Cromatina imunoprecipitação de Tissue Dorsal Root Gânglios seguintes Lesão Axonal

O objetivo geral deste procedimento é imunoprecipitar complexos de DNA de proteína reticulada do tecido gangliar da raiz dorsal após lesão nervosa. Isso é feito induzindo primeiro a lesão da coluna ciática ou dorsal. O segundo passo é reticular a amostra e solubilizar o complexo de DNA da proteína.

A terceira etapa do procedimento é imunoprecipitar um complexo de DNA de proteína específico. Finalmente, o DNA é purificado e recuperado. Em última análise, podem ser obtidos resultados que mostram o enriquecimento de fragmentos de DNA associados a uma modificação de proteína ou histona de DNA.

Este método pode ajudar a responder a questões-chave no campo da regeneração ronal, como quais locais de ligação ao DNA, fatores de transcrição e modificações de histonas são necessários para a regulação de genes importantes na promoção da regeneração axonal. Para começar, coloque um animal anestesiado na mesa cirúrgica. Mantenha a anestesia durante toda a cirurgia por meio da administração contínua de oxigênio de isoflurano por meio de um cone nasal antes de prosseguir.

Confirme a profundidade correta da anestesia com o reflexo de pinça do dedo do pé para lesão do nervo ciático. Raspe o quarto traseiro com cuidado e remova os pelos restantes com um agente depilatório. Uma vez removido o cabelo, limpe a pele com aplicações repetidas de álcool seguidas de Betadine.

Faça uma incisão de quatro milímetros através da pele posterior e paralela ao fêmur. No meio da coxa, use uma pinça fina para separar os músculos e expor o nervo ciático branco por baixo. Uma vez isolado, o nervo pode ser deixado sem corte para servir como um controle cirúrgico simulado ou cortado para induzir lesão.

Para finalizar, junte a pele e feche com dois clipes de sutura para lesão da coluna dorsal. Remova o cabelo da parte de trás e limpe o local da incisão conforme mostrado anteriormente. Faça uma incisão de 2,5 centímetros acima da medula espinhal de cerca de T sete a T 13.

Use uma pinça fina para segurar a pele enquanto separa a gordura. Em seguida, prenda a gordura superficial com dois ganchos. Uma vez que a gordura é puxada para trás, localize o vaso sanguíneo no espaço entre a sexta e a sétima vértebras para usar como ponto de referência.

Corte o músculo bilateralmente sobre a oitava e a 10ª vértebras e insira dois ganchos para mantê-lo aberto. Use uma tesoura pequena para limpar os músculos sobre o laminado de T oito a T 10, segurando o processo espinhoso. Realize uma laminectomia em T 10 cortando o osso de conexão em ambos os lados.

Levante cuidadosamente a metade superior das vértebras para revelar a medula espinhal por baixo. Aplique algumas gotas de xilocaína 2% para anestesiar a medula espinhal e, em seguida, remova a dura-máter. Tomando cuidado para não tocar na medula espinhal.

Parar neste ponto forneceria um controle cirúrgico simulado para ferir a coluna dorsal. Faça um corte profundo de 0,3 a 0,4 milímetros na medula espinhal. Por fim, suture o músculo fechado e libere a gordura superficial.

Junte a pele e feche com clipes de sutura. Coloque o animal de volta na gaiola e monitore até que esteja totalmente recuperado. 48 horas após a lesão, eutanasiar o animal e coletar os gânglios da raiz dorsal L quatro e L cinco ou DRG.

O primeiro passo é expor a coluna vertebral ventral. Em seguida, remova a metade ventral das vértebras de T 12 para L seis. Para expor a medula espinhal, identifique os DRGs localizados no espaço entre as vértebras ao lado da medula espinhal.

Use uma pinça fina para agarrar ligeiramente o levantamento do DRG L quatro e L cinco. Corte o mais próximo possível do corpo do DRG. Colete um total de 16 DRGs de quatro animais e coloque-os em HBSS gelados.

Centrifugue brevemente o DRG, adicione 500 microlitros de formaldeído a 1% e incube a amostra por 30 minutos. A 37 graus Celsius, adicione 125 milimolares de glicina para interromper a fixação e incube por cinco minutos em temperatura ambiente. Após uma breve centrífuga, aspire o tampão e lave o tecido duas vezes com 500 microlitros de PBS gelado mais coquetel de inibidores de protease.

Em seguida, aspire o PBS e adicione 400 microlitros de lise SDS, tampone e interrompa o tecido com aproximadamente 30 golpes de um micropilão. Em seguida, sonicar a cromatina com oito pulsos de dez segundos a 70% de saída. Sugere-se que você analise uma amostra para confirmar a fragmentação do DNA em comprimentos de aproximadamente 200 a 1000 pares de bases.

Divida a amostra de cromatina cisalhada igualmente em um novo tubo. Para cada reação de imunoprecipitação a ser realizada, aumente o volume de cada tubo para 500 microlitros com tampão de cavacos mais coquetel de inibidores de protease. Em seguida, remova cinco microlitros de sua amostra diluída e transfira para um novo tubo.

Esta é a sua amostra de 1% de entrada e será armazenada a menos 20 graus Celsius até que seja necessária. Posterior. Adicione anticorpos ou controle normal de IgG a cada tubo e incube a quatro graus Celsius com rotação durante a noite. No dia seguinte.

Imuno precipitar o complexo adicionando 30 microlitros de grânulos magnéticos de proteína G e incubando por duas horas a quatro graus Celsius com rotação. Em seguida, coloque o tubo em um rack magnético para puxar para baixo o complexo de esferas de cromatina ligado. Quando a solução estiver límpida, remova cuidadosamente o sobrenadante, lave as esferas três vezes com um mililitro de tampão com baixo teor de sal com uma incubação de três a cinco minutos a quatro graus Celsius com rotação para cada lavagem.

Em seguida, lave uma vez com um mililitro de tampão com alto teor de sal. Neste ponto, recupere a amostra de entrada de 1% de menos 20 graus Celsius e adicione 150 microlitros de tampão de eluição de chips. Deixe o tubo de lado em temperatura ambiente para ser usado posteriormente.

Voltando às amostras IP, adicione 150 microlitros de um tampão de eluição de chip x a cada tubo. Incube as amostras a 65 graus Celsius por 30 minutos com vórtice suave para eluir a cromatina das contas. Puxe para baixo as esferas do rack magnético e transfira cuidadosamente a cromatina de eluição em novos tubos para todos os tubos, incluindo as amostras de entrada.

Adicione 200 milimolares de cloreto de sódio e 40 microgramas por reação de protease K e incube a 65 graus Celsius por duas horas após a incubação, recupere o DNA usando procedimentos padrão para análise posterior aqui. São mostrados os resultados semiquantitativos da reação em cadeia da polimerase do tecido DRG após lesão do nervo ciático. As pistas um e dois mostram o sinal de PCR das amostras de entrada.

O sinal de PCR na pista quatro mostra que o P 53 acetilado se liga à região promotora proximal da lacuna 43 somente após a lesão do nervo ciático. Nenhum sinal de PCR está presente quando o animal recebe uma lesão simulada como visto na pista três e ao usar soro IgG normal mostrado nas pistas cinco e seis. A PCR de controle do mesmo tecido DRG mostra que o P 53 acetilado não se liga a uma região de controle do DNA localizada na região não traduzida de três primos do gene gap 43.

Ao tentar este procedimento, é importante lembrar três etapas críticas para o sucesso. Comece com uma quantidade suficiente de tecido, garanta a fragmentação e solubilização eficientes do complexo de proteínas de DNA e escolha um bom anticorpo de imunoprecipitação para sua proteína de interesse.