A técnica de impedância elétrica em tempo real baseado medir Invasão de monocamada de células endoteliais por células cancerosas

Este vídeo demonstra um método para monitorar a invasão de uma monocamada de células endoteliais por células cancerígenas usando uma técnica baseada em impedância elétrica em tempo real. Primeiro, as células endoteliais da veia umbilical humana, conhecidas como VE, estão assentadas em 16 EPLs de poços revestidos com eletrodos de ouro no fundo do poço. Para gerar uma monocamada confluente, são adicionadas células cancerígenas, que se ligam ao VE e invadem a monocamada HVAC, interrompendo as junções das células endoteliais As leituras de impedância, que dependem da área total do fundo do poço coberto pelas células, são então adquiridas.

A extensão da invasão pode então ser determinada com base nas mudanças na impedância elétrica. A principal vantagem desta técnica ou dos métodos existentes, como câmara vazia e ensaios METROGEL, é que as interações das células tumorais de células endoteliais imitam mais de perto o processo metastático in vivo, e os dados são obtidos em tempo real e são mais facilmente quantificáveis em oposição à análise de endpoint para outros métodos. Embora este método possa fornecer informações sobre a invasão de células cancerígenas.

Também pode ser aplicado a outros sistemas, como investigar interações celulares no sistema imunológico. Além disso, a fase inicial do experimento, onde observamos o crescimento de células UX, pode ser usada para avaliar a proliferação celular de qualquer linha celular sem mais etapas de invasão, demonstrando que o procedimento será um estudante de pós-graduação do meu laboratório. Todas as etapas deste protocolo devem ser realizadas em condições estéreis em uma capa de cultura de tecidos.

O sistema Xcel usado para este experimento é mantido permanentemente em uma incubadora de dióxido de carbono a 37 graus Celsius 5%, dedicada exclusivamente a este instrumento em seu primeiro uso. O instrumento deve ser deixado na incubadora por pelo menos 16 horas para se equilibrar ao novo ambiente de temperatura e umidade. Em seguida, prepare o EPL 16 revestindo-o com gelatina a 0,1% por uma hora a 37 graus Celsius.

Depois que a placa estiver revestida, lave-a uma vez com PBS. Em seguida, adicione 100 microlitros de meio reconstituído e gm dois para realizar uma leitura em branco. Para medir a impedância de fundo na ausência de células.

Coloque o EPL no sistema do agente do Excel no computador. Abra o software do agente Excel clicando no ícone do software RTCA na área de trabalho na janela do software. Clique na guia de layout e selecione os poços contendo amostras.

Para programar a frequência de aquisição de dados em tempo real. Clique na guia de programação e, em seguida, clique no ícone adicionar uma etapa varre indica o número de leituras e os intervalos indicam o intervalo de tempo entre as leituras. Estes são definidos automaticamente para um e 1,00 minuto, respectivamente.

Isso programa o sistema para realizar uma leitura em segundo plano. Clique em adicionar uma etapa e digite 300 na caixa de varreduras e 10 minutos na caixa de intervalos. Isso programará o instrumento para realizar medições de impedância por até 50 horas.

Para iniciar o experimento, clique no ícone iniciar uma etapa. A impedância de fundo de cada poço será medida após a medição de fundo ter sido realizada. A janela exibe a mensagem.

Pronto para a próxima etapa, clique em . Próximo passo para começar. Neste momento, as células podem ser adicionadas e a formação de uma monocamada pode ser monitorada conforme descrito.

Na próxima seção, a veia umbilical humana, as células endoteliais ou VE usadas aqui são cultivadas em EGM dois meios reconstituídos com o kit EGM de duas balas contendo suplementos de fatores de crescimento, e as células 5% FBS devem ser mantidas em uma incubadora de 37 graus Celsius na presença de 5% de dióxido de carbono. No dia do experimento, verifique a cofluência do HUB E Sob um microscópio, as células devem ter um número de passagem baixo, de preferência não mais que seis e menos que 75% Con fluente para gerar uma tonalidade, colheita monocamada das células por tripsina. Uma vez que as células tenham se destacado do frasco, todos os vestígios de tripsina devem ser removidos por centrifugação a 200 G. Após a centrifugação, lave as células uma vez com PBS.

Em seguida, ressuspenda as células e reconstitua e GM dois meios a uma concentração de 2,5 vezes 10 elevado à quinta célula por mililitro. Assim que as células forem ressuspensas, remova o EPL calibrado de fundo do sistema EXOGEN e adicione 100 microlitros da suspensão HX aos 100 microlitros de E GM dois meios já na placa. Coloque imediatamente o EPL no analisador de células do sistema do Excel.

Comece a adquirir leituras de impedância clicando no botão iniciar etapa na janela do software. Permita que as células endoteliais cresçam. O sistema continuará fazendo leituras de impedância a cada 10 minutos.

Uve mostram um achatamento transitório característico do índice celular quatro a seis horas após a semeadura, seguido por outra estabilização após 16 a 18 horas. Portanto, é importante deixar as células formarem uma monocamada confluente por pelo menos 18 horas. Uma vez formada uma monocamada, é hora de adicionar as células invasoras em preparação para o ensaio de invasão.

Prepare as células tumorais invasoras. Aqui as células do osteossarcoma são usadas. Comece colhendo as células por tripsina.

Remova todos os vestígios de tripsina girando as células a 200 G e lavando uma vez com PPS. Após a lavagem reus, suspenda as células enquanto a densidade final de uma vezes 10 elevado ao quinto de células por mililitro no meio usado para cultivar as células tumorais, como meio RPMI ou DMEA contendo 10% de FBS. Pause o experimento clicando no ícone da etapa de pausa na janela do software.

Remova o EPL e aspire o meio EGM dois da monocamada de vácuo. Adicione 100 microlitros de suspensão de células tumorais contendo uma vez 10 às quartas células. Geralmente, uma proporção de uma a 2.5 células tumorais para células endoteliais funciona melhor para o ensaio.

No entanto, a proporção pode ser otimizada para linhagens celulares individuais. Coloque o EPL de volta no sistema do agente do Excel na incubadora. Clique na etapa continuar para continuar fazendo leituras de impedância em intervalos de 10 minutos.

Monitore a invasão em tempo real nas próximas seis a 12 horas. Uma queda no índice celular resultará da retração das junções endoteliais e da penetração por células tumorais invasoras. Quando o experimento estiver concluído, use o software exergen para normalizar os resultados para o momento da adição de células tumorais invasoras.

O software de exérgeno permite a normalização para qualquer ponto de tempo em que VEX foi cultivado no sistema de exérgeno, conforme mostrado neste vídeo, e K sete células M duas ou K 12 células foram adicionadas após a formação da monocamada. Como mostrado aqui, uma diminuição acentuada no índice celular ocorre dentro de algumas horas após a introdução de K sete M duas células. K sete M dois é uma linhagem celular de osteossarcoma altamente metastática.

Essas células expressam altos níveis da proteína ligante do citoesqueleto, que explica as propriedades invasivas da linhagem celular. As células K 12, por outro lado, são menos metastáticas e são incapazes de penetrar na monocamada endotelial com a mesma eficiência que as células K sete M duas. Isso é representado por uma diminuição menos profunda no índice celular, conforme mostrado aqui.

O controle mostrado aqui representa a impedância da monocamada uve. Na ausência de células cancerígenas, os experimentos foram realizados em triplicata. Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como medir a invasão em tempo real, gerando uma monocamada de células endoteliais e desafiando a monocamada com células cancerígenas.

As etapas iniciais do experimento envolvendo a formação de monocamada HU XL podem ser usadas para avaliar a proliferação celular por impedância. Dois.