Name: Em Imaging vivo do Cordão do rato Spinal Usando Two-photon Microscopia (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-01-05T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 24 s
Description: Aprenda a realizar imagem in vivo estável da medula espinhal de camundongo usando microscopia de dois fótons. Este método minimiza artefatos de movimento respiratório, permitindo estudos longitudinais de dinâmica celular em condições fisiológicas e patológicas.

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Este trabalho foi financiado pela National Multiple Sclerosis Society conceder RG4595A1 / T para DD e os subsídios NIH / NINDS NS051470, NS052189 NS066361 e as Figuras KA e filmes adaptados e / ou reimpressão do Davalos et al. Métodos J Neurosci. 2008 Mar 30; 169 (1) :1-7 Copyright 2008, com permissão da Elsevier.

1. Construção do dispositivo de estabilização da coluna vertebral <ol><li> Ordem do Narishige STS-A Compact Grampos da Medula Espinhal e os Narishige MA-6N adaptador segurando a cabeça. </li><li> Design personalizado e fazer uma placa base de aço inoxidável para segurar as duas partes Narishige em alinhamento de modo que a cabeça do animal é suportado quando a sua coluna vertebral e da cauda são pinçadas. Tenha em mente que todo o dispositivo deve caber sob a lente do microscópio geralmente em um estágio do microscópio baixou. </li></ol> 2. Cirurgia de animais <ol><li> Pré-aquecer a câmara de microscópio com um dispositivo de aquecimento de ar e mantê-la a 37 ° C. </li><li> Pesar o animal e fazer a mistura anestésico usando 100 mg de cetamina, xilazina 15 mg e 2,5 mg acepromazina por kg de peso corporal, diluída em solução de NaCl 0,9% em condições estéreis. </li><li> Anestesiar o animal através da injeção do anestésico mix por via intraperitoneal (KXA). Beliscar toe regulares devem ser realizados para assegurar a anestesia profunda em todoo experimento. Suplemento com metade da dose original por hora ou conforme necessário. </li><li> Use uma almofada de aquecimento de pequenos animais para fornecer suporte térmico durante a realização do procedimento cirúrgico. </li><li> Aplicar pomada lágrimas artificiais sobre os olhos para evitar a desidratação da córnea e danos. </li><li> Raspar o dorso do animal pela primeira vez com um dispositivo de corte e, em seguida, com uma lâmina afiada para remover completamente o cabelo da área ao redor da incisão. </li><li> Remover os cabelos raspados e desinfetar a superfície da pele raspada com uma compressa embebida em álcool. </li><li> Realizar uma incisão (~ 1,5 cm) pequena longitudinal da pele sobre o nível desejado da coluna vertebral (vértebras torácicas mostrado aqui). </li><li> Expor a musculatura volta com cuidado retração do tecido conjuntivo subcutâneo. </li><li> Separe cuidadosamente a musculatura paravertebral da coluna vertebral no nível desejado. Realizar o menor número de incisões possível destacar os músculos de ambos os lados de cada processo espinhoso e, em seguida, raspar os músculos destacada umaforma da superfície laminar. </li><li> Escolha a lâmina que serão removidos e preparar os locais de entrada para os grampos da coluna em cada lado da coluna vertebral, imediatamente rostral e caudal à laminectomia. Cuidadosamente deslocar tecido muscular para fazer quatro bolsos onde os grampos será inserido. </li><li> Levante a coluna vertebral com a ponta reta de dentes forceps para permitir a inserção segura da curva de ponta romba tesoura sob a lâmina sem tocar na medula espinhal. Executar a laminectomia por lentamente cortando o osso de um lado e, em seguida, do outro lado. </li><li> Use um cotonete ou inserir precut pequenos pedaços de esponja absorvível gelfoam gelatina ao lado do incisões para limitar a pequenos sangramentos. Use um cauterizador de pequenos vasos para controlar o sangramento, se necessário. Use pré-aquecido estéril líquido cefalorraquidiano artificial (ACSF) para lavar tecidos. </li></ol> 3. Estabilização da coluna vertebral e preparação para in vivo de imagens <ol><li> Plac e animal em uma almofada de elevação na placa de base do dispositivo de estabilização da coluna vertebral e segura a cabeça no adaptador de cabeça exploração. </li><li> Coloque os grampos espinhal do STS-Um dispositivo ao longo do eixo ântero-posterior do animal nos bolsos pré-preparados que flanqueiam a laminectomia (Figura 1). Os dois grampos deve ser colocado em um ângulo de aproximadamente 45 ° em relação ao eixo do animal rostro-caudal para permitir espaço suficiente para diminuir uma lente de imersão em água sobre a medula espinal exposta (Figura 1). </li><li> Coloque o clamp terço da STS-Um dispositivo na base da cauda para o corpo do animal podem ser suspensas no ar após a remoção da almofada de elevação para a duração dos experimentos de imagem (Figura 1). </li><li> Construir um pequeno poço de Gelseal (Amersham Biosciences Corp) ao redor da medula espinal exposta para facilitar a manutenção da medula espinhal em ACSF e imersão da lente do microscópio nesta solução no de imagem in vivo. </li></ol>jove_title "&gt; 4. Na imagem in vivo da medula espinhal de rato com microscopia de dois fótons <ol><li> Transferência do animal sobre o dispositivo de estabilização da coluna vertebral dentro da câmara de pré-aquecido cobrindo o microscópio e fixá-lo em um palco microscópio abaixou colocando a laminectomia reta sob a lente (Figura 1). </li><li> Menor uma lente de imersão em água com cuidado para a solução ACSF certificando-se que ele não toque os grampos espinhal ou o Gelseal. </li><li> Use epifluorescência para identificar a área de interesse e se concentrar nele. Mudar para o modo de varredura a laser e executar em imagem in vivo usando o apropriado de dois fótons de comprimento de onda de excitação laser, dichroics e bandpass filtros para os fluoróforos presentes no tecido com imagens. </li></ol> 5. Imagens repetitivas e cuidados pós-operatórios <ol><li> No final de experimentos com imagens, remova o mouse a partir do dispositivo de estabilização da coluna vertebral e limpe cuidadosamente o Gelseal da área ao redor da laminectomia.Limpe bem a área. </li><li> Restaurar e sutura os músculos das costas sobre a laminectomia. </li><li> Restaurar e sutura da pele sobre a laminectomia, cotonete com betadine. </li><li> Fornecer uma solução de Ringer Lactato ml (Baxter Healthcare) como um suplemento de nutrientes e hidratação, bem como tratamento analgésico por via subcutânea (0,1 mg de buprenorfina / kg). </li><li> Administrar por via intraperitoneal tratamento anti-séptico (0,03 ml por mouse, 2,27% enrofloxacina solução injetável antibacteriano). </li><li> Coloque o animal em uma almofada de aquecimento até a recuperação completa da anestesia e, posteriormente, abrigá-lo individualmente. </li><li> Repita a administração anti-séptico dia durante os primeiros 3-5 dias após a cirurgia e tratamento analgésico a cada 8-12 horas por 2-3 dias pós-operatório. Monitorar animais diariamente para garantir um comportamento normal e plena recuperação. </li><li> Para re-imagem através da laminectomia mesmo, reabrir a pele suturada e os músculos e repita os passos descritos nas secções 2-4. </li><li> Re-localizar a PREVIpreviamente imaginado área usando a vascularização de sangue como um mapa, como descrito anteriormente 10. </li></ol> 6. Resultados representativos Todos os procedimentos com animais foram realizados sob as diretrizes estabelecidas pelo Animal Care institucional e Comitês Use na Universidade da Califórnia, San Francisco e estão em conformidade com os regulamentos Federal. A imagem do dispositivo de estabilização da coluna vertebral e um diagrama esquemático mostrando o posicionamento de um rato no dispositivo sob uma lente de microscópio é mostrado na Figura 1. Permitindo espaço suficiente para os movimentos de respiração debaixo do corpo do animal garante estabilidade in vivo de imagens na medula espinhal. Figura 2 mostra a relação estreita entre microglia e na vasculatura como foi fotografado in vivo na medula espinhal de CX3CR1 GFP / mice + transgênicos 18, em que microglia são marcadas com GFP endogenamente. Figura 3 mostra exemplos de repetitivona imagem in vivo, uma vez que foi realizada no mesmo áreas da medula espinhal em camundongos expressando uma proteína fluorescente nos axônios da coluna vertebral (YFP-H linha 3) e microglia (no CX3CR1 GFP / + ratos). <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/2760/2760fig1.jpg" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 1"> Figura 1. Estabilização da coluna vertebral do mouse na imagem in vivo usando microscopia de dois fótons. (A) A custom-made placa base de aço é usada para apoiar e alinhar a STS-A Narishige compacto grampos medula espinhal ea MA-6N Narishige cabeça segurando adaptador como mostrado aqui. (B) posicionamento adequado dos adultos camundongos transgênicos anestesiados com uma anestesia KXA no dispositivo de estabilização da coluna vertebral. O encarte mostra a colocação dos grampos espinhais imediatamente rostral e caudalmente à laminectomia e tecido da medula espinhal expostos. &lt;img alt = "Figura 2" src = "files/ftp_upload/2760/2760fig2.jpg /" /&gt; Figura 2. Na imagem in vivo de células de alta densidade da microglia e os vasos sanguíneos da medula espinhal de ratos anestesiados. Projeção, mas não-alinhados z-pilhas de (A) alta densidade GFP positivas microglia (verde) na medula espinhal de um rato CX3CR1 GFP + / em estreita proximidade com os vasos sanguíneos (vermelho, marcado com iv injeção de rodamina dextran). (B) a ampliação de imagem de alta rotulados como em (A) de uma única célula microglial preso à parede de um vaso sanguíneo com processos estendida ao redor do navio e para o parênquima da medula espinhal. Barra de escala 10μm. <img alt="Figura 3" src="/files/ftp_upload/2760/2760fig3.jpg" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 3"> Figura 3. Repetitivos nos de imagem in vivo dos mesmos segmentos axonal e microglia como eles foram realocados e reimaged na medula espinhal de ratos anestesiados em dias diferentes. (A) YFP-laboratório axônios modelada nos dias 0 e 5. (B). As mesmas estruturas vasculares e células da microglia em torno deles com imagens in vivo na medula espinhal de CX3CR1 GFP / mice + nos dias 0 e 1. Barra de escala 10μm. Movie 1. Seqüência timelapse Representante adquiridos in vivo da medula espinhal de rato. Esta seqüência mostra em detalhes a dinâmica do processo da microglia (verde) e suas interações com a vasculatura (vermelho, marcado com iv injeção de rodamina dextran) ao longo do tempo dentro de um tecido densamente povoadas com estruturas fluorescentes. As imagens só foram corrigidos primas para o brilho do ruído de fundo e contraste eo filme timelapse foi construído por z-projetando pilhas de imagens adquiridas em seqüência, sem alinhamento da imagem, com uma média ou z-selecção de planos individuais. Vasos sanguíneos passam por uma série similar de aviões z como as imagens da microglia. Z profundidade avião: 38 mM.oad/2760/Davalos_Movie_1.mov "&gt; Clique aqui para assistir o filme. Filme seqüência Timelapse 2. Demonstrar a estabilidade primas do método de imagem ao nível de um único plano-z. Aquisição rápida do mesmo e único plano-z na medula espinhal de camundongos GFP CX3CR1 / + colocado no dispositivo de estabilização da coluna vertebral sob anestesia KXA, demonstra o deslocamento de imagem mínima entre quadros consecutivos a uma taxa de varredura de 1 frame / s que é mais rápido do que o taxa de respiração do mouse. O deslocamento menor residual é provavelmente devido ao batimento cardíaco. <a alt="Movie 2" href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/2760/Davalos_Movie_2.mov">Clique aqui para assistir o filme.</a>

<ol><li>Denk, W., Strickler, J. H., Webb, W. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Two-photon+laser+scanning+fluorescence+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Two-photon laser scanning fluorescence microscopy.</a> Science. 248, 73-76 (1990).</li>
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<li>Takano, T., Han, X., Deane, R., Zlokovic, B., Nedergaard, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Two-photon+imaging+of+astrocytic+Ca2%2B+signaling+and+the+microvasculature+in+experimental+mice+models+of+Alzheimer%27s+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Ann.+N.+Y.+Acad.+Sci%22%5BJournal%5D)">Two-photon imaging of astrocytic Ca2+ signaling and the microvasculature in experimental mice models of Alzheimer's disease.</a> Ann. N. Y. Acad. Sci. 1097, 40-50 (2007).</li>
<li>Jung, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+Fractalkine+Receptor+CX3CR1+Function+by+Targeted+Deletion+and+Green+Fluorescent+Protein+Reporter+Gene+Insertion%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Cell.+Biol%22%5BJournal%5D)">Analysis of Fractalkine Receptor CX3CR1 Function by Targeted Deletion and Green Fluorescent Protein Reporter Gene Insertion.</a> Mol. Cell. Biol. 20, 4106-4114 (2000).</li>
<li>Kerschensteiner, M., Schwab, M. E., Lichtman, J. W., Misgeld, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+imaging+of+axonal+degeneration+and+regeneration+in+the+injured+spinal+cord%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Med%22%5BJournal%5D)">In vivo imaging of axonal degeneration and regeneration in the injured spinal cord.</a> Nat. Med. 11, 572-577 (2005).</li>
<li>Kim, J. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Two-photon+laser+scanning+microscopy+imaging+of+intact+spinal+cord+and+cerebral+cortex+reveals+requirement+for+CXCR6+and+neuroinflammation+in+immune+cell+infiltration+of+cortical+injury+sites%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol.+Methods%22%5BJournal%5D)">Two-photon laser scanning microscopy imaging of intact spinal cord and cerebral cortex reveals requirement for CXCR6 and neuroinflammation in immune cell infiltration of cortical injury sites.</a> J. Immunol. Methods. 352, 89-100 (2010).</li>
<li>Shakhar, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stable+T+cell-dendritic+cell+interactions+precede+the+development+of+both+tolerance+and+immunity+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Stable T cell-dendritic cell interactions precede the development of both tolerance and immunity in vivo.</a> Nat. Immunol. 6, 707-714 (2005).</li>
<li>Tadokoro, C. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulatory+T+cells+inhibit+stable+contacts+between+CD4%2B+T+cells+and+dendritic+cells+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22J+Exp+Med%22%5BJournal%5D)">Regulatory T cells inhibit stable contacts between CD4+ T cells and dendritic cells in vivo.</a> J Exp Med. 203, 505-511 (2006).</li>
<li>Lindquist, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visualizing+dendritic+cell+networks+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Visualizing dendritic cell networks in vivo.</a> Nat. Immunol. 5, 1243-1250 (2004).</li>
<li>Schwickert, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((vivo+imaging+of+germinal+centres+reveals+a+dynamic+open+structure%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">vivo imaging of germinal centres reveals a dynamic open structure.</a> Nature. 446, 83-87 (2007).</li>
</ol>

Não temos nada a revelar.

O método descrito aqui permite estável e repetitivo in vivo de imagem de densamente povoadas fluorescentes estruturas celulares na medula espinhal de ratos anestesiados com microscopia de dois fótons. A estabilidade alcançada é resultado de um dispositivo de estabilização custom-made espinhal e um regime anestésico que reduz respiratória induzida pelo artefato movimento. O dispositivo de estabilização da coluna vertebral permite espaço para respirar embaixo do corpo do rato e pode ser construído usando comercia...

<table border="1"><tbody><tr><td> Nome do reagente </td><td> Companhia </td><td> Número de catálogo </td><td> Comentários </td></tr><tr><td> Rodamina B dextran </td><td> Invitrogen </td><td> D1841 </td><td> 70 kDa, diluído em ACSF (3% w / v) </td></tr><tr><td> Ketamina HCl </td><td> Bionichepharma </td><td> NDC No: 67457-001-10 </td><td> Injetável, 50mg/ml </td></tr><tr><td> Anased </td><td> Lloyd Labs </td><td> NADA Não: 139-236 </td><td> Injetável xilazina, 20mg/ml </td></tr><tr><td> Acepromazina </td><td> Vedco </td><td> NADA Não: 117-531 </td><td> Injetável, 10mg/ml </td></tr><tr><td> Lágrimas artificiais pomada </td><td> Phoenix farmacêutico </td><td> NDC No: 57319-760 - 25 </td><td> Lubrificante </td></tr><tr><td> Betadine </td><td> Pescador </td><td> 19-061617 </td><td></td></tr><tr><td> McPherson-Westcott Tesoura </td><td> Precision mundo Instrumentos </td><td> 555500S </td><td> Curva, ponta romba tesoura </td></tr><tr><td> Pinça reta </td><td> Precision mundo Instrumentos </td><td> 555047FT </td><td> Dentada forceps ponta </td></tr><tr><td> De pequenos vasos cauterize </td><td> Multa Ferramentas Ciência </td><td> 18000-00 </td><td></td></tr><tr><td> Gelfoam </td><td> Pharmacia, Pfizer Inc. </td><td> Mixer Moinho MM400 </td><td></td></tr><tr><td> Medula espinhal Compact grampos </td><td> Narishige </td><td> STS-A </td><td></td></tr><tr><td> Adaptador de cabeça, segurando </td><td> Narishige </td><td> MA-6N </td><td></td></tr><tr><td> Gelseal </td><td> Amersham Biosciences Corp </td><td> 80-6421-43 </td><td></td></tr><tr><td> Lactato de Ringer </td><td> Baxter Healthcare &lt;/ Td&gt; <td> 2B8609 </td><td></td></tr><tr><td> Buprenex </td><td> Reckit Benckiser Pharmaceuticals Inc. </td><td> NDC n º: 12496 - 6757-1 </td><td> Buprenorfina, injetável </td></tr><tr><td> Baytril </td><td> Bayer </td><td> NADA 140-913 </td><td> Enrofloxacina, antibacteriana injetável 2,27% (20ml) </td></tr><tr><td> Almofada de aquecimento - Grande </td><td> Multa Ferramentas Ciência </td><td> 21060-10 </td><td></td></tr></tbody></table>

em imaging vivo do cordão do rato spinal usando two-photon microscopia

In vivo Imaging of the Mouse Spinal Cord Using Two-photon Microscopy

In vivo de imagens usando microscopia de dois fótons 1 em ratos que foram geneticamente modificados para expressar proteínas fluorescentes em células específicas 2-3 tipos ampliou significativamente o nosso conhecimento dos processos fisiológicos e patológicos em tecidos diversos in vivo 4-7. Em estudos do sistema nervoso central (CNS), tem havido uma ampla aplicação de imagem in vivo em no cérebro, que produziu uma infinidade de novas descobertas e muitas vezes inesperadas sobre o comportamento das células, como neurônios, astrócitos, microglia, sob condições fisiológicas ou patológicas 17/08. No entanto, complicações na sua maioria técnicos limitaram a implementação de imagem in vivo em estudos da medula espinhal de rato vivo. Em particular, a proximidade anatômica da medula espinhal para os pulmões eo coração gera movimento significativo artefato que faz imagens do cordão espinhal vivendo uma tarefa desafiadora. </p&gt; Nós desenvolvemos um novo método que supera as limitações inerentes a imagem da medula espinhal através da estabilização da coluna vertebral, reduzindo respiratória induzida por movimentos e facilitando o uso de microscopia de dois fótons para a imagem do cordão espinhal de rato in vivo. Isto é conseguido através da combinação de um dispositivo de estabilização da coluna vertebral personalizado com um método de anestesia profunda, resultando em uma redução significativa do respiratória induzida por movimentos. Este protocolo vídeo mostra como expor uma pequena área da medula espinhal que viver pode ser mantida sob condições fisiológicas estáveis ​​durante longos períodos de tempo, mantendo a lesão tecidual e sangramento ao mínimo. Representante imagens brutas adquiridas em detalhe vivo em alta resolução a estreita relação entre microglia e da vasculatura. Uma seqüência timelapse mostra o comportamento dinâmico de processos microglia na medula espinhal de rato vivo. Além disso, uma varredura contínua do mesmo z-frame demonstrars a estabilidade excepcional que este método pode conseguir para gerar pilhas de imagens e / ou filmes timelapse que não exigem o alinhamento da imagem pós-aquisição. Por fim, mostramos como esse método pode ser usado para rever e recriar a mesma área da medula espinhal em intervalo de tempo mais tarde, permitindo estudos longitudinais de curso processos fisiológicos ou patológicos in vivo.

Um protocolo minimamente invasiva para estabilizar a coluna vertebral do mouse e executar repetitivos<em&gt; In vivo</em&gt; Imagem da medula espinhal usando microscopia de dois fótons é descrito. Este método combina um dispositivo de estabilização da coluna vertebral e um regime anestésico para minimizar respiratória induzida por movimentos e produzir dados de imagem-primas que não necessitam de alinhamento ou de outras pós-processamento.

Em Imaging vivo do Cordão do rato Spinal Usando Two-photon Microscopia

A imagem in vivo utilizando microscopia de dois fótons 1 em camundongos que foram geneticamente modificados para expressar proteínas fluorescentes em tipos celulares específicos 2-3 tem...

O objetivo deste procedimento é realizar uma imagem estável in vivo na medula espinhal de camundongos utilizando microscopia de dois fótons. Isso é conseguido primeiramente anestesiando o animal com uma mistura anestésica que induz um ritmo respiratório constante, porém calmo. O segundo passo do procedimento consiste em expor a coluna vertebral no nível desejado e, em seguida, realizar uma laminectomia para expor a medula espinhal subjacente, permitindo que ela seja visualizada in vivo.O terceiro passo é posicionar o animal no dispositivo de estabilização da coluna vertebral. O passo final é o isolamento do segmento da medula espinhal exposto. Em preparação para a imagem in vivo, eventualmente, podem ser obtidos resultados que detalham o comportamento dinâmico das células e suas interações com outros tipos celulares ou estruturas na medula espinhal viva por meio de imagens in vivo com microscopia de dois fótons em sequência temporal.A principal vantagem desta técnica em relação às tentativas anteriores de obter imagens da medula espinhal in vivo é que ela gera dados de imagem in vivo que não requerem pós-processamento e podem ser imediatamente avaliados e utilizados para análises adicionais. As implicações desta técnica estendem-se ao tratamento após lesão medular ou doenças, pois, por exemplo, permitem estudar a progressão da degeneração ou regeneração axonal em tempo real após uma lesão, além de outras condições que afetam a medula espinhal. Esta técnica pode ser usada para estudar a progressão de processos inflamatórios ou neurodegenerativos em modelos animais de doenças, como esclerose múltipla ou esclerose lateral amiotrófica, nas quais a patologia da doença é acentuada na medula espinhal.Inicie o procedimento pesando o animal. Em seguida, anestesie o animal injetando a mistura anestésica por via intraperitoneal. Realize testes regulares de preensão dos dedos dos pés para garantir uma anestesia profunda do animal durante todo o experimento e administre suplementação com metade da dose inicial de anestésico a cada hora, ou conforme necessário.Em seguida, aplique a pomada de lágrimas artificiais sobre os olhos para prevenir a desidratação e lesão da córnea. Apare os pelos na região dorsal do animal com um aparelho de corte e retire os pelos remanescentes com uma lâmina afiada. Após a desinfecção da área depilada, posicione o animal sob um microscópio e inicie o procedimento fazendo uma pequena incisão longitudinal de aproximadamente 1,5 centímetro no nível espinhal desejado.Exponha a musculatura dorsal retratando cuidadosamente o tecido conjuntivo subcutâneo. Em seguida, separe cuidadosamente os músculos paravertebrais da coluna vertebral no nível desejado. Faça o menor número possível de incisões para destacar os músculos de ambos os lados de cada processo espinhoso.Em seguida, raspe os músculos destacados da superfície do laminado. Utilize um cauterizador de pequeno vaso para controlar qualquer sangramento leve, se necessário. Continue raspando os músculos até expor suficientemente o laminado subjacente e conseguir identificar claramente aquele que será removido.Para preparar os locais de entrada das pinças espinais em cada lado da coluna vertebral, insira as pontas de uma tesoura curva entre os músculos paravertebrais e desloque cuidadosamente o tecido muscular para criar quatro bolsos onde as pinças serão inseridas. Levante a coluna vertebral com a pinça de ponta reta dentada para permitir a inserção segura da tesoura curva de ponta romba sob a lâmina, sem tocar na medula espinhal. Em seguida, realize a laminectomia cortando lentamente o osso de um lado e depois do outro; utilize um cotonete ou insira um pequeno pedaço pré-cortado de esponja de gelatina absorvível (gel foam) ao lado da incisão para limitar sangramentos menores.Após isso, utilize o fluido cerebral espinhal artificial estéril pré-aquecido para lavar o tecido. Um dispositivo de estabilização espinhal foi projetado sob medida com os principais componentes dos grampos para medula espinhal Nagate STSA complex e o adaptador de fixação craniana Nagate MA six N. Uma placa de base de aço inoxidável foi confeccionada para manter duas peças Nagate alinhadas, de modo que a cabeça do animal seja sustentada enquanto sua coluna vertebral e cauda são fixadas.Leve em consideração que todo o dispositivo deve caber sob a lente do microscópio com o estágio do microscópio abaixado, a fim de estabilizar o animal. Primeiro, coloque-o sobre um suporte elevado na placa de base do dispositivo de estabilização espinhal. Após fixar a cabeça no adaptador de fixação craniana, posicione o grampo espinhal do dispositivo SDSA ao longo do eixo ântero-posterior do animal nos bolsos previamente preparados, ao lado da laminectomia.Posicione os dois grampos em um ângulo de aproximadamente 45 graus em relação ao eixo cordal ROS do animal para permitir espaço suficiente para baixar a lente de imersão em água sobre a medula espinhal exposta. Em seguida, posicione o terceiro grampo na base da cauda, de modo que o corpo do animal possa ser suspenso após a remoção da almofada de elevação no experimento de imagem. Depois, construa um pequeno reservatório de selante de gel ao redor da medula espinhal exposta para facilitar a manutenção da medula espinhal em LCR A.Em seguida, remova o suporte de elevação quando estiver pronto para iniciar a imagem in vivo, leve o dispositivo de estabilização para a câmara do microscópio pré-aquecida e coloque-o sobre a platina do microscópio abaixada. Certifique-se de alinhar a laminectomia com a lente. Abaixe cuidadosamente a lente de imersão em água na solução de LCR, e certifique-se de que ela não toque os grampos espinais ou a vedação de gel.Utilize fluorescência epi para identificar a área de interesse e, posteriormente, foque nela. Alterne para o modo de varredura a laser e realize a imagem in vivo utilizando a excitação a laser de dois fótons apropriada, comprimento de onda, dicróicos e filtros de passagem de banda para os fluoróforos presentes no tecido a ser imageado. Ao final dos experimentos de imagem, remova o animal do dispositivo de estabilização espinhal.Limpe cuidadosamente o selo de gel da região ao redor da laminectomia e higienize-a. Suture bem os músculos das costas sobre a laminectomia. Em seguida, suture a incisão na pele e passe Betadine com um cotonete, conforme mostrado aqui como uma projeção de imagens de Zack, conforme foram obtidas in vivo e posteriormente projetadas ao longo do eixo Z sem alinhamento de imagens.A imagem mostra células microgliais positivas para GFP altamente densas em verde, em proximidade fechada com vasos sanguíneos em vermelho na medula espinhal. Aqui há uma imagem de alta magnificação de uma única célula microglial aderida à parede de um vaso sanguíneo, mostrando em detalhe alguns de seus prolongamentos estendidos ao redor do vaso e outros em direção ao parênquima da medula espinhal. Este é um exemplo de imageamento repetitivo in vivo dos mesmos segmentos axonais marcados com YFP conforme foram localizados novamente e reimagemados na medula espinhal do mesmo camundongo da linhagem YFPH em duas sessões diferentes separadas por cinco dias. Este é outro exemplo de imageamento repetitivo mostrando as mesmas estruturas vasculares e células microgliais imageadas in vivo na medula espinhal em dois dias consecutivos.Aqui está uma sequência representativa de imagens de longa duração adquirida in vivo da medula espinhal. Esta sequência mostra em detalhes o comportamento dinâmico dos processos mais finos das células microgliais em verde e suas interações com a vasculatura em vermelho. Ao longo do tempo, as imagens brutas foram corrigidas apenas quanto ao ruído de fundo, brilho e contraste, e o filme de tempo-lapse foi construído por rejeição sequencial de pilhas de imagens sem alinhamento de imagens.Fazendo a média da seleção australiana de planos individuais, os vasos sanguíneos atravessam uma faixa semelhante de planos Z aos das imagens de micróglias. A profundidade do volume da imagem é de 38 mícrons. Esta é uma sequência com intervalo de tempo que mostra a estabilidade do método de imagem ao nível de um único plano Z.A aquisição rápida do mesmo plano Z único na medula espinhal de um camundongo heterozigoto CX três, CR um GFP anestesiado com a mistura KXA e posicionado no dispositivo de estabilização espinhal demonstra um deslocamento de imagem mínimo entre quadros consecutivos. Notavelmente, a taxa dessa sequência foi de um quadro por segundo, o que é mais rápido que a frequência respiratória do camundongo. O pequeno deslocamento residual é provavelmente devido à pulsação cardíaca do animal.Ao realizar este procedimento, é importante lembrar-se de limitar o número de incisões ao mínimo e tentar conter qualquer sangramento leve assim que ele ocorrer. Agora, após assistir a este vídeo, você deverá ter uma boa compreensão de como realizar imagens estáveis in vivo no cordão umbilical de camundongo utilizando microscopia biefotônica.

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Source:&lt;a style='text-decoration:none;' href='https://app.jove. com/v/53582/quantificação-da-arquitetura-vascular-cerebral-usando-microscopia-de-dois-fótons-em-um-modelo-de-camundongo-de-neuroinflamação-induzida-por-HIV'&gt; Nishimura, C. et al. Quantificação da Arquitetura Vascular Cerebral usando Microscopia de Dois Fótons em um Modelo de Camundongo de Neuroinflamação Induzida pelo HIV. J. Vis. Exp. (2016). Este vídeo demonstra a visualização in vivo de capilares corticais no cérebro de...

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Este protocolo contém uma descrição detalhada de uma abordagem passo a passo para um modelo de camundongo crônico de janela craniana e embolia microvascular, otimizado para imagens in vivo por microscopia de dois fótons usando microsferas fluorescentes de poliestireno.

Modelo de camundongo com embolia microvascular para microscopia in vivo de dois fótons usando microesferas fluorescentes de poliestireno

Aprenda a realizar imagem in vivo estável da medula espinhal de camundongo usando microscopia de dois fótons. Este método minimiza artefatos de movimento respiratório, permitindo estudos longitudinais de dinâmica celular em condições fisiológicas e patológicas.

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