Assépticas Técnicas de Laboratório: transferências de volume com pipetas sorológicas e micropipetas

Esta demonstração apresenta técnicas laboratoriais assépticas para transferência de volumes com pipetas serológicas e micropipetadores na bancada do laboratório. Trabalhe dentro do campo estéril criado pela chama de um bico de Bunsen. Selecione o instrumento de transferência de volume apropriado para a aplicação.

Em seguida, utilize-os corretamente sem comprometer sua esterilidade, mantendo os reagentes e materiais de cultura estéreis e aspirando líquidos com precisão, considerados em conjunto. Esses procedimentos são essenciais para minimizar as fontes de contaminação e garantir precisão em experimentos básicos. Inicialmente, é difícil ajustar com precisão e ler corretamente os instrumentos, bem como coordenar movimentos com os instrumentos e materiais de laboratório sem comprometer a esterilidade dos líquidos transferidos.

Praticar uma técnica asséptica no laboratório é essencial para o sucesso experimental ao trabalhar com espécimes vivos; portanto, invista tempo para aprender esses procedimentos, tornando-os automáticos. Ao trabalhar na bancada, o Dr. Chris Reddy, meu coordenador de laboratório, demonstrará os protocolos. Lave sempre as mãos cuidadosamente com sabão antisséptico e água morna antes de iniciar qualquer procedimento laboratorial. Primeiro, molhe as mãos com água corrente morna.

Em seguida, aplique e distribua abundantemente sabão com vigor. Esfregue as mãos gerando fricção em todas as superfícies, incluindo polegares, dorsos dos dedos, dorsos das mãos e sob as unhas. Depois, enxágue completamente para remover o sabão residual e seque com toalhas de papel retiradas de um dispenser.

Por fim, com uma toalha de papel nova, feche a torneira e limpe a área de trabalho da bancada do laboratório. Em seguida, retire um lenço desinfetante pré-umedecido do recipiente e passe por toda a área. Deixe o desinfetante evaporar usando uma chama de ignitor.

O bico de Bunsen. Ajuste a chama para exibir o cone azul no centro. Organize todos os materiais necessários para o procedimento próximo à área estéril da bancada do laboratório.

Além disso, certifique-se de que todos os materiais estejam devidamente rotulados. Existem diversas opções de pipetas serológicas, de plástico ou vidro, descartáveis ou reutilizáveis, com ou sem filtro. Os diferentes tamanhos são calibrados com filtros que funcionam como barreira contra o excesso de volume na pipeta.

Observe que as pipetas serológicas também são calibradas de duas maneiras. Pipetas TD marcadas com anéis duplos na extremidade superior são calibradas para que o volume da ponta não seja dispensado. Isso não é mostrado aqui, mas as pipetas TC devem ser sopradas, pois são calibradas para entregar todo o volume. Utilizando técnica asséptica com uma pipeta serológica plástica estéril individualmente embalada, comece pela extremidade tampada e comece a desenrolar cuidadosamente o papel.

Não remova toda a manga. Em vez disso, proteja a ponta do cabo da pipeta, cobrindo apenas a parte superior da pipeta acima das marcas de graduação, e fixe um auxiliar de pipetagem, como uma bomba de borracha ou pistola, à extremidade superior da pipeta serológica. Segure o auxiliar de pipetagem com uma mão e remova a manga de papel da pipeta plástica com a outra.

Para pipetas serológicas de vidro armazenadas em recipientes metálicos, solte a tampa do recipiente e remova-a, flamejando as extremidades abertas da tampa e do recipiente. Em seguida, coloque a tampa de lado sobre a bancada desinfetada. Segure o recipiente na posição horizontal e agite para que as pontas de uma ou duas pipetas fiquem expostas.

Deixe cerca de uma polegada exposta. Deite o recipiente de lado e retire uma pipeta sem tocar nas outras pipetas. Mantenha a ponta inferior da pipeta livre de contato com as mãos e superfícies não estéreis.

Prossiga para fixar o auxiliar da pipeta. Em seguida, passe o terço inferior de uma pipeta de vidro através da chama do bico de Bunsen, no cone azul, por um a três segundos. Agora remova a tampa do frasco contendo o meio estéril.

Segure-o entre o dedo anelar e a palma da mão enquanto manipula o auxiliar de pipetagem com o polegar, o indicador e o dedo médio da mesma mão; com a outra mão, segure o frasco em um ângulo de 45 graus e passe a borda do frasco pela chama do bico de Bunsen. Introduza a ponteira estéril no meio. Em seguida, aspire utilizando o auxiliar de pipetagem para controlar o fluxo com as marcas de graduação.

Monitore o volume aspirado na pipeta para ler com precisão o volume. Mantenha a pipeta verticalmente e observe o menisco do líquido diretamente, ao nível dos olhos. Passe novamente a borda do frasco pela chama do bico de Bunsen.

Em seguida, tampe-o. Coloque a garrafa do meio de cultura de lado. Depois, pegue um tubo estéril e, de forma asséptica.

Remova a tampa conforme descrito anteriormente. Crie um campo estéril flamejando a borda do tubo. Dispense o meio do pipeta para dentro do tubo, controlando o fluxo da amostra para que não haja respingos.

Flame a borda. Novamente, recoloque a tampa e coloque o tubo de lado. Agora remova o auxiliar de pipetagem, descarte as pipetas plásticas em um recipiente designado para objetos perfurocortantes, e imerja as pipetas de vidro em solução de hipoclorito a 10%.

Um micropipetador permite medição e dispensação precisas de volumes mínimos, com instrumentos de diferentes tamanhos para faixas de volume específicas. Tubos e ponteiras plásticas pré-esterilizados. Utilize também um lenço umedecido com desinfetante para limpar os micropipetadores. Observação.

O Volter mostra três números que devem ser interpretados em relação ao tipo de micropipeta, com precisão refletida no menor gradiente. Observe, por exemplo, que a P 20 é usada para volumes entre 2,0 e 20,0 microlitros. O número superior em preto é para dezenas de microlitros.

O segundo número preto indica o volume em microlitros. O número vermelho marca décimos de microlitro, de modo que cada marca de graduação corresponde a um incremento de 0,02 microlitros. Primeiro, gire o botão de ajuste para definir o volume do dispensador conforme indicado no voltagem numérico.

Ao diminuir o volume no micropipetador, gire lentamente a roda com o polegar até a marca de graduação. Ao aumentar o volume, gire a roda ultrapassando a marca de graduação desejada em um terço de volta. Em seguida, gire lentamente a roda com o polegar para baixo até atingir o volume pretendido.

Use sempre ponteiras descartáveis de plástico estéreis. Encaixe firmemente uma ponteira na extremidade do corpo da micropipeta. Pressione para baixo e gire levemente para garantir uma vedação hermética ao ar.

Mantenha o micropipetador na posição vertical. Observe que o micropipetador possui três posições: repouso, primeiro parada e segunda parada.

Pressione o botão do êmbolo da posição de repouso até o primeiro detentor para deslocar o ar equivalente ao volume ajustado. Em seguida, mergulhe a ponteira no líquido mantendo o botão pressionado até o primeiro detentor. Libere lentamente o botão para aspirar o líquido para dentro da ponteira.

Quando o botão de pressão atingir a posição de repouso, aguarde um momento para que o líquido seja aspirado para dentro da ponteira. Em seguida, remova a ponteira do líquido. Verifique visualmente a extensão do líquido aspirado na ponteira, garantindo que não haja bolhas de ar.

Coloque a ponteira em um ângulo de 10 a 45 graus contra a parede do tubo que receberá o líquido. Agora, pressione lentamente o botão do êmbolo até o primeiro batente. Expulsando o líquido.

Após um momento, pressione o botão de empuxo até o segundo batente para expelir qualquer líquido residual. Na ponta, prossiga removendo a ponta do líquido e, em seguida, solte o êmbolo para a posição de repouso. Por fim, descarte as pontas no recipiente designado para resíduos cortantes pressionando o botão de ejeção na micropipeta.

Primeiro, desligue o queimador de bico. Após guardar todos os materiais e reagentes, passe um lenço desinfetante nas superfícies externas do LabWare antes de movê-los para o local de armazenamento. Em seguida, coloque o vidro contaminado e os resíduos perigosos na destinação adequada para descarte.

Prossiga para limpar toda a área de trabalho mais uma vez, permitindo que o desinfetante evapore. Por fim, lave bem as mãos com sabão antisséptico e água morna. Sem uma técnica asséptica, os cultivos podem ficar contaminados e atrasar os experimentos.

A transferência asséptica de líquidos utilizando pipetas serológicas é essencial para amplificar culturas bacterianas puras, como este preparo de 25 mililitros de E. coli. Além disso, as pipetas serológicas facilitam a transferência asséptica de líquidos para tubos de ensaio estéreis. Este exemplo demonstra uma cultura pura versus contaminada de E. coli na entrega ponta-a-ponta de meio aos tubos.

Às vezes, são necessários volumes precisos. É evidente que, neste caso, há uma transferência imprecisa do meio. Este exemplo mostra o volume incorreto de tampão transferido.

Em vez de dispensar 12,5 microlitros, o estudante dispensou 125 microlitros. Embora os números estejam ajustados de forma idêntica na micropipeta, a micropipeta incorreta foi selecionada para a tarefa. Após assistir a este vídeo, você deverá ter um conhecimento prático de como aplicar uma técnica asséptica em procedimentos laboratoriais rotineiros, como a transferência de soluções e culturas utilizando pipetas serológicas e micropipetas, sem comprometer sua esterilidade.

O objetivo é que procedimentos de precaução, como flamejar vidraria, ponteiras de pipeta, tubos de cultura e frascos, bem como trabalhar dentro dos limites de um campo estéril na bancada do laboratório, se tornem habituais em cada experimento. Também é essencial que volumes precisos e exatos sejam medidos e dispensados ao realizar experimentos. Aprender a usar corretamente esses instrumentos de transferência de volume melhorará a confiabilidade dos resultados experimentais.