Método de aglutinação de partículas de Identificação Poliovirus

O objetivo geral do procedimento a seguir é identificar rapidamente um isolado do vírus da poliomielite usando um protocolo simples. Para este ensaio, usamos partículas de gelatina sensibilizadas revestidas com moléculas quiméricas contendo o domínio extracelular do receptor de poliovírus humano conectado a IgG dois fc. Como essas partículas têm uma afinidade uniforme por todos os sorotipos de isolados de poliovírus, a aglutinação das partículas ocorre após a incubação com amostras contendo qualquer poliovírus humano.

No entanto, se anticorpos capazes de reconhecer o isolamento viral específico da amostra estiverem presentes, a neutralização ocorrer e evitar a aglutinação usando este sistema experimental, a identificação rápida de isolados de poliovírus pode ser realizada em uma reação de etapa única. A principal vantagem desta técnica de vaso existente, como o teste de neutralização convencional, é a simplicidade do procedimento e interpretação do SIM, visando reduzir a mão de obra e agilizar a necessidade e encurtar o tempo para os resultados. Para reconstituir os anticorpos anti-PV um, PV dois e PV três, adicione 0,5 mililitros de água a cada frasco.

Em seguida, transfira cada solução de anticorpos para tubos separados contendo 4,5 mililitros de meios de manutenção. Alguns lotes de anticorpos anti-PV são fornecidos na forma reconstituída para esses lotes de anticorpos anti-PV. Não é necessária a adição de água para reconstituição.

Em seguida, prepare misturas individuais de solução combinada de anticorpos com um volume final de 3,6 mililitros em tubos recém-marcados. Por exemplo, misture 1,8 mililitros de anti-PV com 1,8 mililitros de anti-PV dois. Para preparar uma combinação anti-PV um mais PV dois, repita-a para cada combinação possível de pares e também prepare uma solução contendo todos os três tipos de anticorpos misturando 1,2 mililitros de cada anti-soro.

Uma vez que as quatro misturas tenham sido feitas a 720 microlitros de FCS para cada solução de anticorpo. Isso ajudará a reduzir a aglutinação inespecífica de partículas de gelatina por anticorpos durante o ensaio. Os pools de anticorpos podem ser armazenados a menos 20 graus Celsius até que sejam usados no ensaio de aglutinação.

Neste ensaio, usamos partículas de gelatina liofilizadas que foram revestidas com os domínios extracelulares do receptor de poliovírus humano e IgG dois domínios FC de camundongo. Certifique-se de usar um único lote de partículas e não lotes diferentes em um experimento para garantir a consistência da imagem de aglutinação para reconstituir as partículas em 1,5 mililitros de tampão de reconstituição para cada frasco. Bata suavemente para misturar bem.

As partículas reconstituídas podem ser armazenadas a quatro graus Celsius por até duas semanas. Primeiro, projete seu experimento em uma placa de microtitulação de 96 poços. Para cada amostra, o poço número um conterá apenas vírus.

Os poços de número dois a cinco conterão o vírus mais uma das quatro soluções mistas de anticorpos. Certifique-se de guardar um poço para um controle negativo contendo apenas meios sem vírus ou anticorpos. Uma vez que a placa tenha sido montada, adicione 12 microlitros da solução de anticorpo correta a cada poço das linhas dois a cinco e 12 microlitros de crescimento.

Médio apenas para o vírus, poços na linha um e para o poço de controle negativo na linha seis. Em seguida, adicione 12 microlitros de amostra de vírus nas primeiras cinco fileiras e 12 microlitros de meio de crescimento ao poço de controle negativo na fileira seis. Uma vez que os anticorpos e o vírus tenham sido plaqueados, resus, suspenda as partículas de gelatina reconstituídas batendo-as suavemente e adicione imediatamente 25 microlitros de partículas por poço a todos os poços.

É importante não deixar as partículas assentarem antes de transferi-las para a placa para obter quantidades iguais de partículas em cada uma. Bem, coloque a placa de ensaio em uma batedeira e misture por 30 segundos. Em seguida, coloque a placa em uma folha de papel branco e incube a placa em temperatura ambiente por duas horas para permitir que ocorra uma aglutinação.

É importante não mover a placa em nenhum momento durante ou após a incubação, pois a aglutinação formada é instável. Uma vez que a reação tenha ocorrido, tire várias fotos da placa nas quais a qualidade da aglutinação em cada poço possa ser apreciada. Em poços onde a aglutinação não ocorreu, como mostrado aqui à esquerda, partículas de gelatina coloridas precipitarão no fundo do poço em poços onde ocorreu aglutinação.

Devido à interação entre o vírus e o pvr, IgG duas partículas de gelatina revestidas com A, um padrão de cor difusa é visível como mostrado no centro. Neste experimento, testamos a capacidade das soluções de vírus, PV um, dois e três, de induzir glu na presença do anticorpo. As combinações indicadas como mostrado aqui na ausência de vírus ou anticorpos, não ocorre aglutinação e as partículas de gelatina precipitam em contraste no vírus que contém bem, mas sem anticorpos.

A aglutinação ocorreu devido à interação do vírus. Com o PVR IgG duas partículas de gelatina cobertas A nos poços experimentais, uma abundância de vírus é evitada em qualquer poço contendo anticorpos que neutralizam especificamente esse vírus. Por exemplo, uma nação excedente de poliovírus tipo um é evitada em poços contendo anticorpos anti-PV um, mas não em poços contendo apenas anticorpos anti-PV dois e anti-PV três.

O mesmo vale para os tipos dois e três do poliovírus. Enquanto domina, essa técnica pode ser feita em menos de três horas se for executada corretamente.