Name: Método de aglutinação de partículas de Identificação Poliovirus (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-04-20T14:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 6 s
Description: Aprenda o método de aglutinação de partículas para identificação rápida do poliovírus usando partículas de gelatina sensibilizadas. Esta técnica simplifica o diagnóstico virológico e reduz o tempo de análise laboratorial.

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Somos gratos a Junko Wada por sua excelente assistência técnica. Somos gratos ao Prof Akio Nomoto por gentilmente fornecer um vetor de expressão de baculovírus para PVR-IgG2a. Este estudo foi apoiado em parte pela Grants-in-Aid para a Promoção da Erradicação da Pólio e Pesquisa Emergentes e Re-emergentes Doenças Infecciosas do Ministério da Saúde, Trabalho e Bem-Estar.

1. Preparação de meio de manutenção (MM) e de crescimento médio (GM) Para a preparação de MM e GM, consulte um manual de laboratório Poliomielite da OMS 1. Meio modificado Dulbecco Águia (DMEM) suplementado com 2% de soro fetal bovino (FCS) e 10% FCS podem ser utilizados como substitutos de MM e GM, respectivamente. 2. Preparação de anticorpos anti-PV <ol><li> Anticorpos anti-PV reconstituir (RIVM PV digitando anti-soro) por adição de água (0,5 mL por frasco) para cada frasco de anticorpo anti-PV (tipo 1, 2 ou 3). Adicionar este soluções de anticorpos reconstituída (0,5 mL cada) para 4,5 mL de MM em separado tubos rotulados. Nota: Alguns lotes de anti-PV anticorpos são fornecidos como forma reconstituída (0,5 mL por frasco). Para o lote de tais anticorpos anti-PV, além de água para a reconstituição não é necessário. </li><li> Mix volume igual de anticorpos anti-PV reconstituído. Para anti-PV1 +2, 2 +3, ou 3 +1: Misture 1,8 mL de cada anticorpo reconstituída (1,8 mL + 1,8 mL = 3,6 mL para cada mistura). Para anti-PV1 +2 +3: Misture 1,2 mL de cada anticorpo reconstituída (1,2 mL + 1,2 mL + 1,2 mL mL = 3,6). Nota: As amostras de PV poderia conter uma mistura de diferentes sorotipos do PV. Para identificar o sorotipo único do PV em amostras com mistura de PVs, piscinas de anticorpos anti-PV (isto é, 1 +2, 2 +3, 3 +1, 1 +2 +3) é necessário. </li><li> Adicione 1 / 5 do volume de FCS (0,72 mL) para cada anti-PV (1 +2, 2 +3, 3 +1, ou 1 +2 +3) de anticorpos (3,6 mL cada) (final FCS 18,2%). Nota: A adição de FCS é para a redução das não-específicas aglutinação de partículas de gelatina causada por anticorpos. </li><li> Manter o piscinas de anticorpos a -20 ° C até o uso no ensaio PA. </li></ol> 3. Reconstituição de partículas de gelatina sensibilizadas <ol><li> Adicione 1,5 mL de tampão de reconstituição incluído no kit para um frasco de partículas de gelatina sensibilizadas (fornecido como pó liofilizado). </li><li> Misture bem tocando suave </li><li> Mantenha a partícula reconstituído sensibilizados a 4 ° C. De partículas de gelatina reconstituída pode ser ativo, pelo menos, duas semanas mantido a 4 ° C, mas deve ser preparado antes do ensaio. </li></ol> Nota importante: Não misture muito diferentes de partículas de gelatina sensibilizadas, porque a imagem não de aglutinação de partículas de gelatina sensibilizadas poderia ser diferente pela grande quantidade de partículas. Para cada experimento, um único lote de partículas de gelatina sensibilizadas deve ser usado. 4. PA ensaio para identificação PV <ol><li> Prepare uma placa de micro titulação. Para a identificação de uma amostra de vírus, precisamos de 5 poços +, pelo menos, um controle negativo (partículas sensibilizadas sem vírus e de anticorpos, bem # 6 em abaixo. See No controle de vírus e anticorpos no Exemplo). Número total de poços é de 5 x + amostras controle de pelo menos um no ensaio. Nota importante: Por favor, tome pelo menos um controle Nenhum vírus e anticorpos no ensaio. Um frasco de partículas é de aproximadamente sensibilizados para a identificação de 10 amostras de vírus. </li><li> Adicione 12 mL / poço de anticorpo anti-PV ou GM para a placa micro-titulação. O arranjo do prato é a seguinte (Veja também Exemplo abaixo). Em amostras sem anticorpos (bem # 1 e 6), adicionar 12 mL da GM, em vez de anti-PV anticorpos. Nota importante: Se muitas amostras PV deve ser testado neste ensaio, pipeta multicanal ou dispensador seria útil para esta etapa. <table border="1"><tbody><tr><td> Bem # 1 </td><td> Bem # 2 </td><td> Bem # 3 </td><td> Bem # 4 </td><td> Bem # 5 </td><td> Bem # 6 </td></tr><tr><td> GM </td><td> anti-P1 +2 +3 </td><td> anti-P1 +2 </td><td> anti-P2 3 </td><td> ani P1-3 </td><td> GM </td></tr></tbody></table></li><li> Adicione 12 mL / poço de amostra de vírus. Em uma amostra sem vírus (bem # 6), adicionar 12 mL da GM, em vez de solução de vírus. Nota: a amostra do vírus é sobrenadante de cultura de células infectadas, células normalmente L20B ou células RD. Nota importante: Se muitas amostras PV deve ser testado neste ensaio, pipeta multicanal seria útil para esta etapa. <table border="1"><tbody><tr><td> Bem # 1 </td><td> Bem # 2 </td><td> Bem # 3 </td><td> Bem # 4 </td><td> Bem # 5 </td><td> Bem # 6 </td></tr><tr><td> amostra de vírus </td><td> amostra de vírus </td><td> amostra de vírus </td><td> amostra de vírus </td><td> amostra de vírus </td><td> GM </td></tr></tbody></table></li><li> Tome solução reconstituída de partículas sensibilizadas a partir de 4 ° C até a temperatura ambiente e bata suavemente completamente suspender as partículas. Nota importante: Após a suspensão completa das partículas agitando ligeiramente, as partículas devem ser adicionados imediatamente para as placas antes da precipitação de partículas suspensaste e formam solução não-homogênea. </li><li> Adicionar 25 mL / poço de partículas sensibilizadas para todos os poços. Nota importante: Após a adição de partículas sensibilizadas, a placa deve ser imediatamente submetido a placa de mistura para iniciar a reação uniforme das amostras. Portanto, a adição de partículas sensibilizadas deve ser realizada usando dispenser para minimizar um intervalo de tempo entre as amostras na placa. </li><li> Coloque a placa de micro-titulação em um misturador de prato e misture a placa por 30 segundos. </li><li> Coloque a placa de micro-titulação em papel branco (para facilidade de observação visual) em uma mesa à temperatura ambiente (15 ~ 30 ° C) por 2 h. Nota importante: Não mova a placa durante e após a reação para a observação dos resultados e tirar fotos. A aglutinação formado não é estável e facilmente perturbadas movendo as placas. </li><li> Tirar fotos do prato. Nota importante: Vista parcial das fotos não poderia dar dados suficientes para posterior exame e análise dos resultados para a interpretação. Várias fotos devem ser tomados para cobrir todos os poços das placas com foco na imagem de aglutinação dos poços. </li></ol> 5. Interpretação dos resultados <ol><li> Identificação de poços positivos e negativos. Compare a aglutinação nas amostras com o de Sem controle de vírus e de anticorpos (precipitação de partículas de gelatina, a aglutinação não) (Figura 1 e 2). Imagens de aglutinação que são claramente distinguidos das Nenhum vírus e sem controle de anticorpos (não-aglutinação, controle negativo) deve ser considerada positiva, e as imagens de aglutinação que são semelhantes ao controle negativo deve ser julgado como negativo. Exemplos que mostram aglutinação clara, mas apenas parcial pode ser considerada positiva, mas gravar como "positivo (aglutinação parcial). </li><li> Identificação do PV. Interpretar os resultados com base em poços positivos e negativos com anti-PV anticorpos para identificar os sorotipos PV. Princípio da interpretação do resultado é semelhante ao do teste de neutralização em sistema de cultura de células (por exemplo, positivo para anticorpos anti-P1 2 indica que a amostra contém o tipo 3 PV). </li></ol> 6. Resultados representante Resultado representativo da PA ensaio PV identificação é mostrado na Figura 1. Todas as cepas PV formado aglutinação de partículas de gelatina sensibilizadas (Nenhum anticorpos amostras). Na presença de correspondentes anti-PV anticorpos, precipitação de partículas de gelatina (aglutinação não) semelhante ao Nenhum vírus e sem controle de anticorpos (controle negativo) foi observada (por exemplo, PV1 (Sabin), na presença de anti-P1 +2 ou anti-P3 uma anticorpos). <img src="/files/ftp_upload/2824/2824fig1.jpg" alt="Figura 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 1"> Figura 1. Identificação de PV por ensaio PA. Soluções Virus de PV1 (Sabin), PV2 (Sabin), e PV3 (Sabin) (títulos de vírus de 1,2 x 10 8 CCID 50 / 12 mL, 8,2 x 10 7 DICC mL 50/12, e 3,5 x 10 7 DICC 50 / 12 mL, respectivamente) foram utilizados para a identificação através do teste de PA. Nenhum vírus e sem controle de anticorpos mostraram precipitação de partículas de gelatina (não-aglutinação controle negativo). <img src="/files/ftp_upload/2824/2824fig2.jpg" alt="Figura 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 2"> Figura 2. Interpretação dos poços de positivo e negativo. Soluções Virus de PV1 (Sabin), PV2 (Sabin), e PV3 (Sabin) (títulos de vírus de 2,4 x 8 CCID 10 L 50/25, 1,7 x 10 8 mL CCID 50 / 25, e 7,3 x 10 7 DICC mL 50/25, respectivamente) foram diluídos 1 / 20 a 1 / 320, e em seguida 25 mL de amostras diluídas foram examinados por ensaio PA sem anti-PV anticorpos.

<ol><li>World Health Organization. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22Polio+Laboratory+Manual+%284th+edition%29+WHO%2FIVB%2F04.10%22">Polio Laboratory Manual (4th edition) WHO/IVB/04.10</a>. , 4th Edition, World Health Organization. (2004).</li>
<li>Arita, M., Masujima, S., Wakita, T., Shimizu, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+a+particle+agglutination+method+with+soluble+virus+receptor+for+identification+of+poliovirus%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Clin.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Development of a particle agglutination method with soluble virus receptor for identification of poliovirus.</a> J. Clin. Microbiol. 48, 2698-2702 (2010).</li>
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<li>Koike, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+poliovirus+receptor+protein+is+produced+both+as+membrane-bound+and+secreted+forms%5BTitle%5D)+AND+%22Embo+J.+9%22%5BJournal%5D)">The poliovirus receptor protein is produced both as membrane-bound and secreted forms.</a> Embo J. 9. , 3217-3224 (1990).</li>
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<li>Pipkin, P. A., Wood, D. J., Racaniello, V. R., Minor, P. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterisation+of+L+cells+expressing+the+human+poliovirus+receptor+for+the+specific+detection+of+polioviruses+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Virol.+Methods%22%5BJournal%5D)">Characterisation of L cells expressing the human poliovirus receptor for the specific detection of polioviruses in vitro.</a> J. Virol. Methods. 41, 333-340 (1993).</li>
<li>Avoort, H. G. vander <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparative+study+of+five+methods+for+intratypic+differentiation+of+polioviruses%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Clin.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Comparative study of five methods for intratypic differentiation of polioviruses.</a> J. Clin. Microbiol. 33, 2562-2566 (1995).</li>
<li>Kilpatrick, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+group-%2C+serotype-%2C+and+vaccine+strain-specific+identification+of+poliovirus+isolates+by+real-time+reverse+transcription-PCR+using+degenerate+primers+and+probes+containing+deoxyinosine+residues%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Clin.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Rapid group-, serotype-, and vaccine strain-specific identification of poliovirus isolates by real-time reverse transcription-PCR using degenerate primers and probes containing deoxyinosine residues.</a> J. Clin. Microbiol. 47, 1939-1941 (2009).</li>
</ol>

Souji Masujima é um funcionário da New Product Design Department, Fujirebio Inc.

O único ponto deste ensaio PA é a utilização da molécula de PVR em vez de anticorpos anti-PV para a detecção de PV 2. Isso permite uma interação específica das partículas sensibilizadas gelatina com PV com uma afinidade uniforme para todos os três sorotipos do PV 3-6. Nós usamos uma forma immunoadhesin de PVR (PVR-IgG2a) para a sensibilização das partículas de gelatina, porque as formas monoméricas de PVR têm apenas afinidades moderada para o único local de ligação do vírion (constante de dissociação de 10 <s...

<table border="1"><tbody><tr><th> Nome do reagente </th><th> Companhia </th><th> Número de catálogo </th><th> Comentários </th></tr><tr><td> Sensibilizadas-partículas de gelatina </td><td> Fujirebio Inc. </td><td></td><td> Kit de teste </td></tr><tr><td> Buffer de reconstituição </td><td> Fujirebio Inc. </td><td></td><td> Kit de teste </td></tr><tr><td> Placa de microtitulação </td><td> Fujirebio Inc. </td><td></td><td> Kit de teste </td></tr><tr><td> Anti-PV anticorpos </td><td> RIVM </td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

método de aglutinação de partículas de identificação poliovirus

Particle Agglutination Method for Poliovirus Identification

Do Global de Erradicação da Pólio, diagnóstico laboratorial desempenha um papel crítico por isolar e identificar PV a partir de amostras de fezes de paralisia flácida aguda (PFA) casos. Na Organização Mundial de Saúde (OMS) Global Polio Laboratory Network, PV isolamento e identificação estão sendo realizadas por meio do sistema de cultura celular e em tempo real de RT-PCR, respectivamente. Na era pós-erradicação do PV, procedimentos de identificação simples e rápido seria útil para rápida confirmação de casos de pólio nos laboratórios nacionais. No presente estudo, vamos mostrar o procedimento do romance de ensaio PA desenvolvidos para identificação PV. Este ensaio PA utiliza interação de PV receptor molécula (PVR) e virion que é afinidade específica e uniforme para todos os sorotipos do PV. O procedimento é simples (um procedimento passo em placas de reação) e rápido (resultados podem ser obtidos dentro de 2 h de reação), eo resultado é visualmente observados (observação de aglutinação de partículas de gelatina).

A recentemente desenvolvida romance de partículas de aglutinação do ensaio (PA) utilizando molécula receptora vírus permitiu uma identificação rápida e fácil de poliovírus (PV). Neste artigo, vamos mostrar o procedimento para o ensaio PA para identificação PV.

Método de aglutinação de partículas de Identificação Poliovirus

Na Iniciativa Global de Erradicação da Pólio, o diagnóstico laboratorial desempenha um papel fundamental ao isolar e identificar o PV a partir de amostras de fezes de casos agudos...

O objetivo geral do procedimento a seguir é identificar rapidamente isolados do vírus da poliomielite utilizando um protocolo simples. Para este ensaio, utilizamos partículas de gelatina sensibilizadas revestidas com moléculas quiméricas contendo o domínio extracelular do receptor humano do vírus da poliomielite ligado ao fc da IgG2. Como essas partículas possuem afinidade uniforme por todos os sorotipos de isolados do vírus da poliomielite, ocorre aglutinação das partículas após incubação com amostras contendo qualquer vírus da poliomielite humano.No entanto, se estiverem presentes anticorpos capazes de reconhecer o isolado viral específico da amostra, ocorre neutralização e impede-se a aglutinação; utilizando este sistema experimental, a identificação rápida de isolados de poliovírus pode ser realizada em uma única etapa reacional. A principal vantagem desta técnica em relação aos métodos existentes, como o teste convencional de neutralização, é a simplicidade da SIM no procedimento e na interpretação, com o objetivo de reduzir a mão de obra necessária e acelerar o tempo para obtenção dos resultados. Para reconstituir os anticorpos anti PV um, PV dois e PV três, adicione 0,5 mili

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Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Imunologia e Infecção

O genoma do vírus influenza A é composto por oito complexos separada de RNA e proteínas, denominadas complexos de ribonucleoproteínas viral (vRNPs). Este artigo descreve a purificação gradiente glicerol e transmissão de visualização microscopia eletrônica de influenza A vRNPs.

Purificação e Visualização de Influenza A complexos de ribonucleoproteínas Viral

Genomics vírus individuais (SVG) é um método para isolar e amplificar os genomas de virons individuais. Suspensões virais de uma assembléia mista são classificados usando citometria de fluxo em uma lâmina de microscópio com poços discretos contendo agarose, capturando assim, o virion e reduzindo corte genoma durante o processamento downstream. Amplificação do genoma inteiro é conseguida usando vários amplificação por deslocamento (MDA), resultando em material genómico que é adequado para a...

Isolamento e Análise do Genoma do vírus da única usando &#39;Genomics vírus simples&#39;

Neste artigo, um simples, quantitativa, na fase líquida ensaio de captura de afinidade é apresentado. É uma técnica fiável baseada na interacção entre as esferas magnéticas e proteínas marcadas (por exemplo, nanocorpos), por um lado ea afinidade entre a proteína marcada e uma proteína, segundo rotulada (por exemplo, poliovírus) sobre o outro.

A fase líquida ensaio de captura de afinidade usando pérolas magnéticas para estudar interação proteína-proteína: O Exemplo Poliovírus Nanobody-

Neste vídeo, demonstramos um ensaio de imunoprecipitação, chamado ensaio de captura de VLP, para isolar partículas semelhantes a vírus que exibem antígenos, ou VLPs, de uma amostra. O antígeno se liga a anticorpos específicos ligados a esferas magnéticas, formando um complexo antígeno-anticorpo imobilizado que é posteriormente separado e armazenado para análise posterior.

O ensaio de captura de partículas semelhantes a vírus: um método para isolar VLPs exibindo antígenos de uma amostra usando esferas magnéticas conjugadas com anticorpos neutralizantes

Este vídeo demonstra o ensaio de microneutralização baseado em imagem para analisar as relações antigênicas entre os vírus influenza A e B. Ele fornece uma maneira quantitativa e visual de avaliar a eficácia de anticorpos ou outros tratamentos na prevenção da infecção viral.

Analisando a relação antigênica entre vírus usando um ensaio de microneutralização baseado em imagem

Usando microscopia de força atômica em combinação com a tecnologia de biopanning, criamos um sistema de biopanning negativo e positivo para adquirir anticorpos contra variantes proteicas específicas da doença presentes em qualquer material biológico, mesmo em baixas concentrações.  Obtivemos sucesso na obtenção de anticorpos para variantes da proteína TDP-43 envolvidas na Esclerose Lateral Amiotrófica.

Novel Microscopia de Força Atômica bioprospecção Based para Isolamento de Morfologia reagentes específicos contra TDP-43 variantes em Esclerose Lateral Amiotrófica

Fornecemos uma nova estratégia para isolar compartimentos de replicação viral (RC) de células humanas infectadas com adenovírus (Ad). Essa abordagem representa um sistema livre de células que pode ajudar a elucidar os mecanismos moleculares que regulam a replicação e expressão do genoma viral, bem como a regulação das interações viral-hospedeiro estabelecidas no RC.

Isolamento de Frações Sub-nuclear Viral Replication Compartimento enriquecidas de Adenovirus-infectados células normais Humanos

Usando uma estratégia de microarray de glicano impresso, um ensaio convencional de placa de 96 poços foi miniaturizado para análise da avidez e especificidade da hemaglutinina do vírus influenza A para receptores contendo ácido siálico.

A Miniaturized Glycan Microarray Ensaio para a Avaliação de avidez e especificidade do Hemaglutininas vírus da gripe A

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Micro-aspiração de célula única como uma estratégia alternativa à classificação celular ativada por fluorescência para separação de mistura de vírus gigante

Aqui, apresentamos um protocolo para detectar epítopos de neutralização em partículas semelhantes a vírus que exibem antígenos (VLPs). A imunoprecipitação do vírus da imunodeficiência humana (HIV) derivada de VLPs é realizada usando anticorpos monoclonais específicos de glicoproteínas de envelope acoplados a contas magnéticas conjugadas por G. Os VLPs capturados são posteriormente submetidos à análise de SDS-PAGE e western blot empregando anticorpos específicos da proteína do núcleo viral.

Detecção de epítopos sensíveis à neutralização em antígenos exibidos em vacinas baseadas em partículas semelhantes a vírus (VLP) usando um ensaio de captura

Este manuscrito descreve um protocolo detalhado para a geração e purificação de vetores virais adeno-associados usando um método otimizado de cromatografia de afinidade à base de heparina. Apresenta uma abordagem simples, escalável e econômica, eliminando a necessidade de ultracentrifugação. Os vetores resultantes exibem alta pureza e atividade biológica, comprovando seu valor em estudos pré-clínicos.

Isolamento de vetores virais adeno-associados por meio de um protocolo de cromatografia de afinidade de heparina de etapa única e semiautomatizada

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