Um Protocolo de Coleta e coloração Hemócitos do mosquito da febre amarela Aedes aegypti
16 de maio de 2011
A simplificada ainda método preciso para coletar e mancha hemócitos mosquito é descrito. Nosso método combina a simplicidade de perfusão com a precisão das técnicas de injecção de alta para isolar os preparativos limpa de hemócitos em mosquitos Aedes. Este método facilita os estudos que exigem conhecimento dos tipos de hemócitos e sua abundância.
O objetivo geral deste procedimento é coletar e corar hemácitos de mosquitos. Isso é realizado primeiramente injetando um pequeno volume de diluente anticoagulante em mosquitos resfriados. Para soltar um deering, hemácitos e colocar todos os hemácitos em solução.
O segundo passo do procedimento é remover as pernas, as asas e a ponta do abdômen do mosquito. Em terceiro lugar, um diluente fresco é injetado em um local separado do mosquito para iniciar o processo de perfusão. O passo final é direcionar o hemolinfa diluído para uma lâmina preparada, de modo que os hemócitos coletados possam ser fixados e corados.
No final, podem ser obtidos resultados que mostram os principais tipos e número de hemócitos encontrados na espécie de mosquito de interesse por meio de microscopia simples de esfregaço. A principal vantagem dessa técnica em relação a métodos existentes, como a profusão, é que ela combina a simplicidade da profusão com a precisão obtida por métodos de alta injeção, mas com menos etapas até o objetivo final. Nosso objetivo é identificar os tipos de hemócitos e sua abundância em resposta a desafios imunológicos.
Quem demonstra esta técnica é Amina Abdul Kum, uma estudante de graduação do meu laboratório. Antes de iniciar o protocolo, prepare a solução diluente de hemolinfa em alíquotas de um mililitro. Armazene-as a menos 20 graus Celsius e não re-congele qualquer porção não utilizada de uma alíquota.
Agora, em lâminas de microscópio com espessura de um milímetro, risque círculos de um centímetro. Uma lâmina é necessária por mosquito. Prepare agulhas esticadas.
Quebre a ponta de cada agulha puxada para fazer uma abertura na agulha. Monte uma agulha em seu suporte, que está preso aos componentes de tubo e seringa de um microinjetor. Em seguida, remova as bolhas de ar do conjunto de tubo e suporte da agulha usando óleo mineral.
Você aspira óleo mineral nesta seringa manual e certifica-se de não obter bolhas. Coloca algo sob a agulha para captar o óleo que pinga. Abre esta parte do microinjetor e, em seguida, coloca óleo aqui para eliminar quaisquer bolhas.
E isto simplesmente se prende à seringa manual, da mesma forma que se prende à outra ponteira. Injete lentamente o óleo mineral para que ele percorra o tubo plástico e elimine todas as bolhas presentes. Em seguida, encha novamente o topo com óleo mineral até o ponto em que comece a escorrer.
Em seguida, você deve reconectar isso à seringa de vidro para não introduzir bolhas. Depois, reencha os componentes montados com óleo mineral até que todo o tubo da agulha e a seringa estejam completamente cheios. O microinjetor agora está pronto para ser usado na administração do diluente.
Em seguida, prepare os animais aspirando 15 fêmeas adultas para um pequeno recipiente sólido que será completamente imerso em gelo. Os mosquitos são anestesiados quando imobilizados pelo frio, o que geralmente leva oito minutos ou menos. Coloque um único mosquito anestesiado em uma lâmina com cavidade onde será realizada a microinjeção.
No microscópio, aspire 12 microlitros de diluente de hemolinfa para dentro do microinjetor. Prenda suavemente o mosquito sob o microscópio com pinça e injete de três a 3,5 microlitros do diluente. Entre o sétimo e o oitavo segmento abdominal, o abdômen irá inchar.
À medida que o diluente é injetado, três mosquitos podem ser injetados. Antes de recarregar o microinjetor, coloque todos os mosquitos injetados em um copo plástico limpo sobre gelo, onde os mosquitos se recuperarão por cerca de cinco minutos. Durante a incubação, o diluente anticoagulante desprende os hemócitos aderidos aos tecidos internos.
Enquanto o primeiro lote de animais se recupera durante a incubação, geralmente é possível injetar outros três a cinco mosquitos. Após os cinco minutos, ainda dentro do copo, prepare os mosquitos injetados cortando suas pernas, asas e as pontas dos abdômens no oitavo segmento com tesoura microcirúrgica. Tenha cuidado para não cortar as pernas e asas muito próximas ao tórax ou à hemo.
Pode haver escape de Limp. Agora, lave uma lâmina gravada em etanol 70% e seque-a com um lenço kim sob o microscópio. Posicione um mosquito dissecado na borda externa do círculo gravado.
Carregue o microinjetor com 12 microlitros de diluente fresco. Segure o mosquito com pinças e injete de oito a dez microlitros na face lateral do mesotórax. Tenha cuidado para não injetar nenhum óleo mineral após esta injeção.
O hemolinfa será coletado do abdômen para dentro do círculo gravado; pressione suavemente o abdômen com pinça para direcionar e estimular o fluxo da hemolinfa. Agora, deixe a hemolinfa coletada secar sobre a lâmina. Isso deve levar cerca de 10 minutos.
Em seguida, está pronto para ser corado. Corar cada lâmina separadamente com Hema três. Mergulhar cada lâmina no fixador cinco vezes, por apenas um segundo por mergulho.
Siga com três mergulhos de um segundo na solução um e, em seguida, na solução dois. Agora, enxágue apenas o verso da lâmina com água desionizada, não o lado frontal blo. Seque o lado frontal, monte uma lamínula com meio de montagem e pressione suavemente a lamínula para que o meio preencha completamente a região da coloração do tecido.
Agora, deixe a lâmina secar por um mínimo de três horas para obter resultados ideais. As hemácias coradas devem ser visualizadas e fotografadas dentro de duas semanas após este preparo. Essas células de fêmeas adultas foram identificadas utilizando este protocolo.
A primeira imagem mostra um hemócito proeritróide com base em sua forma ovalada e alta razão núcleo-citoplasma. Esta imagem é de um hemócito ENO com base em sua forma ovalada e razão citoplasma-núcleo. Por fim, este é um hemócito do tipo granulocítico.
Apresenta uma textura mais granular e é mais uma OID em formato comparado aos métodos anteriores de alta injeção. Este protocolo resultou em um número total semelhante de hemócitos e igualmente identificou sítios granulares como o tipo celular mais comum. Uma vez dominada, esta técnica pode ser realizada em uma hora para cerca de 15 a 20 mosquitos, se executada corretamente.
Após assistir a este vídeo, você deverá ter uma boa compreensão de como injetar corretamente os mosquitos com dent, como coletar seus hemócitos e, em seguida, como preparar os hemócitos para visualização e imageamento.
Veja a transcrição completa e aceda a milhares de vídeos científicos
Visão Geral
Este artigo descreve um método simplificado, porém preciso, para coletar e corar hemócitos de mosquitos. A técnica combina a perfusão com métodos de injeção alta para isolar preparações limpas de hemócitos em mosquitos do gênero Aedes.
Componentes Principais do Estudo
Área de Ciência
- Neurociência
- Entomologia
- Biologia Celular
Antecedentes
- Os hemócitos desempenham um papel crucial na resposta imune dos mosquitos.
- Compreender os tipos e a abundância de hemócitos é essencial para diversos estudos biológicos.
- Os métodos atuais de coleta de hemócitos podem ser complexos e demorados.
- Este estudo tem como objetivo simplificar o processo, mantendo a precisão.
Objetivo do Estudo
- Desenvolver um método para coleta eficiente de hemócitos de mosquitos.
- Facilitar estudos sobre os tipos de hemócitos e sua abundância.
- Aprimorar a precisão das técnicas de isolamento de hemócitos.
Métodos Utilizados
- Injeção de diluente anticoagulante em mosquitos resfriados.
- Remoção das pernas, asas e ponta do abdômen para acessar o hemolinfa.
- Início do processo de perfusão mediante injeção de diluente fresco.
- Coleta do hemolinfa em uma lâmina preparada para coloração.
Resultados Principais
- O método isola com sucesso preparações puras de hemócitos.
- Alta precisão na identificação de diferentes tipos de hemócitos.
- Facilita pesquisas futuras sobre a imunologia de mosquitos.
- O processo otimizado reduz o tempo e a complexidade da coleta de hemócitos.
Conclusões
- O método descrito é eficaz para o estudo de hemócitos de mosquito.
- Combina simplicidade e precisão, tornando-o acessível aos pesquisadores.
- Essa técnica pode aprimorar nossa compreensão da biologia e imunologia de mosquitos.
Perguntas Frequentes
Relevância Executiva para a Indústria
A coleta e coloração confiáveis de hemócitos de mosquito são fundamentais para validar a função das células imunológicas na biologia de vetores, impactando diretamente a validação inicial de alvos para intervenções contra doenças transmitidas por vetores. Este protocolo permite o isolamento padronizado e reprodutível de hemócitos de Aedes aegypti, apoiando a redução de riscos mecanicistas e a confiança preditiva em estudos sobre a imunidade inata do mosquito. Fluxos de trabalho otimizados para análise de células imunológicas facilitam decisões em portfólios de controle de vetores e no desenvolvimento de mosquitos transgênicos.
Aplicações Estratégicas em P&D de Biotecnologia Farmacêutica
Descoberta Inicial e Validação de Alvo
- Permite a investigação de populações de células imunes de mosquitos para a validação funcional de alvos.
- Apoia a redução de riscos mecanicistas ao esclarecer a abundância de hemócitos e a resposta a desafios imunológicos.
- Fornece dados celulares quantitativos para embasar a confiança preditiva em estudos de biologia de vetores.
Triagem e Desenvolvimento de Ensaios
- Fornece preparações padronizadas de hemócitos para ensaios imunológicos subsequentes.
- Melhora a reprodutibilidade e a precisão nos fluxos de trabalho de identificação e quantificação celular.
- Facilita a preparação para ensaios na avaliação de intervenções contra patógenos em mosquitos.
Pesquisa Translacional e Pré-clínica
- Alinha leituras da imunidade celular com modelos de vetores relevantes para a doença.
- Permite a continuidade do perfil imunológico em estágio de descoberta até a validação pré-clínica de estratégias de controle de vetores.
- Apoia o avanço ajustado ao risco de abordagens transgênicas ou imunomoduladoras em mosquitos.
Integração de Pipeline e Fluxo de Trabalho
Este protocolo se integra ao continuum de descoberta a pré-clínico para a pesquisa de doenças transmitidas por vetores, conectando o perfilamento de células imunes com validação funcional e triagem.
- Biologia da Descoberta: Fornece testes robustos de hipóteses para a função e abundância de células imunológicas de mosquitos.
- Triagem: Estabelece resultados reprodutíveis e quantitativos para ensaios baseados em células imunológicas.
- Análises: Permite a comparação estatística de populações de hemócitos entre diferentes condições experimentais.
- Pesquisa Translacional: Conecta dados de células imunológicas a modelos vetoriais relevantes para doenças em estudos pré-clínicos.
- Reutilização Empresarial: Oferece um protocolo padronizado e escalável, adaptável a diversos programas de pesquisa com mosquitos.
Impacto Operacional e Empresarial
- Valor Científico: Aumenta a confiança preditiva e reduz a ambiguidade nos estudos de células imunológicas de mosquitos.
- Valor Operacional: Agiliza a preparação de amostras, melhora a reprodutibilidade e permite maior produtividade.
- Valor Estratégico: Aprimora as decisões de prosseguir ou não em iniciativas de controle de vetores e de mosquitos transgênicos.
- Impacto no Portfólio: Permite a priorização ajustada ao risco de intervenções em vetores direcionadas ao sistema imunológico.
Considerações sobre a Implementação
- Exige experiência técnica em microinjeção e manipulação de mosquitos.
- Requer acesso a microinjetores, microscopia e reagentes de coloração.
- Exige padronização entre equipes para quantificação consistente de hemócitos.
- Pode ser necessária adaptação para outras espécies de mosquitos ou sistemas modelo.
- Limitado pelos pequenos volumes de hemolinfa e pelo potencial de perda de amostra se não for realizado com precisão.
