A técnica de impedância elétrica em tempo real baseado medir Invasão de monocamada de células endoteliais por células cancerosas
1 de abril de 2011
Este artigo descreve uma In vitro Técnica para células cancerosas invasoras de monitorização por meio de uma monocamada de células endoteliais. Os dados são adquiridos em tempo real, como uma função de alterações na impedância sobre a superfície de eléctrodos no fundo bem.
Este vídeo demonstra um método para monitorar a invasão de uma monocamada de células endoteliais por células cancerígenas, utilizando uma técnica baseada em impedância elétrica em tempo real. Primeiro, células endoteliais da veia umbilical humana, denominadas VE, são semeadas em placas EPL de 16 poços revestidos com eletrodos de ouro no fundo dos poços. Para formar uma monocamada confluente, células cancerígenas são adicionadas, as quais se aderem às células VE e invadem a monocamada de VE, rompendo as junções entre as células endoteliais. Em seguida, são obtidas leituras de impedância, que dependem da área total do fundo do poço coberta pelas células.
A extensão da invasão pode então ser determinada com base em alterações na impedância elétrica. A principal vantagem desta técnica em relação a métodos existentes, como os ensaios de câmara de vazio e METROGEL, é que as interações entre células endoteliais e células tumorais imitam mais fielmente o processo metastático in vivo, e os dados são obtidos em tempo real e são mais facilmente quantificáveis, ao contrário da análise de ponto final utilizada em outros métodos. Embora este método possa fornecer informações sobre a invasão de células cancerígenas.
Também pode ser aplicado a outros sistemas, como o estudo de interações entre células no sistema imunológico. Além disso, a fase inicial do experimento, na qual observamos o crescimento de células UX, pode ser utilizada para avaliar a proliferação celular de qualquer linhagem celular, sem etapas adicionais de invasão, demonstrando que o procedimento será realizado por Rahim, estudante de pós-graduação do meu laboratório. Todas as etapas deste protocolo devem ser realizadas em condições estéreis em uma câmara de cultura de tecidos.
O sistema Xcel utilizado neste experimento é mantido permanentemente em uma incubadora com 37 graus Celsius e 5% de dióxido de carbono, exclusivamente dedicada a este instrumento desde seu primeiro uso. O instrumento deve permanecer na incubadora por pelo menos 16 horas para equilibrar-se com o novo ambiente de temperatura e umidade. Em seguida, prepare o Thence EPL 16 revestindo-o com gelatina 0,1% por uma hora a 37 graus Celsius.
Após o revestimento da placa, lave-a uma vez com PBS. Em seguida, adicione 100 microlitros do meio e gm dois reconstituído para realizar uma leitura em branco. Para medir a impedância de fundo na ausência de células.
Coloque o EPL no sistema do agente Excel no computador. Abra o software do agente Excel clicando no ícone do software RTCA na área de trabalho na janela do software. Clique na guia layout e selecione os poços que contêm as amostras.
Para programar a frequência da aquisição de dados em tempo real. Clique na aba cronograma, depois clique no ícone adicionar uma etapa. Varreduras indica o número de leituras e intervalos indica o intervalo de tempo entre as leituras. Esses valores são definidos automaticamente como um e 1,00 minuto, respectivamente.
Isso programa o sistema para realizar uma leitura de fundo. Clique em adicionar um passo e insira 300 na caixa de varreduras e 10 minutos na caixa de intervalos. Isso programará o instrumento para realizar medições de impedância por até 50 horas.
Para iniciar o experimento, clique no ícone iniciar uma etapa. A impedância de fundo de cada poço será medida após a realização da medição de fundo. A janela exibe a mensagem.
Pronto para a próxima etapa, clique por favor. Próxima etapa para iniciar. Neste momento, as células podem ser adicionadas e a formação de uma monocamada pode ser monitorada conforme descrito.
Na próxima seção, as células endoteliais de veia umbilical humana, ou VE utilizadas aqui, são cultivadas em meio EGM dois reconstituído com o kit complemento EGM dois contendo suplementos de fatores de crescimento e 5% de FBS. As células devem ser mantidas em uma incubadora a 37 graus Celsius na presença de 5% de dióxido de carbono. No dia do experimento, verifique a confluência das HUB E sob microscópio; as células devem ter um número baixo de passagens, preferencialmente não superior a seis e com confluência inferior a 75%, para gerar uma monocamada uniforme. Colha as células por tripsinização. Assim que as células se desprendem do frasco, todos os vestígios de tripsina devem ser removidos por centrifugação a 200 ×g. Após a centrifugação, lave as células uma vez com PBS.
Em seguida, ressuspenda as células e o meio e GM dois reconstituído para uma concentração de 2,5 vezes 10 à quinta células por mililitro. Uma vez que as células estejam ressuspendidas, remova o EPL calibrado de fundo do sistema EXOGEN e adicione 100 microlitros da suspensão de HX aos 100 microlitros do meio E GM dois já presentes na placa. Coloque imediatamente o EPL no analisador de células do sistema Excel.
Inicie a aquisição de leituras de impedância clicando no botão de etapa inicial na janela do software. Deixe as células endoteliais crescerem. O sistema continuará realizando leituras de impedância a cada 10 minutos.
As uve mostram um achatamento transitório característico do índice celular quatro a seis horas após a semeadura, seguido por outra estabilização após 16 a 18 horas. Portanto, é importante deixar as células formarem uma monocamada confluente por pelo menos 18 horas. Uma vez formada a monocamada, é hora de adicionar as células invasoras em preparação para o ensaio de invasão.
Prepare as células tumorais invasoras. Aqui são usadas células de osteossarcoma. Comece pelo isolamento das células com tripsina.
Remova todos os vestígios de tripsina centrifugando as células a 200 G e lavando uma vez com PPS. Após a lavagem, suspenda as células em densidade final de um vezes 10 à quinta células por mililitro no meio utilizado para cultivar as células tumorais, como meio RPMI ou DMEA contendo 10% de FBS. Pausar o experimento clicando no ícone de etapa de pausa na janela do software.
Remova o EPL e aspire o meio EGM dois da monocamada em vácuo. Adicione 100 microlitros de suspensão de células tumorais contendo um vezes 10 à quarta células. Geralmente, uma proporção de um para 2,5 células tumorais por células endoteliais funciona melhor para o ensaio.
No entanto, a proporção pode ser otimizada para linhagens celulares individuais. Coloque o EPL de volta no sistema agente Excel dentro do incubador. Clique em próximo passo para continuar coletando leituras de impedância em intervalos de 10 minutos.
Monitore a invasão em tempo real nas próximas seis a doze horas. Uma queda no índice de células resultará da retração das junções endoteliais e da penetração por células tumorais invasoras. Quando o experimento terminar, utilize o software exergen para normalizar os resultados em relação ao momento da adição das células tumorais invasoras.
O software exergen permite a normalização em qualquer ponto temporal em que os VEX foram cultivados no sistema exergen, conforme mostrado neste vídeo, e células K7M2 ou células K12 foram adicionadas após a formação da monocamada. Como mostrado aqui, ocorre uma diminuição acentuada no índice celular dentro de algumas horas após a introdução das células K7M2. K7M2 é uma linhagem celular de osteossarcoma altamente metastásica.
Essas células expressam altos níveis da proteína ligadora do citoesqueleto ene, o que explica as propriedades invasivas da linhagem celular. As células K 12, por outro lado, são menos metastáticas e incapazes de penetrar a monocamada endotelial com a mesma eficiência das células K sete M dois. Isso é representado por uma diminuição menos acentuada no índice celular, conforme mostrado aqui.
O controle mostrado aqui representa a impedância da monocamada de uve. Na ausência de células cancerígenas, os experimentos foram realizados em triplicata. Após assistir a este vídeo, você deverá ter uma boa compreensão de como medir a invasão em tempo real, gerando uma monocamada de células endoteliais e desafiando a monocamada com células cancerígenas.
As etapas iniciais do experimento envolvendo a formação de monocamada de HU XL podem ser utilizadas para avaliar a proliferação celular por impedância. Dois.
Visão Geral
Este artigo descreve uma técnica baseada em impedância elétrica em tempo real para monitorar a invasão de células cancerígenas através de uma monocamada de células endoteliais. O método permite a quantificação de interações celulares que simulam processos metastáticos in vivo.
Componentes Principais do Estudo
Área da Ciência
- Biologia Celular
- Pesquisa sobre Câncer
- Biologia de Células Endoteliais
Antecedentes
- Compreender a invasão de células cancerígenas é fundamental para o desenvolvimento de estratégias terapêuticas.
- Os métodos tradicionais frequentemente dependem de análises de ponto final, que podem ser menos informativas.
- Esta técnica fornece dados em tempo real, aprimorando a compreensão das interações celulares.
- Ela também pode ser adaptada para estudar outras interações celulares, como aquelas no sistema imunológico.
Objetivo do Estudo
- Desenvolver um método para o monitoramento em tempo real da invasão de células cancerígenas.
- Fornecer informações sobre as interações entre células endoteliais e células tumorais.
- Aprimorar a quantificação da invasão celular em comparação com métodos existentes.
Métodos Utilizados
- Células endoteliais de veia umbilical humana (HUVECs) são cultivadas para formar uma monocamada.
- Células cancerígenas são introduzidas para monitorar sua invasão por meio de alterações na impedância.
- Leituras de impedância são realizadas em intervalos regulares para avaliar as interações celulares.
- O experimento é conduzido em condições estéreis para garantir a precisão.
Resultados Principais
- A monitorização em tempo real da impedância acompanha eficazmente a invasão de células cancerígenas.
- As alterações na impedância correlacionam-se com a extensão da ruptura das junções endoteliais.
- O método permite a otimização das proporções celulares para diferentes ensaios.
- Os dados obtidos fornecem informações sobre a dinâmica da invasão celular.
Conclusões
- Essa técnica oferece uma representação mais precisa da invasão de células cancerígenas.
- A aquisição de dados em tempo real aprimora a compreensão dos processos metastáticos.
- O método pode ser aplicado a diversos estudos de interação celular além do câncer.
Perguntas Frequentes
Relevância Executiva para a Indústria
Essa técnica de impedância elétrica em tempo real permite que equipes de P&D biofarmacêuticas avaliem quantitativamente a invasão de células cancerígenas através de monocamadas endoteliais com relevância fisiológica. Ao capturar alterações dinâmicas e sem marcação de impedância que se correlacionam com a ruptura de junções e a penetração de células tumorais, o método auxilia na redução de riscos mecanicistas de alvos anti-metastáticos. Ele fornece confiança preditiva no estágio inicial de descoberta, distinguindo fenótipos invasivos de não invasivos em um formato escalável e reprodutível.
Aplicações Estratégicas em P&D de Biotecnologia e Farmacêuticos
Descoberta Inicial e Validação de Alvo
- Valor Científico: Permite a investigação de hipóteses terapêuticas mediante a quantificação de interações em tempo real entre tumores e endotélio que imitam a disseminação metastática in vivo.
- Valor Operacional: Apoia a validação funcional de alvos por meio de leituras baseadas em impedância que refletem a integridade das junções endoteliais e a invasividade das células tumorais.
- Valor Preditivo: Facilita a triagem de portfólios ao distinguir linhagens de osteossarcoma altamente metastáticas (por exemplo, K7M2) de linhagens de baixa metástase (por exemplo, K12) com base na magnitude da redução da impedância.
Triagem e Desenvolvimento de Ensaios
- Prontidão do Ensaio: Gera saídas quantitativas padronizadas de índice celular adequadas para triagem de alto conteúdo de compostos que visam vias de invasão.
- Reprodutibilidade: Permite medições de impedância consistentes entre réplicas quando as monocamadas endoteliais são equilibradas por ≥18 horas antes da adição das células tumorais.
- Escalabilidade: Compatível com matrizes eletrodos de 16 poços, permitindo testes paralelos de condições e otimização de reagentes.
Pesquisa Translacional e Pré-clínica
- Relevância para a Doença: Modela a etapa de invasão endotelial da metástase, um gargalo crítico na sobrevivência de células tumorais circulantes e na extravasação.
- Continuidade Translacional: Conecta descobertas e pesquisas pré-clínicas ao fornecer uma leitura quantificável e em tempo real da dinâmica de invasão, aplicável a estudos de correlação com biomarcadores.
- Decisões Ajustadas ao Risco: Apoia decisões de prosseguir ou não ao associar alterações na impedância à invasividade funcional, reduzindo a dependência de ensaios terminais.
Integração de Pipeline e Fluxo de Trabalho
O método se insere no continuum de descoberta, desde a validação do alvo até a identificação de compostos iniciais, onde métricas de invasão em tempo real orientam relações precoces entre estrutura e atividade, além de estudos sobre o mecanismo de ação.
- Biologia de Descoberta: Apoia a verificação de hipóteses sobre interações endoteliais-tumorais ao fornecer dados de impedância em tempo real e sem marcação que refletem adesão celular, espalhamento e remodelação de junções.
- Triagem: Fornece linhas de base de impedância prontas para ensaio e curvas dinâmicas de invasão, permitindo a triagem de bibliotecas de compostos frente a fenótipos de invasão.
- Análise: Gera valores dimensionais de índice celular e cinéticas temporais de invasão que permitem comparação quantitativa entre condições e normalização em relação aos pontos de tempo iniciais da invasão.
- Pesquisa Translacional: Conecta-se à validação pré-clínica ao modelar um passo metastático chave suscetível à intervenção terapêutica e ao modelamento farmacocinético-farmacodinâmico.
- Reutilização Empresarial: Estabelece uma plataforma baseada em impedância reutilizável para estudar diversas interações célula-célula, incluindo adesão imune-endotelial, além da oncologia.
Impacto Operacional e Empresarial
- Valor Científico: Aumenta a confiança preditiva na validação de alvos ao reduzir a ambiguidade mecanicista na modelagem de metástase.
- Valor Operacional: Oferece padronização, monitoramento em tempo real e quantificação sem marcadores, melhorando o rendimento em comparação com ensaios terminais como a câmara de Boyden.
- Valor Estratégico: Melhora a eficiência do capital ao permitir decisões mais cedo, baseadas em dados, que reduzem o risco de falha biológica em estágios tardios.
- Impacto na Carteira: Apoia a priorização ajustada ao risco de candidatos anti-invasão por meio de leituras fenotípicas quantificáveis e ligadas a mecanismos.
Considerações sobre a Implementação
- Exige experiência em cultura celular, instrumentação baseada em impedância (por exemplo, xCELLigence) e técnica estéril para formação reprodutível de monocamada.
- Depende de placas com matriz de eletrodos de ouro (EPLs) e sistemas analisadores de impedância com controle ambiental (37 °C, 5 % CO₂) para estabilidade do sinal.
- Requer padronização entre equipes quanto à densidade de semeadura de células endoteliais, número de passagem (<6) e tempo de equilíbrio pré-invasão (≥18 horas) para comparabilidade dos dados.
- Envolve considerações de adaptação ao estender o método a células imunes ou outros tipos celulares, incluindo a otimização das razões efetor-alvo e compatibilidade do meio.
- Limitação prática: A interpretação do sinal assume que as alterações de impedância refletem principalmente a cobertura celular e a morfologia; fatores de confusão como condutividade do meio ou sujeira nos eletrodos devem ser controlados.
