Name: Na reconstituição in vitro da atividade T. Telomerase castaneum (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-07-14T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 25 s
Description: Aprenda a reconstituir a telomerase de Tribolium castaneum in vitro usando proteína recombinante Tc TERT e RNA total de larvas. Este método permite avaliar a atividade enzimática por ensaio trap.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

A pesquisa apresentada aqui foi apoiado pelo departamento de Pensilvânia da saúde, o Medical Ellison, The V e As Fundações Esmeralda.

1. Expressão de recombinante TERT Tc <ol><li> Inocular 6 L de 2YT media (6 x 2 L Intrigado Frascos Erlenmeyer contendo 1 L de caldo de 2YT em cada) de seis pratos frescos de células transformadas pLysS Rosetta (DE3) contendo o sintético Tc TERT plasmídeo com um TEV N-terminal clivável hexahistidine- tag. </li><li> Cultivar células a 37 ° C agitando a 220 rpm para um OD 600 de 0,5-0,6. </li><li> Induzir a expressão da proteína pela adição de 1 mM IPTG. </li><li> Reduzir a temperatura a 30 ° C, lenta agitação a 150 rpm, e permitir que as células expressam a proteína por 4-5 h. </li><li> Células colheita por centrifugação a 4 ° C e 3500 rpm por 30 min. </li><li> Ressuspender cada 1 L pellet celular em 20 ml de tampão contendo 25 mM Tris, pH 7,5, glicerol 10%, 0,5 M KCl, 15 mM imidazol, 5 mM β-mercaptoetanol e 0,1 mM de fluoreto phenylmethyl sulfonil (PMSF) e benzamidine. </li><li> Flash congelar ressuspenso mistura células por gotejamento lentamente as células em um tubo de plástico 50 ml cônico cheio de nitrogênio líquido para que cada gota congela no impacto no N 2 líquido. Armazenar células congeladas a -80 ° C até que esteja pronto para a purificação de proteínas. </li></ol> 2. Purificação do Tc TERT <ol><li> Células descongelar à temperatura ambiente até que uma consistência líquida é atingido e depois passar para copos de metal em gelo por sonicação. </li><li> Sonicate células no gelo por 2 min, em intervalos de 30 segundos com 30 segundo faz uma pausa, em cerca de 51 W de potência. </li><li> Spin down células lisadas a 18.000 rpm por 20 min para separar as frações de proteínas solúveis e insolúveis e remova cuidadosamente o sobrenadante para cromatografia de afinidade de níquel. </li><li> Equilibrar a Ni-NTA (níquel-nitrilotriacético ácido) coluna com tampão contendo 25 mM Tris, pH 7,5, glicerol 10%, 0,5 M KCl, 15 mM imidazol, 5 mM β-mercaptoetanol e 0,1 mM PMSF e benzamidine. </li><li> Sobrenadante de carga sobre a resina e recolher a fluir. </li><li> Lavar a coluna com tampão contendo 25 mM Tris, pH 7,5, glicerol 10%, 500 mM KCl, 15 mM imidazol, 5 mM β-mercaptoetanol e 0,1 mM PMSF para remover todas as proteínas residual e não especificamente ligados. </li><li> Eluir Tc TERT da resina Ni-NTA usando um gradiente de imidazol de 15 - 300 mm e coletar 3 ml de frações SDS PAGE análise. </li><li> Usar a análise de PAGE para determinar quais frações de proteínas contêm Tc TERT e concentrar essas frações em um Amicon 30 kDa (Millipore) filtro. </li><li> Concentre-se frações Tc TERT a um volume inferior a 10 ml para posterior purificação. </li><li> A TERT Tc é mais purificada sobre a coluna de troca catiônica (HS poros, a Applied Biosystems) pré-equilibrada com tampão contendo 25 mM Tris, pH 7,5, glicerol 10%, 500 mM KCl, e 1 mM DTT. </li><li> Carregar o mix de proteínas na coluna poros HS e lavá-lo para remover todos os contaminantes de proteína e ácido nucléico. </li><li> Lavar a coluna com tampão contendo 500 mM KCl seguido por 700 mM KCl para remover quaisquer contaminantes restantes. </li><li> Eluir a Tc proteína TERT fora da coluna poros HS com um tampão KCl M. Neste ponto, a proteína deve ser mais de 99% pura. </li><li> Remova todos os agregados de proteínas, passando a proteína mais de uma coluna de dimensionamento Superdex-200 (tamanho da cromatografia de exclusão - GE Healthcare), pré-equilibrada com tampão contendo 25 mM Tris, pH 7,5, glicerol 10%, 500 mM KCl, e 1 TCEP mM. </li></ol> 3. Tribolium castaneum cultura besouro <ol><li> O T. castaneum besouros onde inicialmente fornecido como um presente pelo Dr. S. Brown, Divisão de Biologia, Kansas State University. </li><li> Iniciar T. cultura castaneum adicionando cem besouros adultos para um recipiente com 28,5 g de farinha e 1,5 g de fermento de padeiro seco é. </li><li> Culturas Loja besouro em temperatura ambiente e em um ambiente escuro, úmido por três a quatro semanas para permitir a reprodução e crescimento. Coloque um copo contendo água na área de armazenamento besouro para garantir um ambiente úmido. </li><li> Colher as larvas do besouro, conforme necessário para o isolamento do RNA. Permitir que as larvas restantes para amadurecer a adultos, mantendo-os na mesma cultura. </li><li> Cada mês, transferir os besouros mais ativos (não mais de uma centena) para um balão novo contendo farinha eo fermento fresco para reabastecer seu suprimento de alimentos. </li></ol> 4. T. castaneum RNA total isolamento <ol><li> Colheita larvas do besouro 20 da cultura (cada cultura deve conter entre 500-1000 larvas), separando-os dos besouros adultos e da cultura da farinha / fermento. Eliminar a farinha ou partículas de fermento anexado ao besouros antes de triturar-los. </li><li> Esterilizar a área do banco, a argamassa eo pilão (considerar tratar as luvas bem) usado para este procedimento com RNaseZap (Ambion, Inc.) para remover todos os vestígios de ribonucleases antes de triturar os besouros. </li><li> Moer larvas em N 2 líquido em um pó fino com um pilão e tRANSFERÊNCIA o pó para um tubo de centrífuga de 50 ml, mantendo o N 2 líquido para garantir que o pó fica congelada até que o tampão de extração é adicionado. </li><li> Permitir que o excesso de líquido evaporar N 2 a partir do pó. Depois que o N 2 líquido tenha evaporado, homogeneizar o pó em 200 mL besouro de tampão de extração (por 20 larvas do besouro), contendo 25 mM Tris-HCl, 5 mM β-mercaptoetanol, 1 mM EGTA, 0,1 benzamidine mM, 200 mM KCl, 10 glicerol%, 10 mM imidazol e 20U de RNasin, pH 7,5 e incubar no gelo por 30 minutos. </li><li> Centrifugar o homogeneizado a 15.000 rpm por 20 minutos a 4 ° C, recolher o sobrenadante e flash congelar a amostra em N 2 líquido. Se necessário, as amostras podem ser armazenadas a -80 ° C durante a noite. </li><li> Extrair o RNA total usando o RNeasy Mini Kit (Qiagen). </li></ol> 5. Reconstituição in vitro de Tribolium castaneum telomerase <ol><li> Mix 20 mcg de recombinante His-tag Tc TERT com 50 ul de T. RNA castaneum total no buffer de ligação contendo 25 mM Tris-HCl, KCl 200 mM, glicerol 10%, 5 mM β-mercaptoetanol, e 10 mM imidazol, pH 7.5. </li><li> Incubar a TERT Tc - mistura de RNA total por duas horas a 22 ° C em T. castaneum lisado na presença de RNasin inibidor para prevenir a degradação do RNA. </li><li> Purificar o complexo mais de uma coluna Ni-NTA para remover as impurezas lisado e RNA em excesso. </li></ol> 6. Telomerase protocolo de amplificação de repetição (TRAP) ensaios <ol><li> Misture 4 mg de T. purificada Ni-NTA telomerase castaneum em 50 de buffer alongamento l contendo 20 mM Tris-HCl (pH - 8,3), 7,5 mM MgCl 2, 63 mM KCl, 0,05% Tween 20, 1 mM EGTA, BSA 0,01%, 0,5 mM dNTPs, 1 mM TCAS-TS Primer DNA (5'-AAGCCGTCGAGCAGAGTC-3 '), e incubar a mistura a 30 ° C por 60 minutos para permitir o alongamento do primer DNA TCAS-TS pelo T. reconstituído telomerase castaneum. </li><li> Extrair o DNA de fita simples alongada (ssDNA), adicionando um volume igual de clorofórmio fenol à mistura de reação. Agitar a mistura suavemente até que a emulsão é homogênea. </li><li> Centrifugar a amostra a 12.000 rpm por cinco minutos a 4 ° C para separar o ssDNA de contaminantes. </li><li> Transferir a camada superior aquosa da amostra a um tubo eppendorf 1,5 ml, adicionar uma concentração final de 10 mM NaOAc (pH 5,0), 1 mM de MgCl 2, e 66,4% EtOH e depois deixar a amostra para precipitar durante a noite a -20 ° C. </li><li> Girar a amostra a 15.000 rpm para 30 minutos a 4 ° C para agregar as ssDNA precipitado. Decantar a solução com uma pipeta e, em seguida, adicionar 200 mL de EtOH 70% para a amostra de lavar NaOAc restantes e MgCl 2 a partir da amostra. Centrifugar a amostra por cinco minutos com a mesma velocidade e temperatura de re-pellet a amostra. </li><li> Decantar a solução EtOH usando uma pipeta e remover vestígios de etanol, permitindo que o tubo eppendorf para incubar aberta à temperatura ambiente por três minutos. Tendo etanol presente na amostra irá interferir com a etapa de amplificação por PCR. </li><li> Ressuspender o sedimento ssDNA (contendo o produto telomerase alongado eo primer TCAS-TS) em 50 ul de tampão de PCR reação contendo 10 mM Tris-HCl (pH 8), 50 mM KCl, 2 mM MgCl 2, 100 mM dNTPs (dATP, dGTP e dTTP), 10 mM [32 P] dCTP, 1 mM de primer TCAS-CX (5'-GTGTGACCTGACCTGACC-3 ') e 1,25 U Taq DNA polimerase. </li><li> PCR amplificar os produtos telomerase alongamento (29 ciclos de 94 ° C por 30 segundos, 50 ° C por 30 segundos e 72 ° C por 1 minuto), de modo que sejam visíveis em gel de poliacrilamida 12%. </li><li> Pré-executar o gel 12% com Tris-Borato-EDTA (TBE) rodando tampão contendo 44,5 mM Tris, 44,5 mM de ácido bórico, 1 mM EDTA, pH 8 para 30 minutos antes de executar as amostras do PCR. Após a pré-execução e carregamento do gel com as reações de PCR, execute o gel de 185 Volts para 1,5-2 horas a 4 ° C ou em gelo. </li><li> Secar o gel e use o fósforo placa de imagem para visualizar a atividade. </li></ol> 7. Resultados representativos: Um exemplo do Tc purificada TERT após cromatografia de exclusão de tamanho é mostrado na Figura 2. A proteína concentrada após purificação é executado em um 12% de gel de poliacrilamida SDS-e mostra-se mais de 99% puro (Figura 2A). O tamanho da exclusão cromatograma (S200) também é fornecida (Figura 2B) para demonstrar a pureza ea falta de agregados a partir da amostra de proteína purificada. A produção de 5 mg de proteína após todas as etapas de purificação foram concluídos geralmente é obtido apesar de o rendimento final pode variar. Um ensaio de TRAP representante para o T. reconstituído telomerase castaneum é mostrado na Figura 3 como já foi relatado por Mitchell et al. 12. A escada passo a passo de produtos telomerase pode ser visto na pista 1, no entantoeles estão ausentes tanto na telomerase RNase tratados e os ativos do site TERT mutante (D251A) amostras em faixas 2 e 3, respectivamente. <img src="/files/ftp_upload/2799/2799fig1.jpg" alt="Figura 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 1"> Figura 1. Fluxograma das etapas envolvidas na reconstituição do recombinante Tc TERT. Primeiro, o recombinante Tc TERT é sobre-expressa em E. coli. A proteína é então purificado por níquel, de troca catiônica, e cromatografia por exclusão de tamanho. O T. castaneum besouros são cultivadas em casa e suas larvas são usadas para isolar o RNA total. A purificada Tc TERT eo RNA total é então misturado para reconstituir o complexo RNP telomerase, e um ensaio TRAP subseqüente é usado para confirmar o complexo RNP é um telomerase ativa. <img src="/files/ftp_upload/2799/2799fig2.jpg" alt="Figura 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 2"> Figura 2. Cromatograma tamanho exclusão e SDS PAGE análise de proteína TERT Tc. (A) 12% gel de poliacrilamida SDS da proteína TERT Tc após cromatografia de exclusão de tamanho. O Tc proteína TERT (70 kDa) migra mais rápido no gel SDS PAGE porque tem um ponto alto isoelétrico (pI - 9,8). (B) cromatograma exclusão de tamanho (Superdex S200) da proteína TERT Tc. <img src="/files/ftp_upload/2799/2799fig3.jpg" alt="Figura 3" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 3"> Figura 3. Ensaios de TRAP do in vitro reconstituído Tribolium castaneum telomerase adaptada de Mitchell et al. 12. Pista 1: tipo selvagem Tc TERT e RNA total isolado de larvas de besouro. Faixa 2: tipo selvagem Tc TERT e RNase tratados larvas RNA total e extratos de células. Pista 3: ativa local mutante Tc TERT (D251A) e larvas de besouro larvas RNA total.

<ol><li>Gillis, A. J., Schuller, A. P., Skordalakes, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structure+of+the+Tribolium+castaneum+telomerase+catalytic+subunit+TERT%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Structure of the Tribolium castaneum telomerase catalytic subunit TERT.</a> Nature. 455, 633-637 (2008).</li>
<li>Greider, C. W., Blackburn, E. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+a+specific+telomere+terminal+transferase+activity+in+Tetrahymena+extracts%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Identification of a specific telomere terminal transferase activity in Tetrahymena extracts.</a> Cell. 43, 405-413 (1985).</li>
<li>Harley, C. B., Futcher, A. B., Greider, C. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Telomeres+shorten+during+ageing+of+human+fibroblasts%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Telomeres shorten during ageing of human fibroblasts.</a> Nature. 345, 458-460 (1990).</li>
<li>Hayflick, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Limited+in+vitro+Lifetime+of+Human+Diploid+Cell+Strains%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Cell+Res%22%5BJournal%5D)">The Limited in vitro Lifetime of Human Diploid Cell Strains.</a> Exp Cell Res. 37, 614-636 (1965).</li>
<li>Blackburn, E. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Telomeres%3A+no+end+in+sight%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Telomeres: no end in sight.</a> Cell. 77, 621-623 (1994).</li>
<li>Kim, N. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Specific+association+of+human+telomerase+activity+with+immortal+cells+and+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Specific association of human telomerase activity with immortal cells and cancer.</a> Science. 266, 2011-2015 (1994).</li>
<li>Bodnar, A. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extension+of+life-span+by+introduction+of+telomerase+into+normal+human+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Extension of life-span by introduction of telomerase into normal human cells.</a> Science. 279, 349-352 (1998).</li>
<li>Greider, C. W., Blackburn, E. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+telomere+terminal+transferase+of+Tetrahymena+is+a+ribonucleoprotein+enzyme+with+two+kinds+of+primer+specificity%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">The telomere terminal transferase of Tetrahymena is a ribonucleoprotein enzyme with two kinds of primer specificity.</a> Cell. 51, 887-898 (1987).</li>
<li>Greider, C. W., Blackburn, E. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+telomeric+sequence+in+the+RNA+of+Tetrahymena+telomerase+required+for+telomere+repeat+synthesis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">A telomeric sequence in the RNA of Tetrahymena telomerase required for telomere repeat synthesis.</a> Nature. 337, 331-337 (1989).</li>
<li>Jacobs, S. A., Podell, E. R., Cech, T. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Crystal+structure+of+the+essential+N-terminal+domain+of+telomerase+reverse+transcriptase%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Struct+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Crystal structure of the essential N-terminal domain of telomerase reverse transcriptase.</a> Nat Struct Mol Biol. 13, 218-225 (2006).</li>
<li>Rouda, S., Skordalakes, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structure+of+the+RNA-binding+domain+of+telomerase%3A+implications+for+RNA+recognition+and+binding%5BTitle%5D)+AND+%22Structure%22%5BJournal%5D)">Structure of the RNA-binding domain of telomerase: implications for RNA recognition and binding.</a> Structure. 15, 1403-1412 (2007).</li>
<li>Mitchell, M., Gillis, A., Futahashi, M., Fujiwara, H., Skordalakes, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+basis+for+telomerase+catalytic+subunit+TERT+binding+to+RNA+template+and+telomeric+DNA%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Struct+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Structural basis for telomerase catalytic subunit TERT binding to RNA template and telomeric DNA.</a> Nat Struct Mol Biol. 17, 513-518 (2010).</li>
</ol>

Não há conflitos de interesse declarados.

O método aqui apresentado permite a produção de grandes quantidades da subunidade catalítica de T. castaneum TERT telomerase na forma solúvel ativo para estudos estruturais e bioquímicos. O método de Tc TERT sobre-expressão é sensível a mudanças sutis na temperatura ou densidade celular daqueles acima mencionados e pode afetar drasticamente os níveis de expressão da proteína. Especificamente, nós descobrimos que as células para induzir a expressão da proteína antes de a densidade óptica atinge 0,5 a 60...

<table border="1"><tbody><tr><th> Nome do reagente </th><th> Companhia </th><th> Número de catálogo </th></tr><tr><td> Rosetta (DE3) Células plysS </td><td> Novagen </td><td> 70956 </td></tr><tr><td> 2YT Caldo </td><td> Teknova </td><td> Y0215 </td></tr><tr><td> IPTG </td><td> Biotecnologia ouro </td><td> I2481C </td></tr><tr><td> MISONIX sonicador 3000 </td><td> Qsonica, LLC. </td><td></td></tr><tr><td> AKTA Purifier FPLC </td><td> GE Life Sciences </td><td></td></tr><tr><td> Ni-NTA Resina Superflow </td><td> Qiagen </td><td> 30410 </td></tr><tr><td> Amicon Ultra-15 Dispositivo Centrífuga Filtro </td><td> Millipore </td><td> UFC903008 </td></tr><tr><td> POROS 50 HS de troca catiônica forte Embalagem </td><td> Applied Biosystems </td><td> 1-3359-06 </td></tr><tr><td> POROS 50 HQ de troca catiônica forte Embalagem </td><td> Applied Biosystems </td><td> 1-2559-06 </td></tr><tr><td> Superdex 200 10/300 coluna por exclusão de tamanho- </td><td> GE Life Sciences </td><td> 17-5175-01 </td></tr><tr><td> Fenol: Clorofórmio: 25:24:1 isoamilo com 10mM Tris, pH 8, EDTA 1mM </td><td> Sigma </td><td> P3803-100mL </td></tr><tr><td> RNaseZap </td><td> Ambion </td><td> AM9780 </td></tr><tr><td> Recombinante inibidor da ribonuclease Rnasin </td><td> Promega </td><td> N251B </td></tr><tr><td> RNeasy Mini Kit </td><td> Qiagen </td><td> 74104 </td></tr><tr><td> Oligonucleotides DNA </td><td> Integrada DNA Technologies </td><td></td></tr></tbody></table>

na reconstituição in vitro da atividade t. telomerase castaneum

In vitro Reconstitution of the Active T. castaneum Telomerase

Esforços para isolar a subunidade catalítica da telomerase, TERT, em quantidades suficientes para estudos estruturais, foram cumpridos com sucesso limitado por mais de uma década. Aqui, apresentamos métodos para o isolamento do recombinante Tribolium castaneum TERT (Tc TERT) ea reconstituição do T. ativos telomerase castaneum ribonucleoproteína complexos (RNP) in vitro. A telomerase é uma transcriptase reversa que adiciona uma especializados repete DNA curtas, chamadas telômeros, a extremidade 3 &#39;dos cromossomas lineares duas que servem para protegê-los de ponta a ponta-de fusão e degradação. Após a replicação do DNA, um pequeno segmento é perdido no fim do cromossomo 3, e sem telomerase, as células continuam dividindo até que finalmente atingir o seu limite Hayflick 4. Além disso, a telomerase está adormecida na maioria das células somáticas 5 em adultos, mas é ativo em células de câncer 6, onde promove a imortalidade celular 7. A enzima telomerase mínima consiste em dois componentes principais: a subunidade de proteína (TERT), que compreende a subunidade catalítica da enzima e um componente integrante RNA (TER), que contém o TERT modelo usa para sintetizar telômeros 8,9. Até 2008, apenas as estruturas de domínios telomerase indivíduo tinha sido resolvido 10,11. Um grande avanço neste campo veio a determinação da estrutura cristalina dos 12 ativos, subunidade catalítica de T. castaneum telomerase, Tc TERT 1. Aqui, apresentamos métodos para produzir grandes quantidades do ativo TERT Tc, solúvel para estudos estruturais e bioquímicos, e da reconstituição do complexo RNP telomerase in vitro para ensaios de atividade telomerase. Uma visão geral dos métodos experimental utilizado é mostrado na Figura 1.

Esforços para isolar a subunidade catalítica da telomerase, TERT, em quantidades suficientes para estudos estruturais, foram cumpridos com sucesso limitado por mais de uma década. Aqui, apresentamos métodos para o isolamento do recombinante Tribolium castaneum TERT (<em&gt; Tc</em&gt; TERT) ea reconstituição do ativo<em&gt; T. castaneum</em&gt; Ribonucleoproteína telomerase (RNP) complexo<em&gt; In vitro</em&gt;.

Na reconstituição in vitro da atividade T. Telomerase castaneum

Os esforços para isolar a subunidade catalítica da telomerase, TERT, em quantidades suficientes para estudos estruturais, tiveram sucesso limitado por mais ...

O objetivo geral deste procedimento é reconstituir a telomerase de Trium Castine in vitro e determinar sua atividade. Isso é realizado primeiramente pela expressão da proteína recombinante com marcação por his, Trillium Castine turt, ou proteína turt TC, em e coli. A proteína turt TC expressa é então purificada por meio de várias etapas de cromatografia.O próximo passo do procedimento é cultivar os besouros Trium Castine e isolar o RNA total das larvas de besouro Trium castane. Em seguida, a enzima telomerase é reconstituída in vitro pela mistura da proteína recombinante TC turt com o RNA total extraído. Por fim, podem ser obtidos resultados que demonstram que a telomerase reconstituída in vitro a partir da proteína recombinante e do RNA total exibe atividade da enzima telomerase, conforme visualizado no ensaio TRAP.Embora este método possa fornecer informações sobre o complexo telomerase KE, ele também pode ser aplicado a outros sistemas, como outros complexos de proteína com ácidos nucleicos. Geralmente, indivíduos novos neste método enfrentarão dificuldades porque o isolamento do RNA total de besouros é extremamente sensível à degradação de RNA, e, portanto, deve-se ter grande c

in-vitro-reconstitution-of-the-active-t-castaneum-telomerase

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Este protocolo descreve a preparação de um substrato sintético para o...

Ensaio in vitro de metilação tRNA com a Entamoeba histolytica DNA e Dnmt2 tRNA metiltransferase (Ehmeth) Enzyme

Um método preciso, curto, sofisticado e barato é descrito que avalia o comprimento dos telômeros em múltiplos tecidos e espécies usando qRT-PCR. Além disso, vamos descrever um teste simples para avaliar a atividade da telomerase como um teste backbone complementar para o comprimento dos telômeros.

Comprimento dos telômeros e da telomerase atividade; Um Yin e Yang da senescência celular

A telomerase é expressa no cérebro neonatal e também em regiões distintas do cérebro adulto. Apresentamos um ensaio TRAP não tóxico que economiza tempo para a análise da atividade da telomerase em várias regiões do cérebro de camundongos e detecção de diferenças na atividade da telomerase entre cérebros de camundongos machos e fêmeas.

A atividade da telomerase nas diversas regiões de cérebro de camundongo: A telomerase não-radioativo Repetir Amplification Protocol (TRAP) Assay

Este protocolo descreve técnicas para isolamento de células vivas e cultura primária de linhagens celulares miogênicas e de fibroblastos do tecido muscular ou cutâneo.  Uma técnica para a imortalização dessas linhagens celulares também é descrita.  Juntos, esses protocolos fornecem uma ferramenta confiável para gerar e preservar células derivadas de pacientes para aplicações a jusante.

Isolamento e Imortalidade de linhas celulares derivadas do paciente a partir de biópsia muscular para a doença Modeling

Telômero e telomerase desempenham papéis essenciais no envelhecimento e na tumorigênese. O objetivo deste protocolo é mostrar como gerar dois alelos knock-in de telomerase induzíveis por murinos e como utilizá-los nos estudos de degeneração/regeneração tecidual e câncer.

Utilizando Murino Inducible telomerase alelos nos Estudos de degeneração / regeneração tecidual e Câncer

Neste trabalho, fornecemos um fluxo de trabalho experimental de como os intensificadores ativos podem ser identificados e validados experimentalmente.

Previsão e Validação de elementos reguladores de genes ativada durante ácido retinóico induzida estaminais embrionárias Diferenciação Celular

Proteínas, muitas vezes contêm vários domínios que podem exercer diferentes funções celulares. Gene knock-out (KO) não consideram essa diversidade funcional. Aqui, relatamos uma abordagem de estrutura-função com base na troca de cassete mediada por recombinação (RMCE) em KO células estaminais embrionárias que permite a dissecação molecular de vários domínios funcionais ou variantes de uma proteína.

Estudos de estrutura-função em células estaminais embrionárias Rato Usando recombinase mediada por troca cassete

Transcriptase reversa de telomerase humana (TERT) sintetiza DNA oligospermia, não só mas também double-stranded do RNA através da atividade da RNA polimerase RNA-dependente. Aqui, descrevemos um ensaio recém-criada para detectar atividade de RNA polimerase RNA-dependente de TERT endógena.

Detecção semi-quantitativa de atividade RNA-dependente do RNA polimerase humana Telomerase Transcriptase reversa proteína

Aqui, apresentamos um protocolo detalhado para identificar os eventos de recombinação homóloga que ocorreram em células-tronco embrionárias do mouse usando a mancha do Sul e/ou PCR. Este método é exemplificado pela geração de nonmuscle myosin II substituição genética rato modelos usando embrionária baseada em células-tronco homóloga mediada por recombinação segmentação tecnologia tradicional.

Identificação de eventos de recombinação homóloga em células-tronco embrionárias de camundongo usando Southern Blotting e reação em cadeia da polimerase

Quantificação de DNA dupla fita-estrias usando formação γH2AX como um marcador molecular tornou-se uma ferramenta valiosa na biologia da radiação. Aqui mostramos o uso de um teste de imunofluorescência para a quantificação dos focos γH2AX após a exposição das células à radiação.

Quantificação de γH2AX Focos em resposta à radiação ionizante

Aprenda a reconstituir a telomerase de Tribolium castaneum in vitro usando proteína recombinante Tc TERT e RNA total de larvas. Este método permite avaliar a atividade enzimática por ensaio trap.

Na reconstituição in vitro da atividade T. Telomerase castaneum

Explorar mais vídeos