Vídeo) | JoVE Journal

Um Ensaio Bioluminescência Cálcio de análise funcional do Mosquito ( Aedes aegypti) E Tick ( Rhipicephalus microplus) G receptores acoplados à proteína

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