Um Ensaio Bioluminescência Cálcio de análise funcional do Mosquito ( Aedes aegypti) E Tick ( Rhipicephalus microplus) G receptores acoplados à proteína

O objetivo geral do experimento a seguir é analisar as relações entre estrutura e atividade de neuropeptídeos de artrópodes sintetizados sobre seus receptores GPCR cognatos. Isso é alcançado pela transfeção de células de ovário de hamster chinês, linhagem K1 vazia, com o vetor de expressão do GPCR desejado para obtenção de linhagens celulares estavelmente transformadas derivadas de uma única célula; como segundo passo, a linhagem celular estável é transfectada com o plasmídeo quaran, que carrega o repórter Gina Quaran para medir a bioluminescência intracelular no ensaio em placa de bioluminescência do cálcio. Em seguida, o ensaio em placa de bioluminescência do cálcio é realizado para determinar os níveis citoplasmáticos de cálcio após a aplicação do ligante peptídico a essas células recombinantes.

Obtêm-se resultados que mostram diferenças nas unidades de bioluminescência após a aplicação de peptídeos com estruturas diferentes ou de concentrações distintas de peptídeos em células recombinantes, com base na liberação intracelular de cálcio induzida, conforme detectado pelo repórter uma corrina no ensaio em placa. A principal vantagem do uso de linhagens celulares clonais estavelmente transformadas que expressam GPCRs recombinantes, em comparação com tendências e protocolos de expressão, é que os níveis de expressão do receptor são mais uniformes, permitindo consistência e reprodutibilidade dos resultados. Além disso, o direcionamento da proteína aquarina para as mitocôndrias permite medições sensíveis de cálcio por meio da bioluminescência, demonstrando o experimento. Hoje estarão presentes dois estudantes de pós-graduação, Shallin Lie e Simon Kersch, bem como um pós-doutorando do meu laboratório.

Para estabelecer linhagens celulares estáveis, comece cultivando células de ovário de hamster chinês, linhagem K1 vazia, a 37 graus Celsius em um incubador umidificado com 5% de dióxido de carbono. Mantenha as células vazias em meio de crescimento com antibiótico antimicótico 1x após as células estarem crescendo saudavelmente. Semee as células de ovário de hamster chinês K1 em frascos de cultura tecidual T25 e cultive as células durante a noite em meio de crescimento sem antibióticos até atingirem cerca de 30% de confluência.

Antes da transfeção, prepare um vetor de expressão de DNA contendo o receptor acoplado à proteína G de interesse conforme descrito no protocolo escrito. Combine o DNA com 100 microlitros de meio Optum com soro reduzido.

Misture seis microlitros do reagente de lipofecção em 100 microlitros de meio F 12 K sem soro e incube em temperatura ambiente por 30 a 45 minutos. Após a incubação, misture suavemente as soluções de DNA e de lipofecção gota a gota. Deixe a mistura em repouso à temperatura ambiente por 10 a 15 minutos em um tubo de 15 mililitros.

Misture suavemente a mistura de transfeção em 1,8 mililitros de meio F 12 K fresco, gota a gota. Em seguida, lave as células com PBS e adicione esta nova solução de transfeção às células. Após uma incubação de 18 horas.

Substitua o meio por F 12 K, meio acrescido de 10% de FBS sem antibióticos e incube durante a noite no dia seguinte. Divida as células em dois frascos T 25 com F 12 K, meio acrescido de 10% de FBS sem antibióticos conforme descrito no procedimento escrito. Incube por mais 18 horas.

Substitua o meio por meio seletivo. Em seguida, cultive as células utilizando o meio seletivo por três a quatro semanas ao longo do tempo. Isso selecionará células que incorporaram de forma estável o plasmídeo ao seu DNA genômico.

Continue mantendo as células usando o meio de manutenção, congelando periodicamente as linhagens celulares para prevenir perda em caso de contaminação inesperada. Para selecionar linhagens celulares clonais, primeiro trypsinize os cultivos e centrifugue as células com meio de manutenção conforme descrito no protocolo escrito. Em seguida, ressuspenda as células em cinco mililitros de meio de manutenção.

Remova 0,5 mililitros da suspensão celular e adicione 4,5 mililitros de meio de manutenção fresco para fazer uma diluição 10 x e transfira 100 microlitros da diluição 10 x para 12 poços de uma placa de 96 poços para seleção de células individuais. Continue fazendo diluições seriadas 10 x dessas células cerca de 19 vezes para obter uma suspensão final teórica de uma célula por 100 microlitros e transfira 100 microlitros de cada diluição seriada para 12 poços de uma placa de 96 poços. Após 18 horas de incubação, observe as placas de 96 poços em um microscópio invertido de luz ou de fluorescência e marque os poços que parecem conter apenas uma única célula ou duas células que obviamente se dividiram a partir de uma única célula.

Observe as placas diariamente, trocando o meio a cada três dias. Deixe as células crescerem por uma semana, até atingirem cerca de 80% de confluência. Em seguida, lave os poços marcados com 200 microlitros de PBS e tripsina.

Cubra os olhos com 100 microlitros de solução de PBS tripsina EDTA. Remova a solução de PBS tripsina EDTA. Adicione 100 microlitros de meio de manutenção e transfira as células de cada poço marcado para um poço de uma placa de seis poços contendo um mililitro de meio de manutenção.

Após cultivar as células em placa de seis poços por três dias, transfira as células para frascos T 25 individuais. Congele periodicamente a linhagem celular para que possa ser recuperada caso as células deixem de apresentar desempenho consistente. Para determinar a linhagem celular com maior resposta, teste as células transferidas utilizando o ensaio de bioluminescência de cálcio com um ligante ativo, como o receptor, peptídeo, ligante ou outro agonista controle positivo.

O ensaio de bioluminescência de cálcio será demonstrado em detalhes posteriormente neste vídeo. Realize a seleção de células individuais uma segunda vez antes de prosseguir com o experimento. Quando linhagens celulares clonais são escolhidas para ensaios e mantidas em cultura, é fundamental acompanhar os números de passagem, pois células com alto número de passagem podem deixar de funcionar adequadamente em um frasco T 25.

Linhagens celulares expressando o receptor desejado em meio de manutenção até cerca de 90% de confluência. Após trypsinizar e centrifugar as células ressuspendidas, suspenda-as no meio de manutenção, dilua as células aproximadamente 10 vezes com meio de manutenção e conte o número de células com um hemocitômetro. Em seguida, ajuste o número de células para aproximadamente duas vezes 10 à quinta potência de células por mililitro, semeie dois mililitros das células em cada poço de uma placa de seis poços e incube a placa por 24 horas, após as quais as células devem estar com cerca de 60% de confluência antes do início do ensaio de placa de bioluminescência de cálcio.

Prepare o gene repórter de interesse na construção do vetor de expressão. Aqui é utilizado um repórter de quórum expresso em mitocôndrias. Em seguida, transfete as células com um micrograma desse plasmídeo repórter conforme descrito no protocolo escrito.

Após incubação das células em uma placa de seis poços por 24 horas, realiza-se a tripsinização, centrifugação e ressuspende-se as células, contando-as para obter uma concentração de 400.000 células por mililitro e transferindo 100 microlitros para cada poço de uma placa de microtitulação branca de 96 poços com fundo fino, incubando por mais 24 horas até que seja atingida uma confluência de aproximadamente 80%. Essa é a concentração ideal de células para o ensaio de bioluminescência. Os passos seguintes devem ser realizados no escuro, mas são mostrados aqui sob luz.

Para fins demonstrativos, prepare meio DME livre de cálcio contendo cinco micromolares de CHO terezin suficiente para 90 microlitros por poço. Remova o meio antigo da placa e adicione 90 microlitros em cada poço. Incube as placas por três horas no escuro a 37 graus Celsius e 5% de dióxido de carbono, após o que as células estarão prontas para serem testadas.

Esta demonstração é realizada utilizando um leitor de placas Nova Star no modo de bioluminescência. Para iniciar a purga, a placa com as amostras deve ser colocada no suporte de placas enquanto estiver no escuro. Solubilize os peptídeos em um tubo EOR de 1,5 mililitro.

Utilizando quantidade suficiente de DME sem cálcio e meio para 10 microlitros de peptídeo 10 x por poço. Ajuste a profundidade de aspiração e a determinação da posição da solução de peptídeo antes do uso. Desafie as células com 10 microlitros do peptídeo e imediatamente comece a registrar a emissão de luz.

Nesta demonstração, o instrumento é configurado para registrar a emissão de luz a 465 nanômetros para cada poço a cada dois segundos, durante um tempo total de 50 segundos. Após a conclusão da corrida, lave as bombas do equipamento. Repita o processo para cada amostra de peptídeo, salve os dados e lave novamente as bombas do equipamento após o ensaio.

Os dados de emissão de luz de cada poço são transferidos automaticamente para uma planilha do Microsoft Excel pelo programa de software. Cole os dados do Excel no Prism Software 4.0. Gere um gráfico com as várias concentrações de peptídeo no eixo x e as unidades de bioluminescência.

No eixo Y, selecione uma análise de ajuste de curva de regressão não linear para obter curvas de resposta à concentração para cada peptídeo em seus respectivos valores de CE 50. Cada experimento deve ser repetido três vezes para a análise dos dados. Quando expresso em ovário de hamster chinês, células K um, o receptor de quinina do mosquito Aedes aegypti comportou-se como um receptor multiligante e respondeu funcionalmente a concentrações tão baixas quanto um amino ácido.

Para as três cininas endógenas de oito aegypti testadas isoladamente utilizando o ensaio de placa de bioluminescência de cálcio. Foram determinados valores de CE 50 estatisticamente diferentes de cerca de 16 nanomolares para a oito aegypti cinina 3, 26 nanomolares para a oito aegypti cinina 2 e 49 nanomolares para a oito aegypti cinina 1, resultando em uma ordem de potência na qual a oito aegypti cinina 3 é a mais potente e a oito aegypti cinina 1 é a menos potente, conforme mostrado. Abaixo está a comparação da atividade de seis análogos de cinina com ácido alfa amino ISO butírico sobre a linhagem celular de ovário de hamster chinês K1 que expressa o receptor de cinina de carrapato, avaliada por meio de um ensaio de placa de bioluminescência de cálcio.

O eixo Y representa a porcentagem de unidades máximas de bioluminescência para cada análogo, expressa como percentual da bioluminescência observada em uma concentração em relação à resposta máxima observada em todas as concentrações testadas para cada análogo. O peptídeo HEXA KININA F-F-F-S-W-G amida é o controle positivo para a atividade do receptor. O análogo de cinina com substituição simples, F ácido aminobutírico ISO WG amida, foi mais ativo do que o peptídeo HEXA KININA análogo controle positivo; o análogo de cinina com duas substituições por ácido aminobutírico, ácido aminobutírico FF ácido aminobutírico WG amida, foi o mais potente dentre os análogos com dupla substituição testados. Após assistir a este vídeo, você deverá ter uma boa compreensão de como expressar A-G-P-C-R e obter linhagens celulares clonais para analisar relações estrutura-atividade de ligantes em receptores por meio de um ensaio de bioluminescência de cálcio.