Name: Análise de Morfologia Spine dendríticas em neurônios cultivados CNS (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-07-13T12:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 48 s
Description: Aprenda a analisar a morfologia e motilidade de espinhas dendríticas em neurônios corticais cultivados usando GFP e microscopia confocal. Este método permite estudar plasticidade sináptica e disfunções neurológicas.

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Agradecemos a Kelly Jones para edição cuidadosa. Este trabalho foi financiado pelo NIH conceder R01MH 071316, Associação de Alzheimer, a Aliança Nacional de Pesquisa em Esquizofrenia e Depressão (NARSAD), ea Aliança Nacional para a Pesquisa do Autismo (Naar) (PP); American Heart Fellowship Associação de Pós-Doutorado (DPS); americano coração Fellowship Association Predoctoral (KMW).

<ol><li>Banker, G., Goslin, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Developments+in+neuronal+cell+culture%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Developments in neuronal cell culture.</a> Nature. 336, 185-186 (1988).</li>
<li>Xie, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Kalirin-7+controls+activity-dependent+structural+and+functional+plasticity+of+dendritic+spines%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Kalirin-7 controls activity-dependent structural and functional plasticity of dendritic spines.</a> Neuron. 56, 640-656 (2007).</li>
<li>Spear, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modeling+adolescent+development+and+alcohol+use+in+animals%5BTitle%5D)+AND+%22Alcohol+Res+Health%22%5BJournal%5D)">Modeling adolescent development and alcohol use in animals.</a> Alcohol Res Health. 24, 115-123 (2000).</li>
<li>Srivastava, D. P., Woolfrey, K. M., Liu, F., Brandon, N. J., Penzes, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Estrogen+receptor+ss+activity+modulates+synaptic+signaling+and+structure%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Estrogen receptor ss activity modulates synaptic signaling and structure.</a> J Neurosci. 30, 13454-13460 (2010).</li>
<li>Srivastava, D. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+enhancement+of+two-step+wiring+plasticity+by+estrogen+and+NMDA+receptor+activity%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+USA%22%5BJournal%5D)">Rapid enhancement of two-step wiring plasticity by estrogen and NMDA receptor activity.</a> Proc Natl Acad Sci USA. 105, 14650-14655 (2008).</li>
<li>Woolfrey, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epac2+induces+synapse+remodeling+and+depression+and+its+disease-associated+forms+alter+spines%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Epac2 induces synapse remodeling and depression and its disease-associated forms alter spines.</a> Nat Neurosci. 12, 1275-1284 (2009).</li>
<li>Allison, D. W., Gelfand, V. I., Spector, I., Craig, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+actin+in+anchoring+postsynaptic+receptors+in+cultured+hippocampal+neurons%3A+differential+attachment+of+NMDA+versus+AMPA+receptors%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Role of actin in anchoring postsynaptic receptors in cultured hippocampal neurons: differential attachment of NMDA versus AMPA receptors.</a> J Neurosci. 18, 2423-2436 (1998).</li>
<li>Harms, K. J., Tovar, K. R., Craig, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synapse-specific+regulation+of+AMPA+receptor+subunit+composition+by+activity%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Synapse-specific regulation of AMPA receptor subunit composition by activity.</a> J Neurosci. 25, 6379-6388 (2005).</li>
<li>Xie, Z., Huganir, R. L., Penzes, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Activity-dependent+dendritic+spine+structural+plasticity+is+regulated+by+small+GTPase+Rap1+and+its+target+AF-6%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Activity-dependent dendritic spine structural plasticity is regulated by small GTPase Rap1 and its target AF-6.</a> Neuron. 48, 605-618 (2005).</li>
<li>Jones, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+modulation+of+spine+morphology+by+the+5-HT2A+serotonin+receptor+through+kalirin-7+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+USA%22%5BJournal%5D)">Rapid modulation of spine morphology by the 5-HT2A serotonin receptor through kalirin-7 signaling.</a> Proc Natl Acad Sci USA. 106, 19575-19580 (1957).</li>
<li>Dunaevsky, A., Tashiro, A., Majewska, A., Mason, C., Yuste, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Developmental+regulation+of+spine+motility+in+the+mammalian+central+nervous+system%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+USA%22%5BJournal%5D)">Developmental regulation of spine motility in the mammalian central nervous system.</a> Proc Natl Acad Sci USA. 96, 13438-13443 (1999).</li>
<li>Lichtman, J. W., Conchello, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescence+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Fluorescence microscopy.</a> Nat Methods. 2, 910-919 (2005).</li>
<li>Svoboda, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Do+spines+and+dendrites+distribute+dye+evenly%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Do spines and dendrites distribute dye evenly.</a> Trends Neurosci. 27, 445-446 (2004).</li>
</ol>

Produção deste trabalho foi suportado pelo Metamorph (dispositivos Molecular, Inc.).

As técnicas descritas acima para a análise quantitativa detalhada da morfologia da coluna dendríticas, densidade linear e mobilidade em qualquer fixo ou ao vivo neurônios corticais primárias estão focadas na compreensão dos efeitos da pós-sinápticos mecanismos que podem contribuir para neuropatologias. Uma abordagem semelhante pode ser usado para quantificar a morfologia da coluna ou motilidade em qualquer neurônio spiny, incluindo piramidais do hipocampo, Purkinje, ou neurônios espinhosos médios. <p class="jove_con...

<table border="1"><tbody><tr><th> Nome do reagente </th><th> Companhia </th><th> Número de catálogo </th><th> Comentários (opcional) </th></tr><tr><td> 18 milímetros de vidro tampa redonda No. 1,5 </td><td> Warner Instruments </td><td> 64-0714 (CS-18R15) </td><td></td></tr><tr><td> 22 milímetros quadrados tampa de vidro No. 1,5 </td><td> Warner Instruments </td><td> 64-0721 (CS-22S15) </td><td></td></tr><tr><td> Poli-D-lisina </td><td> Sigma </td><td> P-0899 </td><td> MW 70 ~ 150 Kda </td></tr><tr><td> Mídia Neurobasal </td><td> Invitrogen </td><td> 21103049 </td><td></td></tr><tr><td> B27 </td><td> Invitrogen </td><td> 17504044 </td><td></td></tr><tr><td> Glutamina </td><td> Invitrogen </td><td> 21051024 </td><td></td></tr><tr><td> Penicilina-estreptomicina </td><td> Invitrogen </td><td> 15140148 </td><td></td></tr><tr><td> D, L-APV (AP-5) </td><td> Ascent Scientific </td><td> Asc-004 </td><td></td></tr><tr><td> Lipofectamine 2000 </td><td> Invitrogen </td><td> 11668019 </td><td></td></tr><tr><td> DMEM </td><td> Invitrogen </td><td> 11965092 </td><td></td></tr><tr><td> HEPES </td><td> Mediatech Cellgro </td><td> 25-060-C 1 </td><td> 1M, pH 7 </td></tr><tr><td> Solução de formaldeído </td><td> Merck Química </td><td> FX0415-5 </td><td> 36%, Histologia grau </td></tr><tr><td> Cabras normais Serum </td><td> VWR </td><td> 100188-514 </td><td> Jackson Immunoresearch Labs </td></tr><tr><td> Triton X-100 </td><td> Fisher Scientific </td><td> AC21568-2500 </td><td> Acros Organics </td></tr><tr><td> Alexa Fluor 488 cabra anti-camundongo IgG (H + L) altamente cross-adsorvido </td><td> Invitrogen </td><td> A-11029 </td><td></td></tr><tr><td> Alexa Fluor 488 cabra anti-IgG de coelho (H + L) * altamente * cross-adsorvido </td><td> Invitrogen </td><td> A-11034 </td><td></td></tr><tr><td> Prolongar reagente Antifade Ouro </td><td> Invitrogen </td><td> P36934 </td><td> Embalagens especiais </td></tr><tr><td> Câmara de estágio fechado imagem </td><td> Warner </td><td> RC-30HV </td><td></td></tr><tr><td> Unidade de controlador de temperatura </td><td> Warner </td><td> TC-344B </td><td></td></tr><tr><td> Metamorph </td><td> Universal Imagem </td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

análise de morfologia spine dendríticas em neurônios cultivados cns

Analysis of Dendritic Spine Morphology in Cultured CNS Neurons

Espinhas dendríticas são os locais da maioria das conexões excitatórias no cérebro, e formam o compartimento pós-sináptico das sinapses. Estas estruturas são ricas em actina e tem se mostrado altamente dinâmico. Em resposta à plasticidade Hebbian clássica, bem como sinais de neuromoduladores, espinhas dendríticas pode mudar de forma e número, que é pensado para ser crítico para o refinamento dos circuitos neurais e processamento e armazenamento de informações dentro do cérebro. Dentro de espinhas dendríticas, uma complexa rede de proteínas ligação sinais extracelulares com o cyctoskeleton actina permitindo o controle da morfologia da coluna dendríticas e número. Estudos neuropatológicos demonstraram que um número de estados de doença, que vão desde a esquizofrenia para transtornos do espectro do autismo, exibir morfologia anormal da coluna dendríticas ou números. Além disso, estudos genéticos recentes identificaram mutações em genes que codificam várias proteínas sinápticas, levando a sugestões de que estas proteínas podem contribuir para a plasticidade da coluna aberrante que, em parte, estão na base da fisiopatologia desses transtornos. A fim de estudar o potencial papel destas proteínas no controle morfologias espinha dendrítica / número, o uso de culturas de neurônios corticais oferece várias vantagens. Em primeiro lugar, este sistema permite uma alta resolução de imagem das espinhas dendríticas em células fixo, assim como lapso de tempo imagens de células vivas. Em segundo lugar, este sistema in vitro permite a fácil manipulação da função da proteína pela expressão de proteínas mutantes, knockdown por construções shRNA, ou tratamentos farmacológicos. Estas técnicas permitem aos pesquisadores começam a dissecar o papel da doença proteínas associadas e prever como as mutações dessas proteínas podem funcionar in vivo.

Numerosos estudos recentes identificaram mutações em proteínas sinápticas associada a patologias cerebrais. Primários cultivados neurônios corticais oferecem grande flexibilidade para examinar os efeitos destas proteínas doenças associadas na morfologia e motilidade espinha dendrítica.

Análise de Morfologia Spine dendríticas em neurônios cultivados CNS

As espinhas dendríticas são os locais da maioria das conexões excitatórias no cérebro e formam o compartimento pós-sináptico das sinapses. Estas...

O objetivo geral do experimento a seguir é avaliar os efeitos de diversas manipulações moleculares e farmacológicas sobre a morfologia e a motilidade das espinhas dendríticas. Isso é conseguido por meio da secção de neurônios corticais primários cultivados com GFP, com ou sem expressão exógena de plasmídeos de DNA para delinear a morfologia neuronal e manipular a expressão e função de proteínas endógenas. Na segunda etapa, as células podem ser tratadas farmacologicamente e, posteriormente, fixadas para imunomarcação ou preparadas para imagens de lapso de tempo.Em seguida, o tratamento farmacológico, que permitirá a visualização das espinhas dendríticas e as alterações induzidas na morfologia e motilidade das espinhas dendríticas. Em seguida, são adquiridas imagens em série Z de células fixadas ou imagens de células vivas obtidas em pontos temporais específicos utilizando um microscópio confocal. Medições detalhadas da morfologia das espinhas dendríticas podem ser realizadas a partir de projeções 2D de imagens em série Z.Os resultados obtidos demonstram o efeito de manipulações moleculares ou farmacológicas sobre a morfologia ou motilidade dos espinhos dendríticos, com base em análi

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Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neurociência

Fonte: Pekarek, B. T., et. al., Imagem e quantificação de dendritos neuronais intactos via limpeza de tecido CLARITY. J. Vis. Exp. (2021)Neste vídeo, demonstramos a preparação, imagem e análise de um cérebro de camundongo limpo para examinar árvores dendríticas, morfologia da coluna vertebral e distribuição neuronal usando microscopia confocal e técnicas de reconstrução 3D.

Imagem de microscopia confocal de árvores dendríticas intactas e morfologia da coluna vertebral em um cérebro de camundongo limpo

Fonte: Gouder, et. al. Quantificação tridimensional de espinhas dendríticas de neurônios piramidais derivados de células-tronco pluripotentes induzidas por humanos. J. Vis. Exp. (2015).Este vídeo demonstra a imagem e análise de espinhas dendríticas em neurônios piramidais transduzidos e imunomarcados usando microscopia confocal. O ruído de fundo é reduzido e os dendritos são rastreados estimando seu diâmetro e comprimento. A segmentação automatizada da coluna vertebral envolve a definição de...

Quantificação de espinhas dendríticas usando imagens de microscopia confocal

Este artigo descreve um protocolo de trabalho de imagem espinhas dendríticas dos neurônios do hipocampo in vitro utilizando Structured Illumination Microscopy (SIM). Microscopia Super-resolução usando SIM oferece resolução de imagem significativamente além do limite de difração da luz em todas as três dimensões espaciais, permitindo que a imagem de espinhas dendríticas individuais com maior pormenor.

Imagiologia espinhas dendríticas dos neurônios do hipocampo de rato primária usando Structured Illumination Microscopy

Descrevemos dois métodos para visualização e quantificação da arborização dendrítica no hipocampo de modelos de camundongos: imagens em tempo real e de profundidade de campo estendida. Enquanto o primeiro método permite um rastreamento topográfico sofisticado e a quantificação da extensão da ramificação, o último permite a visualização rápida da árvore dendrítica.

Avaliação de dendríticas Arborização no giro dentado do hipocampo em Ratos Região

Espinhas dendríticas dos neurônios piramidais são os sites da maioria das sinapses excitatórias no córtex cerebral dos mamíferos. Este método descreve a análise quantitativa 3D de morfologias coluna em neurônios piramidais glutamatérgicos corticais humanos derivados de células-tronco pluripotentes induzidas.

A quantificação tridimensional das espinhas dendríticas de Piramidal neurônios derivados pluripotentes induzidas pelo homem Células-Tronco

Aqui apresentamos um protocolo Golgi-Cox com detalhes detalhados. Este método de mancha de tecido confiável permite uma avaliação de alta qualidade da citoarquitetura no hipocampo e em todo o cérebro, com solução de problemas mínima.

Avaliação da complexidade dendrítica do hipocampo em ratos idosos usando o método de Golgi-Cox

Apresentamos um protocolo para rotular e analisar neurônios piramidais, o que é fundamental para avaliar possíveis alterações morfológicas em neurônios e espinhas dendríticas que podem estar por trás de anormalidades neuroquímicas e comportamentais.

Rotulagem Balística de Neurônios Piramidais em Fatias Cerebrais e na Cultura Celular Primária

As espinhas dendríticas são características celulares importantes do sistema nervoso. Aqui são descritos métodos de imagem vivos para avaliar a estrutura e a função dos espinhos dendríticos em C. elegans. Essas abordagens apoiam o desenvolvimento de telas mutantes para genes que definem a forma ou a função da coluna dendrítica.

Imagem de espinhas dendríticas em Caenorhabditis elegans

O protocolo descreve uma modificação do método golgi rápido, que pode ser adaptado a qualquer parte do sistema nervoso, para colorir neurônios no hipocampo e córtex pré-frontal medial do rato.

Mancha rápida de Golgi para Visualização da Coluna Dendrítica no Hipocampo e Córtex Pré-Frontal

As espinhas dendríticas são compartimentos pós-sinápticos da maioria das sinapses excitatórias. Alterações na morfologia da coluna dendrítica ocorrem durante o neurodesenvolvimento, envelhecimento, aprendizado e muitos distúrbios neurológicos e psiquiátricos, ressaltando a importância de uma análise confiável da coluna dendrítica. Este protocolo descreve a quantificação da morfologia da coluna dendrítica de forma precisa e reprodutível usando um software automático de reconstrução...

Quantificação da coluna dendrítica usando um software automático de reconstrução tridimensional de neurônios

Aprenda a analisar a morfologia e motilidade de espinhas dendríticas em neurônios corticais cultivados usando GFP e microscopia confocal. Este método permite estudar plasticidade sináptica e disfunções neurológicas.

Análise de Morfologia Spine dendríticas em neurônios cultivados CNS

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