Name: Bioluminescent Phage Reporter para a detecção de patógenos bacterianos Categoria A (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-07-08T12:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 31 s
Description: Aprenda a detectar Yersinia pestis usando fagos repórter bioluminescentes. Este método permite identificação rápida do patógeno de categoria A em minutos, auxiliando na biosegurança e no diagnóstico precoce da peste.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Esta pesquisa foi apoiada pelo Programa de Pequenas Business Innovation Research do National Institutes of Health (NIAID, 1R43AI082698-01) e do USDA Instituto Nacional de Alimentação e Agricultura (Nifa, 2009-33610-20028).

1. Y. pestis inoculação placa <ol><li> Streak Y. pestis A1122 (BeiResources # NR15) em culturas de Luria-Bertani (LB) ágar (Miller). Use técnica estéril e executar todas as Y. manipulações pestis em um tipo II classe A biossegurança gabinete. Y. pestis A1122 é um Nível de Biossegurança (BSL) 2 estirpe agente excluídos selecionar. Falta-lhe tanto os 75 kb par de cálcio de baixa virulência de resposta (LCR) plasmídeo, eo locus pgm que são necessários para a virulência. Crescer Y. pestis a 28 ° C por 48 h em uma temperatura controlada de ar estática incubadora. A taxa de crescimento de Y. pestis é lento com um tempo de geração de 1,25 h 9. </li></ol> 2. Y. pestis líquido media inoculação <ol><li> Transferência de um único Y. pestis colônia em um estéril 17 x 100 milímetros tubo de cultura contendo 2 mL de caldo LB usando um loop de inoculação estéril metal. Selecione uma colônia que é uniforme em tamanho, é indicativo de outras colônias, e é claramente separada do resto das colônias na placa. Tubo de vórtice brevemente e crescer a cultura a 28 ° C por aproximadamente 20 h em uma incubadora de agitação (225 rpm). </li></ol> 3. Y. conseqüência pestis, além fago repórter, e detecção bioluminescentes <ol><li> Diluir o Y. overnight pestis 1:20 cultura em caldo LB fresco em um tubo falcon de 50 mL (por exemplo, 500 mL de células em 9,5 mL de meio) e crescer a 28 ° C com agitação (225 rpm). Crescer até uma densidade óptica a 600 nm (A 600) de 0,2 é atingido (cerca de 5 h). Células em crescimento activo são preferíveis para a detecção desde a capacidade dos fagos para transduzir uma resposta bioluminescentes está correlacionada com a viabilidade e adequação das bactérias host. No entanto, o sistema de detecção foi mostrado para ser compatível com células colhidas em todas as fases do ciclo de crescimento 7. </li><li> Gerar o substrato necessário para a reação bioluminescente, preparando uma solução de 2% n-Decano. Misturar 200 mL de n-Decano com 9,8 mL de caldo LB. Vortex vigorosamente durante 5 s. Primeiro a microplaca luminômetro injector com 2 mL da solução 2% n-Decano. Pré-definir o luminômetro para autoinject 67 mL da solução decanal a cada microplaca e logo em seguida ler a amostra para 10 s. </li><li> Dispense um alíquotas mL de caldo LB em 3 tubos de cultura. Adicionar 20 mL da solução-mãe repórter fago (estoque de 5 x 10 9 unidades formadoras de placa [UFP] / mL) a cada tubo; o fago e amostras de mídia só serve como um controle negativo. Na ausência de Y. células pestis, a adição do fago repórter não deve provocar uma resposta bioluminescente. </li><li> Dispense um alíquotas mL da Y. pestis cultura (a partir do passo 3.1) em 6 tubos de cultura. Adicionar 20 mL do estoque fago repórter a 3 das culturas (culturas de teste). Os restantes três culturas servir de "células sozinho 'controle negativo (autobioluminescence fundo). Mix culturas em vortex brevemente, e 200 mL de colheita de cada amostra (para o tempo 0 lido) e dispensar em uma placa de microtitulação de 96 poços branco. Incubar a cultura restantes a 28 ° C com agitação (225 rpm). </li><li> Medir o tempo 0 amostras para bioluminescência (unidade relativa de luz, RLU), utilizando o luminômetro. </li><li> ML colheita 200 de cada amostra após 10, 20, 30, 40, 50 e 60 min Além fago pós-repórter, e medir a amostra de bioluminescência. Se Y. pestis células estão presentes, o fago repórter vai se ligam especificamente para a célula, injetar seu DNA, e usar o hosts maquinaria transcricional e translacional para transcrever e traduzir os genes repórter luxAB (Figura 1). </li><li> A força do sinal eo tempo de resposta do sinal é proporcional ao número de células presentes. Em altas concentrações de células (10 5 a 10 8 UFC / mL), um aumento significativo na RLU comparados com os controles devem ser evidente dentro de 20 min. Em concentrações mais baixas de células, (10 2 -10 4 UFC / mL), um aumento significativo na RLU deve ser evidente dentro de 40-60 min. </li><li> Como alternativa, para agilizar o processo de detecção sem a necessidade de Y. pestis conseqüência, uma colônia de uma placa de recém-cultivada pode ser misturado (em vórtice) diretamente em um tubo eppendorf 1,5 mL com 200 mL de caldo LB abrigar o fago repórter. Dispense a mistura de células / fago em um poço de uma placa de microtitulação. Incubar a placa de microtitulação a 28 ° C e ler a amostra para bioluminescência após 60 min (único momento apenas). </li></ol> 4. Resultados representativos: A experiência é claro representante tempo de fago repórter mediada detecção de Y. pestis é retratado na Figura 2. Os controles negativos de 1) fago sozinho (sem células), ou 2) células sozinho (sem fago) fornecem níveis basais de bioluminescência de aproximadamente 20 em todo o RLU 60 min incubation (níveis basais são específicos luminômetro). Em contraste, um aumento de bioluminescência para as amostras de teste (fago repórter e células) é evidente aos 15 min após a adição do fago. A intensidade do sinal deve aumentar de forma constante durante 60 min. Incubações por períodos de tempo prolongado (mais de 80 min), resultará em um sinal de que vai diminuir a partir do sinal de pico devido à lise mediada fago das células do hospedeiro. Resultados semelhantes foram obtidos em temperaturas de incubação de 37 ° C, embora a temperatura ótima para Y. crescimento pestis é de 28 ° C 9. <img src="/files/ftp_upload/2740/2740fig2.jpg" alt="Figura 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 2"> Figura 2. Phage mediada detecção bioluminescente de Y. pestis. No tempo 0, fago repórter e as células foram misturadas, incubados a 28 ° C, e bioluminescência (RLU) foi monitorado ao longo do tempo. Um aumento significativo em RLU (* Estudantes t-test, p &lt;0,05) é evidente dentro de 15 min.

<ol><li>Darling, R. G., Catlett, C. L., Huebner, K. D., Jarrett, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Threats+in+bioterrorism.+I%3A+CDC+category+A+agents%5BTitle%5D)+AND+%22Emerg+Med+Clin+North+Am%22%5BJournal%5D)">Threats in bioterrorism. I: CDC category A agents.</a> Emerg Med Clin North Am. 20, 273-309 (2002).</li>
<li>Chu, M. C. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aChu%2C+MC+%22Laboratory+manual+of+plague+diagnostic+tests.%22">Laboratory manual of plague diagnostic tests.</a>. , Centers for Disease Control and Prevention. Atlanta. (2000).</li>
<li>, (1999).</li>
<li>Inglesby, T. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Anthrax+as+a+biological+weapon%2C+2002%3A+updated+recommendations+for+management%5BTitle%5D)+AND+%22JAMA%22%5BJournal%5D)">Anthrax as a biological weapon, 2002: updated recommendations for management.</a> JAMA. 287, 2236-2252 (2002).</li>
<li>Schuch, R., Fischetti, V. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detailed+genomic+analysis+of+the+Wbeta+and+gamma+phages+infecting+Bacillus+anthracis%3A+implications+for+evolution+of+environmental+fitness+and+antibiotic+resistance%5BTitle%5D)+AND+%22J+Bacteriol%22%5BJournal%5D)">Detailed genomic analysis of the Wbeta and gamma phages infecting Bacillus anthracis: implications for evolution of environmental fitness and antibiotic resistance.</a> J Bacteriol. 188, 3037-3051 (2006).</li>
<li>Garcia, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+genome+sequence+of+Yersinia+pestis+bacteriophage+phiA1122+reveals+an+intimate+history+with+the+coliphage+T3+and+T7+genomes%5BTitle%5D)+AND+%22J+Bacteriol%22%5BJournal%5D)">The genome sequence of Yersinia pestis bacteriophage phiA1122 reveals an intimate history with the coliphage T3 and T7 genomes.</a> J Bacteriol. 185, 5248-5262 (2003).</li>
<li>Schofield, D. A., Molineux, I. J., Westwater, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Diagnostic+bioluminescent+phage+for+detection+of+Yersinia+pestis%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Clinical+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Diagnostic bioluminescent phage for detection of Yersinia pestis.</a> Journal of Clinical Microbiology. 47, 3887-3894 (2009).</li>
<li>Schofield, D. A., Westwater, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phage-mediated+bioluminescent+detection+of+Bacillus+anthracis%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Applied+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Phage-mediated bioluminescent detection of Bacillus anthracis.</a> Journal of Applied Microbiology. 107, 468-478 (2009).</li>
<li>Chu, M. C. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aChu%2C+MC+%22CDC%3A+Basic+laboratory+protocols+for+the+presumptive+identification+of+Yersinia+pestis%22">CDC: Basic laboratory protocols for the presumptive identification of Yersinia pestis</a>. , Centers for Disease Control and Prevention. 1-19 (2001).</li>
<li>Gunnison, J. B., Larson, A., Lazarus, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+differentiation+between+Pasteurella+pestis+and+Pasteurella+pseudotuberculosis+by+action+of+bacteriophage%5BTitle%5D)+AND+%22J+Infect+Dis%22%5BJournal%5D)">Rapid differentiation between Pasteurella pestis and Pasteurella pseudotuberculosis by action of bacteriophage.</a> J Infect Dis. 88, 254-255 (1951).</li>
<li>Lazarus, A. S., Gunnison, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Action+of+Pasteurella+pestis+Bacteriophage+on+Strains+of+Pasteurella%2C+Salmonella%2C+and+Shigella%5BTitle%5D)+AND+%22J+Bacteriol%22%5BJournal%5D)">The Action of Pasteurella pestis Bacteriophage on Strains of Pasteurella, Salmonella, and Shigella.</a> J Bacteriol. 53, 705-714 (1947).</li>
<li>Sergueev, K. V., He, Y., Borschel, R. H., Nikolich, M. P., Filippov, A. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+and+sensitive+detection+of+Yersinia+pestis+using+amplification+of+plague+diagnostic+bacteriophages+monitored+by+real-time+PCR%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Rapid and sensitive detection of Yersinia pestis using amplification of plague diagnostic bacteriophages monitored by real-time PCR.</a> PLoS One. 5, e11337-e11337 (2010).</li>
</ol>

Não há conflitos de interesse declarados.

Este método demonstra a capacidade do fago repórter para detectar rapidamente Y. pestis desde o fago repórter pode converter uma resposta de sinal bioluminescente para Y. cultivadas pestis células dentro de 20 min após a adição do fago. O fago repórter também é capaz de detectar diretamente Y. pestis em matrizes clínico, sem o pré-requisito de isolamento e cultivo de 7 subseqüente. Em comparação com os ensaios fago padrão de lise, que normalmente exige 48 h para a conclusão...

<table border="1"><tbody><tr><th> Nome do reagente </th><th> Companhia </th><th> Número de catálogo </th></tr><tr><td> Difco agar LB, Miller </td><td> VWR </td><td> 90003-346 </td></tr><tr><td> Difco LB caldo, Miller </td><td> VWR </td><td> 90003-350 </td></tr><tr><td> 17 x 100 mm tubos cultura </td><td> EUA Scientific </td><td> 1485-0810 </td></tr><tr><td> n-Decano </td><td> Sigma </td><td> D7384 </td></tr><tr><td> Veritas luminômetro </td><td> Turner Biosystems </td><td> 9100-001 </td></tr><tr><td> Microlite de microtitulação de 96 poços da placa </td><td> VWR </td><td> 62402-984 </td></tr></tbody></table>

&quot;bioluminescent &#39;phage reporter para a detecção de patógenos bacterianos categoria a

'Bioluminescent' Reporter Phage for the Detection of Category A Bacterial Pathogens

Yersinia pestis e Bacillus anthracis Categoria A são bactérias que são os agentes causadores da praga e antraz, respectivamente 1. Embora a ocorrência natural de ambas as doenças "agora é relativamente rara, a possibilidade de grupos terroristas com estes patógenos como uma arma biológica é real. Por causa da comunicabilidade inerente da doença, evolução clínica rápida e alta taxa de mortalidade, é fundamental que um surto ser detectados rapidamente. Portanto metodologias que proporcionam a rápida detecção e diagnóstico são essenciais para garantir a implementação imediata de medidas de saúde pública e ativação de gestão de crises. Fago recombinante repórter pode proporcionar uma abordagem rápida e específica para a detecção de Y. pestis e B. anthracis. Os Centros de Controle e Prevenção de Doenças atualmente usam os ensaios de lise clássica fago para a identificação confirmada destes patógenos bacterianos 2-4. Estes ensaios aproveitar naturalmente fago que são específicas e lítico para seus hospedeiros bacterianos. Após o crescimento durante a noite da bactéria cultivada na presença do fago específico, a formação de placas (lise bacteriana) fornece uma identificação positiva do alvo bacteriana. Embora estes ensaios são robustos, eles sofrem de três problemas: 1) eles são em laboratório; 2) requerem isolamento bacteriano e cultivo da amostra suspeita, e 3) eles levam 24-36 h para completar. Para tratar dessas questões, fago recombinante repórter "light-com a tag" foram geneticamente modificados através da integração do Vibrio harveyi luxAB genes no genoma de Y. pestis e B. anthracis fago específico 5-8. O fago repórter resultando luxAB foram capazes de detectar o seu alvo específico, rapidamente (em minutos) e com sensibilidade conferir um fenótipo bioluminescentes para células receptoras. Importante, a detecção foi obtido tanto com células cultivadas ou destinatário com mock-infectados amostras clínicas 7. Para fins de demonstração, aqui descrever o método para a detecção fago-mediada de um Y. conhecida pestis isolar usar um fago repórter luxAB construído a partir da praga CDC diagnóstico fago ΦA1122 6,7 (Figura 1). Um método semelhante, com pequenas modificações (por exemplo, mudança na temperatura de crescimento e media), pode ser usado para a detecção de B. anthracis isola usando o B. anthracis Wβ fago repórter:: luxAB 8. O método descreve a transdução mediada por fagos de um fenótipo biolumescent para Y. cultivada pestis células que são posteriormente medido com um luminômetro. As principais vantagens deste método sobre os ensaios de lise tradicional fago é a facilidade de uso, os resultados rápidos, e a capacidade de testar múltiplas amostras ao mesmo tempo em um formato de placa de 96 poços de microtitulação. <img src="/files/ftp_upload/2740/2740fig1.jpg" alt="Figura 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 1"> Figura 1. Esquema de detecção. O fago são misturados com a amostra, o fago infecta a célula, luxAB são expressos, e os bioluminesces celular. Processamento da amostra não é necessário; o fago e são misturadas e, posteriormente, medido para a luz.

Um método simples para a identificação de patógenos bacterianos prioridade é a utilização de fagos repórter geneticamente modificadas. Estes fagos repórter, que são específicas para sua espécie de hospedeiro particular, são capazes de transdução rapidamente uma resposta de sinal bioluminescentes para células hospedeiras. Relata-se o uso de fagos repórter para a detecção de<em&gt; Yersinia pestis</em&gt;.

&quot;Bioluminescent &#39;Phage Reporter para a detecção de patógenos bacterianos Categoria A

Yersinia pestis e Bacillus anthracis são patógenos bacterianos da Categoria A que são os agentes causadores da peste e do antraz, respectivamente 1. ...

Yesinia pestis e Bacillus anthracis são patógenos bacterianos do grupo A que são os agentes causadores da peste e do antraz, respectivamente. Embora a ocorrência natural de ambas as doenças seja atualmente relativamente rara, a possibilidade de grupos terroristas utilizarem esses patógenos como arma biológica é real. Este vídeo demonstra um método para detectar e identificar Yersinia pestis.Primeiro, o microrganismo é cultivado em placas com meio ágar e em meio líquido. Em seguida, um pH repórter específico para Y. pestis é adicionado ao cultivo. O pH repórter possui no seu genoma os genes que codificam a luciferase bacteriana, luxE AB.Se células de Y. pestis estiverem presentes, o fago repórter ligar-se-á especificamente à célula, injetará seu DNA recombinante, carregando os genes luxe AB, e utilizará a maquinaria transcricional e translacional do hospedeiro para transcrever e traduzir os genes repórter luxe AB. Os resultados obtidos mostram que as amostras adquiriram um fenótipo bioluminescente, indicando que o microrganismo desconhecido foi positivamente identificado como Y. pestis. A principal vantagem desta técnica em relação aos métodos existentes, como o ensaio tradicional de lise por fago, é que o tempo necessário para detectar e identificar Y. pestis é de minutos em vez de dias. Este método pode auxiliar na identificação rápida e na detecção da presença de Y. pestis utilizando culturas isoladas ou diretamente de amostras clínicas ou ambientais complexas.As implicações dessa técnica estendem-se ao diagnóstico da peste, pois a doença é geralmente fatal, se não for tratada nas primeiras 24 horas após o início dos sintomas. Assim, a identificação rápida de Yersinia pestis é essencial para um prognóstico positivo. Como existem fagos para quase todas as espécies bacterianas, a metodologia pode potencialmente ser adaptada para qualquer espécie que seja medicamente, ambientalmente ou agriculmente importante, como Y. pestis.A 1122 é uma linhagem de agente selecionado excluído de nível dois de biossegurança. Ela carece tanto do plasmídeo de virulência PRC, de resposta ao cálcio Perlo de 75 quilobases, quanto do locus PGM, ambos necessários para a virulência. Inicie este procedimento em uma cabine de biossegurança classe dois tipo A, utilizando técnica estéril para semear Y. pestis, A 1122.Cultive os culturas estoque em ágar LB conforme mostrado aqui. Incube as placas de cabeça para baixo em um incubador de ar estático com temperatura controlada a 28 graus Celsius por 48 horas. A taxa de crescimento de Y. pestis é lenta, com um tempo de geração de 1,25 hora após dois dias.Use um alça de inóculo metálica estéril para coletar uma única colônia de Y. pestis. Selecione uma colônia que seja uniforme em tamanho, representativa das demais colônias e claramente separada do restante das colônias na placa. Transfira a colônia para um tubo de cultura estéril de 17 por 100 milímetros contendo dois mililitros de caldo LB.Tampe o tubo e vortexe brevemente, em seguida coloque-o em um incubador com agitação a 225 RPM a 28 graus Celsius por aproximadamente 20 horas. Para este ensaio, células em crescimento ativo são preferíveis para detecção. Como a capacidade do fago de transduzir está relacionada, a resposta bioluminescente é correlacionada à viabilidade e ao condicionamento das bactérias hospedeiras.No entanto, demonstrou-se que o sistema de detecção é compatível com células colhidas em todas as fases do ciclo de crescimento. Após 20 horas de crescimento, dilua a cultura de Y pestis na proporção de um para vinte em um tubo cônico de 50 mililitros, adicionando 500 microlitros de células a 10 mililitros de caldo lb. Devolva a cultura ao incubador com agitação a 28 graus Celsius.Deixe a cultura crescer até atingir uma densidade óptica em 600 nanômetros de 0,2. Isso deve levar aproximadamente cinco horas para gerar o substrato da reação bioluminescente. Prepare uma solução de N-decanal a 2% combinando 200 microlitros de N-decanal com 9,8 mililitros de caldo LB.Agite vigorosamente por cinco segundos. Em seguida, prepare o injetor do Luminômetro de Placas. Coloque uma extremidade da tubulação do injetor e um tubo de 13 mililitros contendo solução de decal a 2% e a outra extremidade da tubulação do injetor em um recipiente de resíduos.Usando o software do equipamento, instrua a máquina a escorificar a linha do injetor com dois mililitros da solução de decanal. A linha deve encher-se com um substrato após a conclusão; coloque a extremidade da linha do injetor de volta em sua posição definida, pronta para injetar nos poços. Em seguida, instrua o luminômetro a injetar automaticamente 67 microlitros da solução de deel em cada microplaca.Então, meça imediatamente o nível de bioluminescência emitido durante 10 segundos. Em seguida, para preparar cada amostra e triplicata, rotule três tubos de cultura para cada condição. Aqui, serão preparados controles apenas com meio e controles apenas com células, além de uma amostra de teste.Portanto, são necessários nove tubos para preparar as amostras controle somente com fago; distribua alíquotas de um mililitro de caldo LB em três tubos de cultura. Adicione 20 microlitros do fago repórter. Solução estoque contendo cinco vezes 10 à nona unidades formadoras de placa, ou PFU, por mililitro em cada tubo.Na ausência de células de Y pesti, a adição do fago repórter não deve provocar uma resposta bioluminescente. Em seguida, para preparar as amostras de teste, distribua alíquotas de um mililitro da cultura de Y pesti em três tubos de cultura. Adicione 20 microlitros do estoque de fago repórter a três das culturas.Misture as culturas por vortexação breve para preparar as células isoladas. Controles negativos, que são usados para determinar a auto-bioluminescência de fundo, distribua alíquotas de um mililitro da cultura de Y. pestis em três tubos de cultura adicionais. Uma vez que as amostras tenham sido preparadas, transfira 200 microlitros de cada cultura para os poços de uma placa microtituladora branca de 96 poços para a leitura do tempo zero.Coloque o restante de cada cultura no agitador a 28 graus Celsius utilizando um luminômetro de microplaca. Meça o tempo. Zere as amostras para bioluminescência ou unidades de luz relativa.Realize medições de bioluminescência coletando 200 microlitros de cada cultura e realizando leituras no Luminômetro de Placas no tempo de 20, 30, 40 e 60 minutos. Após adicionar o fago repórter para acelerar o processo de detecção sem a necessidade de crescimento de Y. pestis, transfira uma colônia de uma placa recém-cultivada para um tubo microcêntrifuga contendo 200 microlitros de LB, contendo o fago repórter. Misture a amostra por vortex, em seguida distribua a mistura de células e fago em um poço de uma placa de microtitulação.Incube a placa de microtitulação a 28 graus Celsius por 60 minutos. Em seguida, leia a amostra para detecção de bioluminescência. O ensaio demonstrado neste vídeo detecta a presença de células de Y pestis conforme descrito na introdução.Quando Y. pestis está presente, o fago repórter se liga a um receptor específico na célula, injeta seu DNA e utiliza a maquinaria transcricional e translacional do hospedeiro para transcrever e traduzir o luxe. Um gene repórter. A intensidade do sinal e o tempo de resposta do sinal são proporcionais ao número de células presentes em altas concentrações de células, de 10 à quinta até 10 à oitava UFCs por mililitro.Um aumento significativo na RLU em comparação com os controles deve ser evidente dentro de 20 minutos em concentrações celulares mais baixas, de 10 elevado a dois a 10 elevado a quatro UFC por mililitro. Um aumento significativo na RLU deve ser evidente entre 40 e 60 minutos. Um experimento representativo de curso temporal do repórter, detecção mediada por fago de Y. pestis, é mostrado aqui nos tempos zero.Fagos repórter e células foram misturados e incubados a 28 graus Celsius, e a bioluminescência em RLU foi monitorada ao longo do tempo. Um aumento nos RLU foi evidente dentro de 12 minutos, sendo significativo com um valor de P menor que 0,05; os controles negativos somente com fago ou somente com células apresentaram níveis basais de bioluminescência de aproximadamente 20 RLU durante toda a incubação de 60 minutos. Observe que os níveis basais são específicos do luminômetro.Em contraste, um aumento na bioluminescência das células-fantasma repórter das amostras-teste é evidente 12 minutos após a adição do fago. A intensidade do sinal deve aumentar progressivamente ao longo de 50 minutos, embora não mostrado aqui, incubações por períodos superiores a 80 minutos resultarão em um sinal que declinará a partir do pico máximo devido à lise mediada por fago das células hospedeiras. Resultados semelhantes são obtidos em temperaturas de incubação de 37 graus Celsius, mesmo que a temperatura ótima para o crescimento de Y. pestis seja 28 graus Celsius.Após assistir a este vídeo, você deverá ter uma boa compreensão de como utilizar o relato recombinante para a detecção. Uma vez dominada a identificação de Yesenia Pestis, esta técnica pode ser realizada em 30 minutos utilizando colônias douradas de S como inóculo inicial. Ao tentar este procedimento e ao usar fagos em laboratório, é importante lembrar que é muito fácil contaminar seus cultivos bacterianos com o fago, o que reduz a possibilidade de contaminação.Use luvas descartáveis de plástico com pontas de pipeta e troque as luvas regularmente. A capacidade do vetor de provocar uma resposta Blum está correlacionada com a aptidão da célula. Assim, após a identificação de Yesenia Pesta, o vetor pode ser utilizado para determinar a suscetibilidade antibiótica do isolado.Por exemplo, células de Yesenia pesta incubadas com concentração inibitória do antibiótico serão incapazes ou terão severamente reduzida a capacidade de produzir um sinal bioluminescente. Em contraste, células de Yesenia pesta, que são resistentes ao antibiótico, não serão comprometidas pela presença do antibiótico e poderão gerar uma resposta bioluminescente análoga à das células não inibidas. Assim, um perfil da suscetibilidade do patógeno a antibióticos pode ser rapidamente determinado.Para fins ilustrativos, utilizamos uma cepa atenuada de Yesenia pesta. Neste experimento, Yesenia pests é uma categoria, um patógeno bacteriano. Ao realizar esta técnica com amostras que são inspecionadas para conter Yesenia Pestis, devem ser seguidas precauções apropriadas de biossegurança e risco biológico.

bioluminescent-reporter-phage-for-detection-category-bacterial

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Imunologia e Infecção

Métodos de imagem de bioluminescência de infecções bacterianas em animais vivos são descritos. Patógenos são modificados para expressar luciferase permitindo que imagens de corpo inteiro óptico de infecções em animais vivos. Modelos animais podem ser infectados com patógenos luciferase expressar eo curso resultante de doença visualizadas em tempo real pela imagem de bioluminescência.

Usando a luciferase Infecções bacterianas Imagem em camundongos

Recentemente, relatou uma nova abordagem para a geração de sondas DNAzyme fluorogênicos que podem ser aplicadas para criar um simples, "mistura-e-ler" teste de fluorescência para a detecção bacteriana. Estas sondas de DNA especiais catalisar a clivagem de um cromóforo-modificado substrato DNA-RNA quimérico, na presença de mistura extracelular em bruto (CEM) produzida por uma bactéria específica, assim, traduzindo a detecção de bactérias em geração do sinal de fluorescência. Neste relatório, irá...

Detecção de bactérias utilizando DNAzymes fluorogénicas

Este artigo descreve a administração...

Imagem bacteriana Bioluminescent<em&gt; Em Vivo</em

Fonte: de Vries, C. R., et al., Um modelo de inoculação retardada da infecção crônica de feridas por Pseudomonas aeruginosa . J. Vis. Exp. (2020).Este vídeo demonstra uma técnica de imagem bioluminescente para monitorar a progressão da infecção bacteriana em um modelo de camundongos vivo. Bactérias patogênicas modificadas com o sistema repórter luxABCDE emitem luz no local da infecção, permitindo a visualização de bactérias metabolicamente ativas. Ao imagear o camundongo ao longo do tempo, os...

Imagem por Bioluminescência de Infecções Bacterianas em Camundongos

Este vídeo demonstra a imagem de fluorescência enzimática repórter (REF) para detecção in vivo da infecção por Mycobacterium tuberculosis. Os camundongos infectados são injetados intraperitonealmente com um substrato para imagens REF. Ao ser hidrolisado pela enzima β-lactamase bacteriana, o substrato emite fluorescência, cuja detecção auxilia na avaliação da infecção.

Imagem de fluorescência enzimática repórter para rastreamento in vivo de infecção bacteriana

As bactérias produzem compostos secretados que têm o potencial de afetar a fisiologia de seus vizinhos microbianas. Aqui nós descrevemos uma tela de co-cultura, que permite a detecção de tais quimicamente mediadas entre espécies interações misturando os micróbios do solo com cepas repórter transcrição fluorescentes de Bacillus subtilis em meios sólidos.

Usando Coculture detectar quimicamente mediada interespécies Interações

Expandindo a fundação e aplicabilidade da fluorescência por Unbound excitação de luminescência (FUEL) através do levantamento os princípios relevantes e demonstrar a sua compatibilidade com uma infinidade de fluoróforos e condições alvo de anticorpos.

A Step Beyond BRET: Fluorescência por Excitação Unbound de luminescência (FUEL)

Um protocolo detalhado de um modelo de mouse para enterohemorrhagic Escherichia coli (EHEC) colonização usando bactérias bioluminescência-etiquetado é apresentado. A detecção destas bactérias bioluminescentes por um não-invasivo na vivo sistema de animais vivos de imagem pode avançar nossa compreensão atual da colonização de EHEC.

Deteção de colonização Enterohemorrhagic Escherichia Coli murino Host pelo sistema não-invasivo na Vivo bioluminescência

Bactérias bioluminescentes produçãode luz através de uma variedade de mecanismos, tais como detecção de quórum. Este novo método permite que a investigação em situ de bioluminescência e a correlação de emissão de luz a densidade celular. Um artificial bioluminescentes Escherichia coli sistema permite a caracterização de operons lux , Lux proteínas e sua interação.

In Situ Medição e correlação da densidade celular e emissão de luz de bactérias bioluminescentes

Descrito aqui é um método de análise de expressão gênica bacteriana em tecidos animais em nível celular. Este método fornece um recurso para estudar a diversidade fenotípica ocorrendo dentro de uma população bacteriana em resposta ao ambiente de tecido durante uma infecção.

Um método baseado em fluorescência para estudar o Regulamento de Gene bacteriano em tecidos infectados

Aqui, descrevemos um procedimento que permite a detecção de bactérias patogênicas em todo o órgão durante a infecção e a quantificação das atividades do repórter fluorescente.

Tomografia tridimensional de órgãos inteiros de alta resolução de infecções microbianas

Aprenda a detectar Yersinia pestis usando fagos repórter bioluminescentes. Este método permite identificação rápida do patógeno de categoria A em minutos, auxiliando na biosegurança e no diagnóstico precoce da peste.

"Bioluminescent 'Phage Reporter para a detecção de patógenos bacterianos Categoria A

Explorar mais vídeos