Name: Isolamento de Brain-infiltrando Leucócitos (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-06-13T12:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 44 s
Description: Aprenda a isolar leucócitos infiltrantes do cérebro de camundongos infectados com TMEV usando gradiente de Percoll e Ficoll. Este método permite caracterizar células imunes por citometria de fluxo.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Este trabalho foi financiado por bolsa NS64571 do NINDS (CLH), por um prêmio no início de desenvolvimento de carreira da Clínica Mayo (CLH), e por um generoso dom de Donald e Herdrich Frances (CLH). Gostaríamos de agradecer a Clínica Mayo Núcleo Citometria de Fluxo para obter assistência.

1. Injeção intracraniana de vírus: A técnica a seguir foi modificada e utilizada extensivamente por nosso laboratório e colegas. Resumidamente, a injeção intracraniana da estirpe de Daniel de murino Theiler de encefalomielite vírus (TMEV) ou sham-infecção (1, 10) é realizada em ratos jovens (de preferência 5-6 semanas de idade) para obter leucócitos cérebro infiltrando (Bils). Por favor, note que os resultados diferem entre estirpe de Daniel, a cepa feijão e da estirpe GDVII. Para efeitos de colheita Bils, ratos receber 2x10 5 UFP de TMEV e são infectadas por 24 horas. <ol><li> Coloque a agulha de injeção (calibre 27, em ¼, Kendall), a uma seringa de 1 ml automática Hamilton e dê origem a 10 ml de vírus. </li><li> Elaborar TMEV em 10 DMEM mL na seringa com muita atenção a bolhas de ar. Quando for o caso, os ratos sham infectado receber 10 ml de DMEM livre de vírus. </li><li> Pouco antes da injeção, despeje cerca de 1 mL de isoflurano em uma redoma de vidro que contém uma grade de arame com substrato de algodão por baixo. </li><li> Camundongos lugar direclty na grade de arame na redoma até que se tornem ligeiramente anestesiado, insensível aos pés pinch-e imobilizado pelos inalantes anestésico, cerca de 10-15 segundos. Camundongos não deve entrar em contato direto com isoflurano, como substância pode ser irritante e cáustico. </li><li> Enquanto sob anestesia, prepare ratos para injeção através de uma rápida localização de coordenadas apropriado na região do córtex frontal no crânio usando barbear e tinta. A localização geral para injeção é de 1 mm anterior ao bregma e 1 mm lateral à sutura sagital do lado direito (Figura 1). Enquanto a injeção estereotáxica pode ser apropriado para algumas situações experimentais, descobrimos que a mão livre, sem injeção de barbear ou de tinta é adequado para a maioria dos experimentos. Parting a pele com a ponta da agulha ao longo de ambos os eixos é apropriado para injeção. </li><li> Para tomar uma injecção, orientar a agulha perpendicular ao crânio e pressione através do osso para cerca de profundidade de 3 mm. </li><li> Expressar vírus no cérebro, pressionando o botão seringa Hamilton para baixo e esperar 2 segundos para que o vírus entra no cérebro antes de retirar. </li><li> Cuidadosamente retire a agulha e coloque o rato em uma gaiola, limpo e seco. Camundongos despertar da anestesia rapidamente e retomar o funcionamento normal em poucos minutos. Dar a devida atenção para os ratos que apresentam sintomas anormais, como sangramento excessivo no local da injecção, como a eutanásia do animal pode ser apropriado. Animal adequado manuseio 6 e adesão aos Institutos Nacionais de Saúde e Cuidados Animais Institucional e diretrizes Comitê Use devem ser seguidas. </li></ol> 2. Brain-infiltrando preparação celular de leucócitos: <ol><li> Prepare de fundo redondo de Oak Ridge do tubos de centrífuga que pode conter uma capacidade de 30 ml com 10 ml RPMI 1640, 9 ml Percoll e 1 ml de PBS 10X e tubos deve sentar-se na RT no banco durante o processo de remoção do cérebro. </li><li> Traga Ficoll-Paque Plus à temperatura ambiente (RT). </li><li> Eutanásia de animais modificados por overdose isoflurano 5 e remover rapidamente o cérebro com uma espátula de tecidos de aço inoxidável e coloque em um tubo cônico de 15 ml contendo 5 ml RPMI no gelo. Em algumas circunstâncias, PBS-perfusão pode ser apropriado para remover células circulantes do sangue periférico de preparação Bils. Ratos deve ser plena e devidamente anestesiado antes da PBS-perfusão. </li><li> Transferência cérebro e RPMI solução para um copo ml 7 Pyrex marca moedor tecido Tenbroeck e gentilmente homogeneizar com 10-15 derrames. </li><li> Pipeta um adicional de 5 ml RPMI para o homogeneizador e pipeta cima e para baixo duas vezes. Homogenato cerebral transferência (aprox. 10 ml) previamente preparado para tubo de fundo redondo e inverter cuidadosamente 2-3 vezes para misturar. </li><li> Spin-homogenato de cérebro de 7800g av por 30 min a RT em uma F0360 rotor de ângulo fixo em uma centrífuga Beckman Allegra X-22R clínico. </li><li> Após a centrifugação, remover mielina detritos que flutuou para o topo do gradiente. Coletar a camada de leucócitos que flutua acima do pellet de glóbulos vermelhos (Figura 2). </li><li> Strain camada de leucócitos através de um filtro de células 40 mM para a 50 ml. Levar a solução até 50 ml com RMPI. </li><li> Tubos contendo girar suspensão diluída de células em uma centrífuga clínica a 1500 rpm (600g ave) por 5 min à temperatura ambiente. </li><li> Aspirar o sobrenadante e recolha o pellet celular. Ressuspender o sedimento em 1 ml tampão FACS (1% albumina sérica bovina, azida sódica 0,02% em cálcio e magnésio livres PBS) e transferir a suspensão celular a 5 ml FACS rodada tubos de fundo. </li><li> Cuidadosamente suspensão underlay com 1 ml Além disso Ficoll-Paque. </li><li> Tubo giratório a 2500 rpm (1400 deu) em centrífuga clínica por 25 min à temperatura ambiente sem freio. </li><li> Remover camada, branco macio na interface (Figura 2) com uma pipeta ml e transferir para o novo 5 ml tubo FACS. Lavar cells com 4 tampão FACS ml. </li><li> Tubo giratório a 1500 rpm (600g ave) por 5 min à temperatura ambiente em centrífuga clínica para as células da pelota. </li><li> Aspirar o sobrenadante e recolher pellet celular. Ressuspender o pellet de leucócitos em tampão apropriado e manter no gelo em tubo FACS novo. </li><li> Contagem de células, avaliar a viabilidade celular por exclusão do azul Trypan e analisar por citometria de fluxo. Em geral, os investigadores podem esperar para adquirir cerca de 5 x 10 5 células / animal. </li></ol> 3. Imunofenotipagem por citometria de fluxo <ol><li> Após o isolamento e contagem de leucócitos, as células rodada por 3 minutos a 1500 rpm (600 deu) em centrífuga clínica. </li><li> Ressuspender o sedimento em tampão de bloqueio contendo o seguinte: tampão FACS, sobrenadante de 2.4G2 hibridoma (Fc block; anti-CD16/32) e soro fetal bovino na proporção de 10:05:01 e incubar por 30 minutos a 4 ° C . </li><li> Prepare e adicione os anticorpos contra antígenos conjugados extracelular para as células bloqueadas em uma concentração de 1:200 e incubar por 30 minutos a 4 ° C no escuro. Stain e incubar as células em 200 mL de uma placa de 96 poços V-bottom. Controles apropriados incluem células imaculada e amostras de compensação fluorocromo, conforme necessário. </li><li> Girar a células coradas em RT por 3 minutos a 1500 rpm (600 deu) em centrífuga clínica usando um apropriado rotor para placas de 96 poços. </li><li> Aspirar o sobrenadante e lavar as células com 200 mL de buffer FACS cuidado pipetando para cima e para baixo 3 vezes. </li><li> Repita a técnica de lavagem acima duas vezes. </li><li> Após a lavagem, ressuspender as células em paraformaldeído 2% e transferir para tubos FACS. Fixação é necessário para análise de citometria de fluxo de células infectadas do Nível de Biossegurança 2 reagentes. </li><li> Executar as células fixas em um BD FACS Calibur seguir um método modificado de citometria de fluxo 8 e analisar arquivos off-line usando programa FlowJo, WinMDI ou outros disponíveis fluxo de software de análise de citometria. </li><li> A análise dos 50-100,000 eventos por amostra geralmente é necessária para imunofenotipagem adequada. </li></ol> Anticorpos diretamente conjugados utilizados neste experimento: CD45 foi detectado com o clone de 30 F11. Ly6C / G foi detectado com o clone Gr1, RB6-8C5. CD11b foi detectado com o clone M1/70. F4/80 foi detectado com o clone BM8. 4. Resultados representativos: Apresentados os resultados de células para fenotipagem Bils do mouse em 24 horas após a infecção (Figura 3). Leucócitos foram coradas com conjugado anti-PerCP mouse-CD45 para detectar células do sistema imunológico, PE-conjugado anti-mouse Ly6C / G para detectar monócitos inflamatórias, APC-conjugado anti-mouse CD11b e APC-conjugado anti-rato F4/80 para detectar células da linhagem de monócitos. A análise foi realizada com um instrumento BD FACS Calibur. <img src="/files/ftp_upload/2747/2747fig1.jpg" alt="Figura 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 1"> Figura 1. Localização anatômica do local da injeção. O local de injecção está localizado a 1 mm anterior ao bregma e 1 mm lateral à sutura sagital do lado direito. <img src="/files/ftp_upload/2747/2747fig2.jpg" alt="Figura 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 2"> Figura 2. Leucócitos ilustração de separação por gradiente de leucócitos e Bils. São inicialmente coletados diretamente abaixo da camada de mielina e detritos acima do pellet RBC no gradiente de Percoll. A camada, branco macio (Bils) na interface é coletado do gradiente de Ficoll. <img src="/files/ftp_upload/2747/2747fig3.jpg" alt="Figura 3" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 3"> Figura 3. Imunofenótipo de cérebro-infilatrating leucócitos em 24 horas pós-infecção leucócitos. Rato foram isoladas a partir do cérebro por centrifugação diferencial densidade do tecido homogeneizados preparados a partir de animais em 24 horas após a infecção intracraniana. Células foram marcadas com anticorpos fluorescente-conjugada contra o rato CD45, Ly6C / G, CD11b e F4/80. Gating inicial foi realizada plotando CD45, um marcador de células do sistema imunológico, contra a dispersão para a frente (FSC), um indicador do tamanho da célula (C). O oi CD45 (A, D), CD45 lo (B, E) e CD45 neg (F, G) populações foram então analisados ​​para os níveis de expressão relativa dos marcadores de monócitos e macrófagos Ly6C / G, F4/80 (A, B , F), e CD11b (D, E, G). Ly6C / G + + F4/80 CD11b + monócitos inflamatórias foram encontradas quase que exclusivamente na população oi CD45 (A, D), de acordo com a infiltração destas células a partir da periferia. Em contraste, macrófagos CD11b Ly6C/G-F4/80 lo + foram encontradas quase que exclusivamente na lo CD45 (B, E) e neg CD45 (G) populações, de acordo com um fenótipo residente. Em numerosos experimentos, nós nunca observamos células CD45 oi ou Ly6C / G + + F4/80 CD11b + monócitos inflamatória no cérebro de não infectados ou sham-infecçãoted camundongos (dados não mostrados).

<ol><li>Buenz, E. J., Howe, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Picornaviruses+and+cell+death%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Picornaviruses and cell death.</a> Trends Microbiol. 14, 28-36 (2006).</li>
<li>Buenz, E. J., Limberg, P. J., Howe, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+high-throughput+3-parameter+flow+cytometry-based+cell+death+assay%5BTitle%5D)+AND+%22Cytometry+A%22%5BJournal%5D)">A high-throughput 3-parameter flow cytometry-based cell death assay.</a> Cytometry A. 71, 170-173 (2007).</li>
<li>Deb, C., Lafrance-Corey, R. G., Zoecklein, L., Papke, L., Rodriguez, M., Howe, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Demyelinated+axons+and+motor+function+are+protected+by+genetic+deletion+of+perforin+in+a+mouse+model+of+multiple+sclerosis%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neuropath.+Exp.+Neurol%22%5BJournal%5D)">Demyelinated axons and motor function are protected by genetic deletion of perforin in a mouse model of multiple sclerosis.</a> J. Neuropath. Exp. Neurol. 68, 1037-1048 (2009).</li>
<li>Deb, C., Howe, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((NKG2D+contributes+to+efficient+clearance+of+picornavirus+from+the+acutely+infected+murine+brain%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurovirol%22%5BJournal%5D)">NKG2D contributes to efficient clearance of picornavirus from the acutely infected murine brain.</a> J. Neurovirol. 14, 261-266 (2008).</li>
<li>Donovan, J., &amp, P. B. rown, , P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Euthanasia%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Protocols+in+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Euthanasia.</a> Current Protocols in Neuroscience. , A.4H.1-A.4H.4 (2005).</li>
<li>Donovan, J., Brown, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Handling+%26+restraint%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Protocols+in+Immunology%22%5BJournal%5D)">Handling & restraint.</a> Current Protocols in Immunology. 73, 1.3.1-1.3.6 (2006).</li>
<li>Donovan, J., Brown, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Parenteral+injections%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Protocols+in+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Parenteral injections.</a> Current Protocols in Neuroscience. , A.4F.1-A.4F.9 (2005).</li>
<li>Holmes, K. L., Otten, G., Yokoyama, W. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Flow+cytometry+analysis+using+Becton+Dickinson+FACS+Calibur%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Protocols+in+Immunology%22%5BJournal%5D)">Flow cytometry analysis using Becton Dickinson FACS Calibur.</a> Current Protocols in Immunology. , 5.4.1-5.4.22 (2002).</li>
<li>Howe, C. L., Ure, D., Adelson, J. D., LaFrance-Corey, R., Johnson, A., Rodriguez, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CD8%2B+T+cells+directed+against+a+viral+peptide+contribute+to+loss+of+motor+function+by+disrupting+axonal+transport+in+a+viral+model+of+fulminant+demyelination%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neuroimmunol%22%5BJournal%5D)">CD8+ T cells directed against a viral peptide contribute to loss of motor function by disrupting axonal transport in a viral model of fulminant demyelination.</a> J Neuroimmunol. 188, 13-21 (2007).</li>
<li>Lipton, H. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Theiler%27s+virus+infection+in+mice%3A+An+unusual+biphasic+disease+process+leading+to+demyelination%5BTitle%5D)+AND+%22Infect+Immun%22%5BJournal%5D)">Theiler's virus infection in mice: An unusual biphasic disease process leading to demyelination.</a> Infect Immun. 11, 1147-1155 (1975).</li>
</ol>

Não há conflitos de interesse declarados.

Rotineiramente uso de citometria de fluxo para determinar a qualidade da preparação das células cerebrais se infiltrando, e para distinguir diferentes populações de células do sistema imunológico 2, 9. Aguda em tempo de pontos, o nosso método Bils rendimentos elevados percentuais de monócitos inflamatória dentro da população CD45hi, bem como altas porcentagens de macrófagos na população CD45lo. Isto indica que uma resposta imune reprodutíveis dentro do cérebro pode ser robustamente caracterizado por nosso mét...

<table border="1"><tbody><tr><th> Reagente </th><th> Companhia </th><th> Número de catálogo </th><th> Comentários </th></tr><tr><td> TMEV </td><td> Howe Lab </td><td> N / A </td><td></td></tr><tr><td> Estirpe de Daniel </td><td> Invitrogen </td><td> 21063-029 </td><td></td></tr><tr><td> isoflurano </td><td> Novaplus </td><td> NDC 0409-3292-49 </td><td></td></tr><tr><td> de fundo redondo de Oak tubos de centrífuga de Ridge </td><td> Nalgene </td><td> 3118-0030 </td><td></td></tr><tr><td> RPMI 1640 </td><td> Invitrogen </td><td> 11875-093 </td><td></td></tr><tr><td> Percoll </td><td> GE Healthcare </td><td> 17-0891-02 </td><td></td></tr><tr><td> PBS 10X </td><td> Roche </td><td> 11666789001 </td><td></td></tr><tr><td> Ficoll-Paque Plus </td><td> GE Healthcare </td><td> 17-1440-02 </td><td></td></tr><tr><td> Trypan Blue 0,4% (w / v) </td><td> Mediatech </td><td> 25-900-CI </td><td></td></tr><tr><td> 15 ml tubos cônicos </td><td> BD Falcon </td><td> 352097 </td><td></td></tr><tr><td> 7 mL de vidro Pyrex marca moedor de tecido Tenbroeck </td><td> Pescador </td><td> 08-414-10B </td><td></td></tr><tr><td> 40 coador célula M </td><td> BD Falcon </td><td> 352340 </td><td></td></tr><tr><td> 50 ml </td><td> BD Falcon </td><td> 352070 </td><td></td></tr><tr><td> albumina de soro bovino </td><td> Sigma </td><td> A9647 </td><td></td></tr><tr><td> azida de sódio </td><td> Sigma </td><td> S8032 </td><td></td></tr><tr><td> CMF-PBS </td><td> Mediatech </td><td> 21-040-CV </td><td></td></tr><tr><td> FACS tubos </td><td> BD Falcon </td><td> 352054 </td><td></td></tr><tr><td> soro fetal bovino </td><td> Sigma </td><td> F4135 </td><td></td></tr><tr><td> 2.4G2 hibridoma </td><td> ATCC </td><td> HB-197 </td><td></td></tr><tr><td> Costar placa V-bottom </td><td> Corning </td><td> 3894 </td><td></td></tr><tr><td> Allegra centrífuga X-22R ou equivalente </td><td> Beckman </td><td> N / A </td><td></td></tr><tr><td> De 96 poços balde placa e rotor </td><td> Beckman </td><td> S2096 </td><td></td></tr><tr><td> Rotor de ângulo fixo </td><td> Beckman </td><td> F0360 </td><td></td></tr><tr><td> paraformaldeído </td><td> Sigma </td><td> P6148 </td><td></td></tr><tr><td> BD FACS Calibur </td><td> BD Biosciences </td><td> N / A </td><td></td></tr><tr><td> Programa FlowJo 7,5 </td><td> Árvore Star, Inc. </td><td> N / A </td><td></td></tr><tr><td> CD45 </td><td> BD Biosciences </td><td> 557235 </td><td> clone: ​​30-F11 </td></tr><tr><td> Gr1 (Ly6C / G) </td><td> BD Biosciences </td><td> 553128 </td><td> clone: ​​RB6-8C5 </td></tr><tr><td> CD11b </td><td> ebiosciences </td><td> 17-0112-83 </td><td> clone: ​​M1/70 </td></tr><tr><td> F4/80 </td><td> ebiosciences </td><td> 17-4801-82 </td><td> clone: ​​BM8 </td></tr></tbody></table>

isolamento de brain-infiltrando leucócitos

Isolation of Brain-infiltrating Leukocytes

Nós descrevemos um método para preparar leucócitos cérebro infiltrando (Bils) de camundongos. Demonstramos como para infectar ratos com encefalomielite murina de Theiler vírus (TMEV) através de uma técnica de injeção intracraniana e rápida como purificar uma população de leucócitos enriquecido de células infiltrando a partir do cérebro inteiro. Resumidamente, os ratos são anestesiados com isoflurano em uma câmara fechada e são free-hand injetado com uma seringa de Hamilton para o córtex frontal. Ratos são, então, matou em vários momentos após a infecção por overdose isoflurano e cérebros inteiros são extraídos e homogeneizados em RPMI com um moedor de tecido Tenbroeck. Homogeneizados de cérebro são centrifugação em um gradiente de Percoll contínua de 30% para remover os restos celulares de mielina e outros. A suspensão de células é então forçada a 40 mM, lavado e centrifugado em um descontínua gradiente de Ficoll-Paque Plus para selecionar e purificar os leucócitos. Os leucócitos são então lavadas e ressuspendidas em tampão apropriado para imunofenotipagem por citometria de fluxo. Citometria de fluxo revela uma população de células do sistema imunológico inato nas fases iniciais da infecção de camundongos C57BL / 6. Menos 24 horas após a infecção, subconjuntos múltiplas de células do sistema imunológico estão presentes no Bils, com uma população enriquecida de Gr1 +, CD11b + e + F4/80 células. Portanto, esse método é útil na caracterização da resposta imune à infecção aguda no cérebro.

Um método rápido para a obtenção de leucócitos infiltrando a partir do cérebro de camundongos é descrito. Este método utiliza um gradiente de Percoll contínua e descontínua gradiente de Ficoll para selecionar e purificar a camada de leucócitos enriquecido. Leucócitos isolados podem então ser caracterizada por medidas de citometria de fluxo.

Isolamento de Brain-infiltrando Leucócitos

Descrevemos um método para a preparação de leucócitos infiltrantes cerebrais (BILs) de camundongos. Demonstramos como infectar camundongos com o vírus murino de Theiler...

O objetivo geral deste procedimento é obter uma população enriquecida de leucócitos contendo células do sistema imunológico inato a partir do cérebro de camundongos infectados agudamente com o vírus da encefalomielite murina, ou TMEV. Isso é realizado primeiramente infectando-se camundongos intracranianamente com TMEV. Em seguida, o cérebro é coletado e homogeneizado suavemente 24 horas após a infecção.O terceiro passo do procedimento é utilizar uma percagem contínua e um gradiente de folha descontínuo para purificar seletivamente a camada de células enriquecida em leucócitos. Em última análise, o fenótipo da população de leucócitos que infiltra o cérebro e que participa da resposta imune à infecção aguda do cérebro pode ser caracterizado por análise citométrica de fluxo. Olá, meu nome é Dr. Charles Howe.O método que demonstraremos hoje pode ajudar a responder perguntas fundamentais na área de neuroimunologia. Por exemplo, quais são as células imunes que infiltram o cérebro durante uma infecção aguda? Demonstrando o método hoje estará Reagan, la France.Corey, um tecnologista sênior de pesquisa no meu laboratório, para recrutar leucócitos infiltrantes cerebrais. Acople uma agulha de 27 gauge a uma seringa automática de um mililitro da Hamilton e ajuste a seringa para liberar 10 microlitros. Aspire 10 microlitros de DMEM infectado com duas vezes 10 à quinta PFU da cepa Daniel do TMEV ou 10 microlitros de DMEM submetido ao procedimento simulado, tomando cuidado com bolhas de ar.Anestesie um camundongo de cinco a seis semanas de idade e confirme a sedação por meio de pin&ccedil;a no dedo do p&eacute;. Prepare o camundongo para a inje&ccedil;&atilde;o localizando rapidamente as coordenadas apropriadas na regi&atilde;o do c&oacute;rtex frontal na parte do cr&acirc;nio, com o pelo do camundongo alinhado ao ponto da agulha ao longo de ambos os AE conforme apropriado para a inje&ccedil;&atilde; o, de modo que a agulha seja orientada perpendicularmente ao cr&acirc;nio e pressione a agulha atrav&eacute;s da cobertura &oacute;ssea at&eacute; uma profundidade aproximada de tr&ecirc;s mil&iacute;metros. Para expressar o DMEM infectado viralmente ou o DMEM controle n&atilde;o infectado no c&eacute;rebro, pressione o bot&atilde;o da seringa Hamilton para baixo e aguarde dois segundos para que o meio entre no c&eacute;rebro antes de retirar.Remova cuidadosamente a agulha e coloque o camundongo em uma gaiola limpa e seca. Os camundongos despertarão rapidamente da anestesia e retomarão a função normal em até um minuto, 24 horas após infecção intracraniana com vírus ou infecção simulada. E antes do isolamento dos leucócitos que infiltram o cérebro, encha um tubo de centrífuga Oakridge de fundo redondo com 10 mililitros de RPMI 1640 mililitros por célula e um mililitro de PBS 10X e armazene o tubo em temperatura ambiente.Retire o kit de marcação com FI mais até a temperatura ambiente e encha um tubo cônico de 15 mililitros com cinco mililitros de RPMI, colocando-o também sobre gelo neste momento. Após sacrificar o animal por sobredosagem modificada de isoflurano, remova rapidamente o cérebro e coloque-o no tubo cônico de 15 mililitros contendo os cinco mililitros de RPMI. Em seguida, transfira o cérebro e a solução de RPMI para um homogeneizador de tecidos de vidro Pyrex de sete mililitros, modelo 10 brook, e homogeneíze suavemente o cérebro com 10 a 15 movimentos.Em seguida, pipete mais cinco mililitros de RPMI para o homogeneizador e aspire e expulse a solução duas vezes. Transfira os aproximadamente 10 mililitros de homogenato cerebral para o tubo de centrífuga cônico previamente preparado e inverta suavemente o tubo de duas a três vezes para homogeneizar. Agora, centrifugue o homogenato cerebral a 7.800 ×g por 30 minutos à temperatura ambiente em uma centrífuga com rotor de ângulo fixo.Após a centrifugação, remova os detritos de mielina que flutuaram para o topo do gradiente. A camada de leucócitos flutua acima do sedimento de hemácias. Filtre a camada de leucócitos através de um filtro celular de 40 micrômetros para um tubo cônico de 50 mililitros.Complete a solução até um volume de 50 mililitros. Com o nosso PMI, gire o tubo contendo a suspensão celular diluída em uma centrífuga clínica a 600 Gs durante cinco minutos. À temperatura ambiente, aspire o sobrenadante e colete o pellet celular.Re-suspenda o pellet em um mililitro de tampão fax e adicione a suspensão celular a um tubo fax redondo de cinco mililitros. Sobreponha cuidadosamente as suspensões com um mililitro do pacote fi à temperatura ambiente e centrifugue os tubos fax a 800 Gs na centrífuga clínica por 25 minutos.À temperatura ambiente e sem interrupção, remova a camada branca e espumosa na interface com uma pipeta de um mililitro e transfira a camada para um novo tubo fax de cinco mililitros. Lave as células com quatro mililitros de tampão fax. Em seguida, centrifugue novamente o tubo na centrífuga clínica para sedimentar as células.Em seguida, aspire o sobrenadante e colete o pellet celular. Re-suspenda o pellet de leucócitos em tampão bloqueador e mantenha no gelo. Depois, conte as células.Após isolar e contar os leucócitos infiltrados no cérebro, plaque as células em uma placa de fundo em V para preparação da imunofenotipagem por citometria de fluxo. Em seguida, centrifugue as células em uma centrífuga clínica.Re-suspenda o pellet em 200 microlitros de tampão bloqueador e incube as células por 30 minutos no gelo. Em seguida, adicione os anticorpos numa concentração de 1 para 200 e incube as células por mais 30 minutos no gelo, desta vez no escuro. Em seguida, centrifugue as células marcadas na centrífuga clínica e aspire o sobrenadante.Adicione 200 microlitros de tampão fax ao pellet e pipete suavemente para cima e para baixo três vezes. Em seguida, lave as células no centrífuga mais duas vezes da mesma forma; após a lavagem final, ressuspenda as células em uma concentração final de 2% de paraformaldeído e transfira as células coradas para tubos fax. Por fim, envie as células fixadas para citometria de fluxo e analise os arquivos offline utilizando um programa de análise fax.Os leucócitos de camundongo foram isolados do cérebro por densidade diferencial, centrifugação de homogeneizado tecidual preparado a partir de animais 24 horas após infecção intracraniana. Como observado nestes dois gráficos de dispersão, monócitos inflamatórios positivos para LY6C, positivos para F4/80 e positivos para CD11b foram encontrados quase exclusivamente na população CD45 alta, compatível com a infiltração dessas células a partir da periferia. Em contraste, macrófagos negativos para LY6C, F4/80 baixo e positivos para CD11b foram encontrados quase exclusivamente nas populações CD45 baixo (dois painéis esquerdos) e CD45 negativo (painel mais à direita), compatível com um fenótipo residente.Após assistir a este vídeo, você deverá ter uma boa compreensão de como preparar leucócitos a partir do cérebro de animais infectados agudamente.

isolation-of-brain-infiltrating-leukocytes

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Imunologia e Infecção

Neste vídeo demonstramos como isolar células mononucleares do sistema nervoso central de ratos com encefalomielite autoimune experimental.

Isolamento de células mononucleares do Sistema Nervoso Central de ratos com EAE

O presente artigo descreve um protocolo rápido de forma eficiente isolamento de células mononucleares a partir de tecidos do cérebro e da medula espinhal que pode ser efetivamente utilizado para análises de citometria de fluxo.

Isolamento do Cérebro e da Medula Espinhal Células Mononucleares Usando Percoll Gradients

Neste vídeo, realizamos o isolamento de células mononucleares do cérebro de um camundongo usando centrifugação por gradiente de densidade. A suspensão isolada de células mononucleares pode ser usada para análises posteriores a jusante.

Isolamento de células mononucleares do cérebro de camundongos: uma técnica de centrifugação por gradiente de densidade para isolar células mononucleares residentes no cérebro

O vídeo demonstra o isolamento de células mononucleares do sangue periférico que se infiltram em tumores a partir de um cérebro de camundongo usando dissociação mecânica e digestão enzimática. Isso é seguido pela centrifugação do gradiente de densidade para coletar as células imunes para análise posterior.

Isolando células imunes infiltrantes de tumor de um cérebro murino

Um método para o isolamento de leucócitos aderentes inflamatórios dos vasos sanguíneos do...

Isolamento e Análise de Cérebro-sequestrados de Leucócitos<em&gt; Plasmodium berghei</em&gt; ANKA infectadas Mice

Cérebro células mielóides caracterização de acidente vascular cerebral pode ser realizada por estereologia usando o método de fraccionamento da óptica, ou por uma análise de citometria de fluxo de suspensões cérebro leucócitos. Ambos são técnicas úteis para realizar uma distinção fenotípica acurada dos principais subpopulações de células mielóides encontrados no cérebro isquêmico.

Estereológica e Citometria de Fluxo Caracterização de Leucócitos subpopulações em modelos de transitórias ou permanentes Cerebral Isquemia

A inflamação desempenha um papel central na patogênese do AVC isquêmico. Evidências crescentes sugerem que ele atua como uma faca de dois gumes que exacerba a lesão cerebral precoce, mas também contribui para o reparo posterior. Este protocolo descreve o isolamento de células imunes do cérebro isquêmico e sua subsequente fenotipagem citométrica de fluxo.

Isolamento e análise de citometria de fluxo de células imunes do cérebro isquêmico Rato

Apresentado aqui é um método simples para o isolamento e análise de citometria de fluxo de células mononucleares de sangue periférico que se infiltram no glioma que produz dados quantitativos tempo-dependente do número e estado de activação das células do sistema imunológico que entram no microambiente do tumor cerebral precoce.

Isolamento e Análise de Citometria de Fluxo infiltrantes Glioma Células Mononucleares do Sangue Periférico

Este artigo apresenta dois protocolos otimizados para examinar células imunes residentes e derivadas periféricas dentro do sistema nervoso central, incluindo cérebro, medula espinhal e meninges. Cada um desses protocolos ajuda a determinar a função e a composição das células que ocupam esses compartimentos em condições de estado estacionário e inflamatório.

Isolando Tecidos do Sistema Nervoso Central e Meninges Associadas para Análise a Jusante de Células Imunes

Este estudo utiliza citometria de fluxo e duas estratégias diferentes de gating em camundongos isolados com plexos cerebrais coroides; este protocolo identifica os principais subconjuntos de células imunes que povoam essa estrutura cerebral.

Isolamento e Caracterização das Células Imunes de Plexos Choroides de Camundongos Micro-dissecados

Para investigar a resposta imune a distúrbios cerebrais, uma abordagem comum é analisar as mudanças nas células imunológicas. Aqui, dois protocolos simples e eficazes são fornecidos para isolar células imunes do tecido cerebral murino e da medula óssea do crânio.

Isolando células imunes do cérebro e crânio de camundongos

Aprenda a isolar leucócitos infiltrantes do cérebro de camundongos infectados com TMEV usando gradiente de Percoll e Ficoll. Este método permite caracterizar células imunes por citometria de fluxo.

Isolamento de Brain-infiltrando Leucócitos

Explorar mais vídeos